RU2123860C1

RU2123860C1 - Affine sorbent for removal of tumor necrosis factor and method of its preparing

Info

Publication number: RU2123860C1
Application number: RU95110637/14A
Authority: RU
Inventors: И.Э. Бондарев; В.В. Дорофейков; А.Б. Жебрун; С.И. Кузнецов; Л.В. Резник; И.С. Фрейдлин; Т.С. Фрейдлин; Э.К. Цыбулькин; И.Г. Щербак
Original assignee: Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Пастера; Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им.акад.И.П.Павлова
Priority date: 1995-06-28
Filing date: 1995-06-28
Publication date: 1998-12-27

Abstract

FIELD: medicine, sorbents. SUBSTANCE: affine sorbent has a carrier containing an immobilized human α₂--macroglobulin. Method of a sorbent preparing involves immobilization of human α₂--macroglobulin at pH 7.0-8.2 followed by its treatment with thio-ester loop modifying agent. The latter is monomethylamine hydrochloride or proteolytic enzyme plasmin of human blood plasma. Invention can be used for development of new approaches to treatment of patients with sicknesses caused by massive inflow of cytokines in blood, for example, as a result of septic shock. EFFECT: improved method of sorbent preparing, enhanced effectiveness of sorbent. 4 cl, 4 ex

Description

Изобретение относится к области медицины и может найти применение при разработке новых подходов к лечению заболеваний, вызванных массивным поступлением цитокинов в кровь, например септического шока. The invention relates to medicine and may find application in the development of new approaches to the treatment of diseases caused by massive influx of cytokines into the blood, for example, septic shock.

Наиболее близкими по сущности к предлагаемым сорбенту для удаления фактора некроза опухоли и способу его получения являются аффинный сорбент и способ получения сорбента, описанные в работе [1]. The closest in essence to the proposed sorbent for removing the tumor necrosis factor and the method for its production are the affinity sorbent and the method for producing the sorbent described in [1].

Аффинный сорбент содержит носитель, на который иммобилизованы моноклональные антитела к туморнекротизирующему фактору (TNF). The affinity sorbent contains a carrier onto which monoclonal antibodies to the tumor necrotizing factor (TNF) are immobilized.

Способ получения аффинного сорбента предусматривает иммобилизацию протеина на носитель. В качестве протеина применены моноклональные антитела к TNF. A method of obtaining an affinity sorbent provides for the immobilization of protein on a carrier. Monoclonal antibodies to TNF were used as the protein.

Моноклональные антитела представляют собой белок, чужеродный для организма человека. Эффект "подтекания" моноклональных антител с носителя в ходе процедуры удаления фактора некроза опухоли может приводить к сенсибилизации и ряду других нежелательных эффектов при лечебных процедурах. Кроме того, высокая стоимость и сложность получения моноклональных антител к TNF делает практически невозможным использование данного сорбента в клинических условиях. Monoclonal antibodies are a protein foreign to the human body. The effect of "leakage" of monoclonal antibodies from the carrier during the procedure of removal of tumor necrosis factor may lead to sensitization and a number of other undesirable effects during treatment procedures. In addition, the high cost and complexity of obtaining monoclonal antibodies to TNF makes it virtually impossible to use this sorbent in a clinical setting.

Изобретение направлено на усовершенствование аффинного сорбента для удаления фактора некроза опухоли и разработку способа его получения. При этом обеспечена возможность клинического применения сорбента за счет исключения влияния попадания чужеродного для организма белка в кровь. The invention is aimed at improving the affinity sorbent for removing tumor necrosis factor and developing a method for its production. At the same time, the clinical use of the sorbent is ensured by eliminating the influence of the ingress of a protein alien to the body into the blood.

Фактор некроза опухоли (туморнекритизирующий фактор) является одним из эндогенных пирогенов, может вызывать гипотензию, существенные метаболические сдвиги (повышение углеводного обмена, истощение энергетических запасов, потерю адипоцитами липидов). Механизмами непосредственного действия TNF является также повышение экспрессии адгезивных молекул на поверхности эндотелия для лейкоцитов крови, в частности, для гранулоцитов, с чем может быть связано развитие гранулоцитопении. Кроме того, TNF опосредует синдромы "дырявых" капилляров и диссеминированного внутрисосудистого свертывания. Tumor necrosis factor (tumor-criticalizing factor) is one of the endogenous pyrogens, it can cause hypotension, significant metabolic changes (increased carbohydrate metabolism, depletion of energy reserves, loss of lipids by adipocytes). The mechanisms of direct action of TNF is also an increase in the expression of adhesive molecules on the surface of the endothelium for blood leukocytes, in particular for granulocytes, with which the development of granulocytopenia can be associated. In addition, TNF mediates leaky capillary syndromes and disseminated intravascular coagulation.

Сущность изобретений сводится к следующему. The essence of the invention is as follows.

Аффинный сорбент для удаления фактора некроза опухоли представляет носитель, на который иммобилизован α₂ - макроглобулин человека.The affinity sorbent for removal of tumor necrosis factor is a carrier onto which α ₂ - human macroglobulin is immobilized.

Способ получения аффинного сорбента для удаления фактора некроза опухоли предусматривает иммобилизацию протеина на носитель. В качестве протеина используют α₂ -макроглобулин человека, который иммобилизуют при pH 7,0...8,2, а затем обрабатывают модификатором тиол-эфирной петли.A method of obtaining an affinity sorbent for removing tumor necrosis factor involves the immobilization of protein on a carrier. As a protein, human α ₂ -macroglobulin is used, which is immobilized at a pH of 7.0 ... 8.2, and then treated with a thiol ether loop modifier.

Основной задачей при "посадке" α₂ -макроглобулина на носитель являлось получение препарата в нативной форме, что в дальнейшем позволило модифицировать белок, делая его пригодным для удаления (сорбции) TNF-α из растворов.The main task in the "landing" of α ₂ -macroglobulin on the carrier was to obtain the drug in its native form, which subsequently made it possible to modify the protein, making it suitable for removal (sorption) of TNF-α from solutions.

Результаты наших экспериментов показали, что главным, решающим фактором при "посадке" является выбор pH-среды, при котором идет "пришивка" α₂ -макроглобулина к носителю. При pH ниже 7,0 заметно снижается количество (процент "пришивки") сорбируемого α₂ -макроглобулина, а при pH ниже 6,0 происходит необратимая денатурация белка.The results of our experiments showed that the main, decisive factor in the "landing" is the choice of pH-medium, in which there is an "attachment" of α ₂ -macroglobulin to the carrier. At a pH below 7.0, the amount (percentage of “sewing”) of sorbed α ₂ -macroglobulin is markedly reduced, and at a pH below 6.0, protein is irreversibly denatured.

При использовании буферов с pH выше 8,2 несмотря на высокой процент "сшивки" (в растворе остается менее 5% от исходного количества белка) происходят такие изменения конформации белка, которые существенно изменяют его свойства. Так, например такие препараты иммобилизованного α₂ -макроглобулина не способны связывать протеолитические ферменты. Эффективность использования этих препаратов для дальнейшей модификации и удаления TNF составляет менее 10% от оптимального, полученного при pH буферов 7,0...8,2. Эффективность "пришивки" при указанных значениях pH в среднем составляла 96±0,8%, что позволяет считать указанные выше значения pH оптимальными.When using buffers with a pH above 8.2, despite a high percentage of “crosslinking” (less than 5% of the initial amount of protein remains in the solution), such changes in the conformation of the protein occur that significantly change its properties. So, for example, such preparations of immobilized α ₂ -macroglobulin are not able to bind proteolytic enzymes. The effectiveness of using these drugs for further modification and removal of TNF is less than 10% of the optimal obtained at pH buffers 7.0 ... 8.2. The effectiveness of "sewing" at the indicated pH values averaged 96 ± 0.8%, which allows us to consider the above pH values to be optimal.

После иммобилизации α₂ -макроглобулин человека обрабатывают модификатором тиол-эфирной петли.After immobilization, the α ₂ human macroglobulin is treated with a thiol ether loop modifier.

Модификатором тиол-эфирной петли может служить, например химический агент, выбранный из группы первичных аминов, или протеолитический фермент, способный связываться с α₂ -макроглобулином.A thiol ether loop modifier may be, for example, a chemical agent selected from the group of primary amines, or a proteolytic enzyme capable of binding to α ₂ macroglobulin.

При обработке α₂ -макроглобулина, сорбированного на носителе указанными агентами, происходит разрыв тиол-эфирной петли в молекуле α₂ -макроглобулина, что приводит к его переходу в F-форму (Fost-форму), и он приобретает способность к связыванию TNF.When processing α ₂ -macroglobulin adsorbed on a carrier by the indicated agents, a thiol ether loop breaks in the α ₂ -macroglobulin molecule, which leads to its transition to the F form (Fost form), and it acquires the ability to bind TNF.

Удаление TNF с помощью иммобилизованного α₂ -макроглобулина представляется возможным при достаточной силе взаимодействия между ними.Removal of TNF using immobilized α ₂ -macroglobulin is possible with sufficient strength of interaction between them.

Изобретение реализуется следующим образом. The invention is implemented as follows.

Пример 1. Для конструирования сорбента использовали сефарозу 4B CL (Pnaracia, Швеция), которую активировали бромцианом (Fluka, ФРГ), как указано в работе [2]. Example 1. For the construction of the sorbent used sepharose 4B CL (Pnaracia, Sweden), which was activated with cyanogen bromide (Fluka, Germany), as indicated in [2].

В качестве аффинного лиганда использовали препарат человеческого α₂ -макроглобулина с концентрацией 1,5 мг/мл. Препарат был получен из донорской цитратной плазмы человека повторной гель-фильтрацией на колонке TSC-60 HW и ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе. Чистота препарата составляла свыше 95% по данным энзимологических тестов и ЭФ в ПААГ. Перед "посадкой" препарат α₂ -макроглобулина переводили в 0,15 М фосфатный буфер pH 7,0, содержащий 0,5 M NaCl. Проводили процедуру ковалентного "пришивания" белка.As an affinity ligand, a preparation of human α ₂ macroglobulin with a concentration of 1.5 mg / ml was used. The preparation was obtained from donated human citrate plasma by repeated gel filtration on a TSC-60 HW column and ion exchange chromatography on DEAE cellulose. The purity of the drug was over 95% according to enzyme tests and EF in PAG. Before "landing" the preparation of α ₂ -macroglobulin was transferred to 0.15 M phosphate buffer pH 7.0, containing 0.5 M NaCl. The procedure of covalent “sewing” of protein was carried out.

После активации и отмывки ледяной дистиллированной водой на фильтре Шотта сефарозу добавляли к раствору α₂ -макроглобулина в объеме, равным объему раствора белка. Инкубацию смеси проводили в течение 2 часов при t=18-20^oC, а затем 16 часов при t=4^oC, постоянно перемешивая на роторной мешалке. После ряда промывок сорбента на фильтре Шотта

собирали промывочный буфер, определяли его объем и концентрацию белка микробиуретовым методом. Расчет баланса позволял судить о количестве ковалентно связавшегося α₂ -макроглобулина. Далее проводили блокировку оставшихся активных групп 0,5 М глицином в 0,15 М фосфатном буфере с 0,5 M NaCl pH 7,9. Процедура занимала 2 часа при комнатной температуре и постоянном перемешивании на роторной мешалке. Окончательную отмывку сорбента осуществляли на фильтре Шотта, попеременно пропуская по 200 мл буферных растворов (0,1 Глицин-HCl буфер pH 3,0±0,1 и 0,15 М фосфатный буфер с 0,5 М NaCl pH 7,9±0,1). Смену буферов проводили 5 раз. Готовый сорбент помещали в 0,15 М фосфатный буфер pH 7,2 ± 0,1.After activation and washing with ice-cold distilled water on a Schott filter, Sepharose was added to a solution of α ₂ -macroglobulin in a volume equal to the volume of the protein solution. The mixture was incubated for 2 hours at t = 18-20 ^o C, and then 16 hours at t = 4 ^o C, constantly stirring on a rotary mixer. After a series of washes of the sorbent on a Schott filter

washing buffer was collected, its volume and protein concentration were determined by the microbiuret method. The calculation of the balance made it possible to judge the amount of covalently bound α ₂ -macroglobulin. Then, the remaining active groups were blocked with 0.5 M glycine in 0.15 M phosphate buffer with 0.5 M NaCl pH 7.9. The procedure took 2 hours at room temperature and with constant stirring on a rotary mixer. The final washing of the sorbent was carried out on a Schott filter, alternately passing 200 ml of buffer solutions (0.1 Glycine-HCl buffer pH 3.0 ± 0.1 and 0.15 M phosphate buffer with 0.5 M NaCl pH 7.9 ± 0 ,one). Buffers were changed 5 times. The finished sorbent was placed in 0.15 M phosphate buffer pH 7.2 ± 0.1.

Эффективность ковалентного связывания α₂ -макроглобулина на сорбенте составила 96%.The efficiency of covalent binding of α ₂ -macroglobulin on the sorbent was 96%.

Пример 2. Удаление TNF-α из забуферного физиологического раствора (ЗФР). Example 2. Removal of TNF-α from buffered saline (PBS).

Готовили микроколонку объемом 2,0 мл геля (сорбента). Сорбент получали путем активации сефарозы 4 B CL бромцианом с последующей конъюгацией белка, находящегося в 0,15 NaCl при pH 7,9. A microcolumn with a volume of 2.0 ml of gel (sorbent) was prepared. The sorbent was obtained by activating Sepharose 4 B CL with cyanogen bromide, followed by conjugation of a protein in 0.15 NaCl at pH 7.9.

Колонку с иммобилизованным α₂ -макроглобулином промывали 0,5 М раствором монометиламина гидрохлорида в течение 30 мин при 20^oC. Далее вели элюацию.The column with immobilized α ₂ -macroglobulin was washed with a 0.5 M solution of monomethylamine hydrochloride for 30 min at 20 ^o C. Then elution was carried out.

Промывали колонку ЗФР (pH 7,2) в течение 30 минут со скоростью 20 мл/час при 20^oC, чтобы удалить с сорбента монометиламина гидрохлорид. Затем наносили образец, который содержал 10000 ЕД TNF-α (0,6 мкг) в 1 мл ЗФР. После нанесения образца останавливали насос и через 15 минут инкубации продолжали элюцию ЗФР. Общая активность фракций элюата, содержащих TNF, составляла 800 ЕД. Таким образом, эффективность удаления составила свыше 90%.Washed column PBS (pH 7.2) for 30 minutes at a speed of 20 ml / hour at 20 ^o C to remove from the sorbent monomethylamine hydrochloride. Then a sample was applied that contained 10,000 units of TNF-α (0.6 μg) in 1 ml of PBS. After applying the sample, the pump was stopped and after 15 minutes of incubation, PBS elution was continued. The total activity of the eluate fractions containing TNF was 800 IU. Thus, the removal efficiency was over 90%.

Пример 3. Удаление TNF-α из сыворотки крови человека. Example 3. Removal of TNF-α from human serum.

Готовили микроколонку объемом 2,0 мл геля, полученного согласно примеру 2 при pH 8,2. Prepared a microcolumn with a volume of 2.0 ml of the gel obtained according to example 2 at a pH of 8.2.

Затем наносили 3,0 мл донорской крови, в которую предварительно ввели 10000 ЕД TNF-α.
Хроматографию проводили с помощью перистальтического насоса P-I (LKB, Швеция) со скоростью 20 мл в час. Сыворотка циркулировала по замкнутому контуру в течение 30 минут. Затем размыкали контур и вели элюацию ЗФР с указанной скоростью. Общая активность TNF-α в элюате составляла 555 ЕД, т.е. менее 7% от исходной.Then, 3.0 ml of donated blood was applied, into which 10,000 units of TNF-α were previously injected.
Chromatography was performed using a PI peristaltic pump (LKB, Sweden) at a rate of 20 ml per hour. The serum circulated in a closed loop for 30 minutes. Then the circuit was opened and the PBS was eluted at the indicated rate. The total activity of TNF-α in the eluate was 555 U, i.e. less than 7% of the original.

После отмывания этой колонки от сорбированного TNF-α последовательно 0,9 М NaCl и ЗФР наносили еще один образец сыворотки, содержащей 10000 ЕД TNF-α. Хроматографическую процедуру повторяли, как описано. After washing this column from sorbed TNF-α, 0.9 M NaCl and PBS successively applied another serum sample containing 10,000 U of TNF-α. The chromatographic procedure was repeated as described.

Эффективность удаления TNF-α в результате повторной процедуры составила 91%, т.е. практически не ухудшилась. The removal efficiency of TNF-α as a result of the repeated procedure was 91%, i.e. practically did not worsen.

Пример 4. В условиях примера 2 модификацию α₂ -макроглобулина проводили обработкой раствором протеолитического препарата фибринолизина (плазмина), который брали в двукратном избытке по отношению к иммобилизованному α₂ -макроглобулину (по молярности). Удаление TNF-α из ЗФР проводили аналогично описанному в примере 1. Эффективность удаления TNF в данном эксперименте составила 92%.Example 4. In the conditions of example 2, the modification of α ₂ -macroglobulin was carried out by treatment with a solution of the proteolytic preparation fibrinolysin (plasmin), which was taken in double excess with respect to the immobilized α ₂ -macroglobulin (by molarity). The removal of TNF-α from PBS was performed as described in example 1. The removal efficiency of TNF in this experiment was 92%.

Источники информации
1. Wilcher M., Mikon T., Kohr J. In: Methods in Enzymology, Jakoby W.B. (ed), Academic Press, New York, vol 104. p. 3, 1984.Sources of information
1. Wilcher M., Mikon T., Kohr J. In: Methods in Enzymology, Jakoby WB (ed), Academic Press, New York, vol 104. p. 3, 1984.

2. Аффинная хроматография. Методы. - М.: Мир, 1988, с. 48-52. Редакторы П. Дин, У. Джонсон, Ф. Милд. 2. Affinity chromatography. Methods - M .: Mir, 1988, p. 48-52. Editors P. Dean, W. Johnson, F. Mild.

Claims

1. An affinity sorbent for removing tumor necrosis factor, comprising a carrier on which a protein is immobilized, characterized in that a modified human α ₂ -macroglobulin is used as the protein.

2. A method of producing an affinity sorbent for removing tumor necrosis factor by immobilizing a protein on a carrier, characterized in that human α ₂ -macroglobulin is used as the protein, which is immobilized at pH 7.0 - 8.2, and then treated with a thiol ether modifier loops.

3. The method according to claim 2, characterized in that monomethylamine hydrochloride is used as a thiol ether loop modifier.

4. The method according to claim 2, characterized in that the proteolytic enzyme of human blood plasma is used as a modifier of the thiol ether loop.