RU2123005C1

RU2123005C1 - Alkaloid compounds, method of their preparing, pharmaceutical composition

Info

Publication number: RU2123005C1
Application number: RU94026100A
Authority: RU
Inventors: Бомбарделли Эцио; Мустик Джузеппе; Веротта Луизелла
Original assignee: Индена С.П.А.
Priority date: 1994-05-30
Filing date: 1994-07-13
Publication date: 1998-12-10
Also published as: HUT71510A; GR960300006T1; ITMI941112A0; ES2081783T1; EP0685481A2; FI106202B; FI943294A; CN1052233C; DE69406430T2; NO942633L; CZ290320B6; DE685481T1; CN1121075A; ATE159527T1; KR0149723B1; CA2127763C; HU9402089D0; RU94026100A; ITMI941112A1; IT1269862B

Abstract

FIELD: medicine, pharmacy. SUBSTANCE: invention relates to new alkaloids from Mappia foetida (foetidines 1 and 2) of the general formula (I)

where R is H (1) or R is OCH₃ (2). These water-soluble alkaloids are precursors of camptothecin and 9-methoxycamptothecin which are present in all parts of plant being the latter are water-insoluble. New water-soluble alkaloids can be used for parenteral administration that ensures to avoid the use of toxic vehicles and unwanted chemical derivatives. Foetidines are obtained by extraction of different parts of plant Mappia foetida with aliphatic low-molecular alcohols or ketones. New water-soluble alkaloids show anticancer and antiviral properties. EFFECT: improved method of preparing. 8 cl, 2 ex

Description

В данном изобретении описаны новые алкалоиды из Mappia foetida, их терапевтическое применение и содержащие их препараты. The present invention describes new alkaloids from Mappia foetida, their therapeutic use and preparations containing them.

Алколоиды настоящего изобретения имеют следующую формулу (I):

фоетидин 1 : R = H, фоетидин 2 : R = OCH₃.Alkaloids of the present invention have the following formula (I):

foetidine 1: R = H, foetidine 2: R = OCH ₃ .

При обработке кислотами или щелочами, или гидролитическими ферментами фоетидины 1 и 2 количественно высвобождают соответственно : либо известный алкалоид камптотецин, молекула которого была широко испытана фармакологически и клинически, как таковая или в виде производных, в онкологии и при лечении некоторых вирусных заболеваний, либо 9 - метоксикамптотецин, полезный при тех же показаниях. When treated with acids or alkalis, or with hydrolytic enzymes, phoetidins 1 and 2 are quantitatively released, respectively: either the known alkaloid camptothecin, whose molecule has been extensively tested pharmacologically and clinically, as such or in derivatives, in oncology and in the treatment of certain viral diseases, or 9 - methoxycamptothecin, useful for the same indications.

Камптотецин формулы II

был впервые выделен вместе с другими соединениями из Camptoteca acuminata (Nyssaceae) и из других растений, среди которых Mappia foetida (Olinaceae), хотя последний изучался в течение длительного времени, при дальнейшем химическом скрининге были неожиданно обнаружены новые алкалоиды, которые даже при обработке сырых растительных экстрактов давали камптотецин.Camptothecin of Formula II

was first isolated together with other compounds from Camptoteca acuminata (Nyssaceae) and from other plants, among which Mappia foetida (Olinaceae), although the latter was studied for a long time, new alkaloids were unexpectedly discovered during further chemical screening, which even when processing raw plant extracts gave camptothecin.

Среди соединений, из которых был выделен камптотецин, особенно важен фоетидин 1, так как он содержится в растениях в больших количествах. Исследование его структуры при помощи спектрального анализа и химической деградации привело к идентификации соединения, для которого характерно наличие звена спермидина, дважды этерифицированного кумаровой кислотой, которая, в свою очередь, этерифицирована открытым звеном камптотецина (см. формулу I). Это соединение содержится во всех частях растения, но особенно в семенах и корнях, в количествах, колеблющихся от 0,1 до 0,5%. Его преимущество по сравнению с комптотецином состоит в том, что он легко растворим в воде при слегка кислом pH; камптотецин, наоборот, полностью нерастворим в воде и во всех биологически приемлемых носителях, поэтому были предприняты интенсивные усилия, чтобы устранить этот недостаток и получить полусинтетический препарат. Among the compounds from which camptothecin was isolated, phoetidine 1 is especially important, since it is contained in plants in large quantities. The study of its structure using spectral analysis and chemical degradation led to the identification of the compound, which is characterized by the presence of a spermidine unit double esterified with coumaric acid, which, in turn, is esterified with an open camptothecin unit (see formula I). This compound is found in all parts of the plant, but especially in the seeds and roots, in amounts ranging from 0.1 to 0.5%. Its advantage compared to Comptothecin is that it is readily soluble in water at a slightly acidic pH; camptothecin, on the contrary, is completely insoluble in water and in all biologically acceptable carriers; therefore, intensive efforts were made to eliminate this deficiency and to obtain a semi-synthetic preparation.

Фоетидин 1 получен экстракцией различных частей растений низкомолекулярными алифатическими спиртами или кетонами, отдельно или в смеси с водой при комнатной температуре; экстракты концентрировали при низкой температуре, предпочтительно ниже 25^oC в вакууме; органический растворитель удаляли и водный концентрат экстрагировали хлорированными растворителями для извлечения слабощелочных алкалоидов, среди которых камптотецин, 9-метоксикамптотецин и маппицины; в дальнейшем водную фазу экстрагировали н-бутанолом или не смешиваемыми с водой спиртами, которые затем концентрировали досуха при низкой температуре в вакууме. Осадок из бутанольных экстрактов очищали на силикагеле или сходных с ним адсорбентах; для элюирования использовали смеси хлорированных растворителей, предпочтительно хлористый метилен, и алифатические спирты, предпочтительно метанол или этанол. Использовали, главным образом, смеси в соотношении от 4:1 до 1:1. Фракции, содержащие описываемые в изобретении алкалоиды, объединяли, концентрировали досуха и осадок далее очищали при помощи препаративной ЖХВР, с применением, например, колонки Li Chroprep RP8, элюировали градиентом метанол/вода, начиная с соотношения метанол/вода 1:1, до чистого метанола. Фракции, содержащие алкалоиды, концентрировали при низкой температуре в вакууме, водный концентрат подвергали сушке при температуре ниже 0^oC (вымораживанием). Чистые алкалоиды получали при помощи кристаллизации.Foetidin 1 obtained by extraction of various parts of plants with low molecular weight aliphatic alcohols or ketones, alone or in a mixture with water at room temperature; the extracts were concentrated at a low temperature, preferably below 25 ^° C. in vacuo; the organic solvent was removed and the aqueous concentrate was extracted with chlorinated solvents to recover weakly alkaline alkaloids, including camptothecin, 9-methoxycamptothecin and mappicins; thereafter, the aqueous phase was extracted with n-butanol or water-immiscible alcohols, which were then concentrated to dryness at low temperature in vacuo. The precipitate from butanol extracts was purified on silica gel or similar adsorbents; mixtures of chlorinated solvents, preferably methylene chloride, and aliphatic alcohols, preferably methanol or ethanol, were used for elution. Used mainly mixtures in a ratio of from 4: 1 to 1: 1. The fractions containing the alkaloids described in the invention were combined, concentrated to dryness and the precipitate was further purified by preparative HPLC using, for example, Li Chroprep RP8 columns, eluting with a methanol / water gradient starting from 1: 1 methanol / water to pure methanol . The fractions containing alkaloids were concentrated at low temperature in vacuum, the aqueous concentrate was dried at a temperature below 0 ^o C (by freezing). Pure alkaloids were obtained by crystallization.

Полученные вещества подвергали биологической оценке на линиях опухолевых клеток человека (яичника, грудной железы, толстой кишки, легких, устойчивых или не устойчивых к другим противоопухолевым соединениями, и т.п.) и на некоторых штаммах вирусов. В действительности, известно, что камптотецин, или, скорее, некоторые из его производных обладают цитотоксической активностью, связанной с ингибированием ДНК топоизомера I и II. The obtained substances were subjected to biological evaluation on the lines of human tumor cells (ovary, breast, colon, lung, resistant or not resistant to other antitumor compounds, etc.) and on some strains of viruses. In fact, camptothecin, or rather some of its derivatives, is known to have cytotoxic activity associated with inhibition of DNA of topoisomer I and II.

Например, цитотоксичность для клеточной линии карциномы прямой кишки составляет около 25 нМ. Антивирусная активность фоетидина 1, даже с учетом различной устойчивости штаммов, проявляется при концентрациях, варьирующихся от 1 до 100 нг/мл. Фоетидин 2, отличающийся от фоетидина 1 наличием метоксила в 9-положении, действует аналогичным образом. Доказано, что вирус герпеса, цитомегаловирус и ВИЧ чувствительны к алкалоидам изобретения. For example, cytotoxicity for the rectal carcinoma cell line is about 25 nM. The antiviral activity of foetidine 1, even taking into account the different resistance of the strains, appears at concentrations ranging from 1 to 100 ng / ml. Foetidin 2, which differs from foetidine 1 by the presence of methoxyl at the 9-position, acts in a similar way. It has been proven that the herpes virus, cytomegalovirus and HIV are sensitive to the alkaloids of the invention.

Соединения данного изобретения могут быть включены во все виды фармацевтических препаратов, но прежде всего они могут легко вводиться парэнтерально в водных растворах при pH, совместимых с pH крови, не вызывая преципитации или несовместимости. В препаратах могут быть использованы все стандартные фармацевтические наполнители. Дозировки этих новых алкалоидов могут варьироваться от 0,5 до 200 мг на дозу и терапевтический цикл. По предварительным данным, эффективными являются дозы около 50 мг/м².The compounds of this invention can be incorporated into all types of pharmaceutical preparations, but above all, they can easily be administered parenterally in aqueous solutions at pH compatible with the pH of the blood without causing precipitation or incompatibility. All standard pharmaceutical excipients may be used in the preparations. Dosages of these new alkaloids can vary from 0.5 to 200 mg per dose and therapeutic cycle. According to preliminary data, doses of about 50 mg / m ² are effective.

Приведенные ниже примеры далее иллюстрируют изобретение, не ограничивая его объем. The following examples further illustrate the invention without limiting its scope.

Пример 1. Получение фоетидина 1 из семян Mappia foetida. Example 1. Obtaining foetidine 1 from seeds of Mappia foetida.

5 кг мелко измельченных семян Mappia foetida трижды экстрагировали 50 л ацетона при помешивании при комнатной температуре; объединенные ацетоновые экстракты концентрировали в вакууме до 10 л; концентрат разбавляли 10 л 1%-ного раствора лимонной кислоты; нерастворимые вещества фильтровали и отбрасывали, тогда как водно-ацетоновую фазу противоточно экстрагировали хлористым метиленом для выделения алкалоидов (камптотецина, метоксикамптотецина и так далее); водно-ацетоновую фазу концентрировали до воды, и концентрат экстрагировали н-бутанолом после нейтрализации до pH 7,5 для удаления фоетидинов 1 и 2. Н-бутанольный раствор концентрировали и осадок высушивали, получая около 200 г бутанольной фракции, которую фракционировали следующим образом: 30 г бутанольной фракции хроматографировали на силикагеле /500 г/ с последующим элюированием колонки сначала смесью хлористый метилен/метанол в соотношении 4:1, затем смесью тех же растворителей в соотношении 7:3. Продукт, содержащийся во фракции, элюированной смесью 7:3 очищали на колонке Li Chroprep RP8 и элюировали градиентом метанол/вода. Фракции, содержащие фоетидины 1 и 2, объединяли и концентрировали досуха в вакууме при температуре ниже 30^oC, осадок кристаллизовали из смеси ацетон/гексан. Получали 5,1 г фоетидина 1, имеющего следующие характеристики: т. пл. 157 - 158^oC; [α]_D = -37,9 (c = 0,31, MeOH). ¹Н-ЯМР - спектр / 300 МГц, DMCO-d₆/, 8,60 /1H, с, H-7/, 8,19 /1H, т, J = 5,2, H-10/, 8,15 /1H, д, J = 8,6, H-12/, 8,05 /1H, д, J = 8,6, H-9/, 8,04 /1H, т, J = 5,2, H-19/, 7,80 /1H, т, J = 7,8, H-11/, 7,65 /1H, т, J = 7,8, H-10/, 7,35 /2H, д, J = 8,6, H-3 + H-5/, 7,34 /2H, д, J = 8,6, H-24 + H-28/, 7,29 /1H, д, J = 15,8, H-7/, 7,28 /1H, д, J = 15,8, H-22/, 6,76 /4H, д, J = 8,6, H-6 + H-25 + H-27/, 6,36 /1H, д, J = 15,8, H-8/, 6,35 /1H, д, J = -15,8, H-21/, 5,58, 5,41 /2H, система AB, J = 10,6, H-17/, 5,18 /2H, с, H-5/, 3,21 /2H, м, H-11/, 3,13 /2H, м, H-18/, 2,84 /4H, шт. J = 7,2, H-13 + H-15/, 2,02 /1H, м, H-19A/, 1,96 /3H, с, CH₃CO/, 1,90 /1H, м, H-19B/, 1,74 /2H, м, H-12/, 1,55 /2H, м, H-16/, 1,46 /2H, м, H-17/, 0,84 /3H, т, J = 7,2, H-18/.5 kg of finely ground seeds of Mappia foetida were extracted three times with 50 l of acetone with stirring at room temperature; the combined acetone extracts were concentrated in vacuo to 10 l; the concentrate was diluted with 10 l of a 1% citric acid solution; insoluble substances were filtered and discarded, while the water-acetone phase was countercurrently extracted with methylene chloride to isolate alkaloids (camptothecin, methoxycamptothecin and so on); the aqueous acetone phase was concentrated to water, and the concentrate was extracted with n-butanol after neutralization to pH 7.5 to remove the phoetidines 1 and 2. The N-butanol solution was concentrated and the residue was dried, yielding about 200 g of the butanol fraction, which was fractionated as follows: 30 g of the butanol fraction was chromatographed on silica gel / 500 g /, followed by elution of the column with a 4: 1 methylene chloride / methanol mixture and then with a 7: 3 mixture of the same solvents. The product contained in the fraction eluted with a 7: 3 mixture was purified on a Li Chroprep RP8 column and eluted with a methanol / water gradient. Fractions containing phoetidins 1 and 2 were combined and concentrated to dryness in vacuo at a temperature below 30 ^° C, and the precipitate was crystallized from acetone / hexane. Received 5.1 g of foetidine 1, having the following characteristics: so pl. 157 - 158 ^o C; [α] _D = -37.9 (c = 0.31, MeOH). ¹ H-NMR spectrum (300 MHz, DMCO-d ₆ /, 8.60 / 1H, s, H-7 /, 8.19 / 1H, t, J = 5.2, H-10 /, 8, 15 / 1H, d, J = 8.6, H-12 /, 8.05 / 1H, d, J = 8.6, H-9 /, 8.04 / 1H, t, J = 5.2, H-19 /, 7.80 / 1H, t, J = 7.8, H-11 /, 7.65 / 1H, t, J = 7.8, H-10 /, 7.35 / 2H, d , J = 8.6, H-3 + H-5 /, 7.34 / 2H, d, J = 8.6, H-24 + H-28 /, 7.29 / 1H, d, J = 15 8, H-7 /, 7.28 / 1H, d, J = 15.8, H-22 /, 6.76 / 4H, d, J = 8.6, H-6 + H-25 + H -27 /, 6.36 / 1H, d, J = 15.8, H-8 /, 6.35 / 1H, d, J = -15.8, H-21 /, 5.58, 5.41 / 2H, system AB, J = 10.6, H-17 /, 5.18 / 2H, s, H-5 /, 3.21 / 2H, m, H-11 /, 3.13 / 2H, m , H-18 /, 2.84 / 4H, pcs. J = 7.2, H-13 + H-15 /, 2.02 / 1H, m, H-19A /, 1.96 / 3H, s, CH ₃ CO /, 1.90 / 1H, m, H -19B /, 1.74 / 2H, m, H-12 /, 1.55 / 2H, m, H-16 /, 1.46 / 2H, m, H-17 /, 0.84 / 3H, t J = 7.2; H-18 /.

¹³С-ЯМР-спектр: /78,1 МГц, DMCO-d₆/: 175,23 /с, C-21/, 170,81 /с, CH₃CO/, 166,27 /с, C-9'/, 165,83 /с, C-20'/, 161,43 /с, C-16a/, 159,40 /с, C-1'/, 159,14 /с, C-15/, 153,50 /с, C-2/, 148,36 /с, C-13/, 143,56 /с, C-3/, 139,37 /д, C-7/, 139,06 /д, C-22'/, 131,74 /д, C-7/, 130,58 /д, C-11/, 130,33 /с, C-6/, 129,63 /с, C-3' + C-5'/, 129,56 /д, C-24' + C-28'/, 129,40 /д, C-12/, 128,83 /д, C-9/, 128,23 /с, C-8/, 127,78 /д, C-10/, 126,23 /д, C-4'/, 126,13 /с, C-23'/, 123,42 /с, C-16/, 119,01 /д, C-8'/, 118,68 /д, C-21'/, 116,18 /д, C-2' + C-6' + C-26' + C-27'/, 100,68 /д, C-14/, 80,28 /д, C-20/, 59,87 /т, C-17/, 50,45 /т, C-5/, 47,23 /т, C-13'/, 45,36 /т, C-15'/, 38,41 /т, C-18/, 36,36 /т, C-11'/, 33,40 /т, C-19/, 26,99 /т, C-12'/, 26,87 /т, C-17'/, 24,04 /т, C-16'/, 21,22 /к, CH₃CO/, 9,29 /к, C-18/. ¹³ C-NMR spectrum: / 78.1 MHz, DMCO-d ₆ /: 175.23 / s, C-21 /, 170.81 / s, CH ₃ CO /, 166.27 / s, C-9 '/, 165.83 / s, C-20' /, 161.43 / s, C-16a /, 159.40 / s, C-1 '/, 159.14 / s, C-15 /, 153 50 / s, C-2 /, 148.36 / s, C-13 /, 143.56 / s, C-3 /, 139.37 / d, C-7 /, 139.06 / d, C -22 '/, 131.74 / d, C-7 /, 130.58 / d, C-11 /, 130.33 / s, C-6 /, 129.63 / s, C-3' + C -5 '/, 129.56 / d, C-24' + C-28 '/, 129.40 / d, C-12 /, 128.83 / d, C-9 /, 128.23 / s, C-8 /, 127.78 / d, C-10 /, 126.23 / d, C-4 '/, 126.13 / s, C-23' /, 123.42 / s, C-16 / , 119.01 / d, C-8 '/, 118.68 / d, C-21' /, 116.18 / d, C-2 '+ C-6' + C-26 '+ C-27' /, 100.68 / d, C-14 /, 80.28 / d, C-20 /, 59.87 / t, C-17 /, 50.45 / t, C-5 /, 47.23 / t, C-13 '/, 45.36 / t, C-15' /, 38.41 / t, C-18 /, 36.36 / t, C-11 '/, 33.40 / t, C -19 /, 26.99 / t, C-12 '/, 26.87 / t, C-17' /, 24.04 / t, C-16 '/, 21.22 / k, CH ₃ CO / 9.29 / c, C-18 /.

Фоетидин 2 /1,2 г./ был получен из маточного раствора после кристаллизации фоетидина 1 путем очистки хроматографией с обращенной фазой с применением того же самого элюента. Foetidine 2 / 1.2 g / was obtained from the mother liquor after crystallization of foetidine 1 by purification by reverse phase chromatography using the same eluent.

Фоетидин 2 имеет следующие характеристики: т. пл. 172 - 174^oC. [α]_d -44,6 (c = 0,35, метанол). ЯМР - спектр перекрывался со спектром фоетидина 1, за исключением сигнала - OCH₃ на ароматическом кольце при 3,2 млн. дол.Foetidin 2 has the following characteristics: so pl. 172 - 174 ^o C. [α] _d -44.6 (c = 0.35, methanol). NMR spectrum overlapped with the spectrum of foetidine 1, with the exception of the signal — OCH ₃ on the aromatic ring at 3.2 ppm.

Пример 2. Приготовление высушенных вымораживанием флаконов, содержащих фоетидин 1. Example 2. Preparation of freeze-dried vials containing foetidine 1.

5 г фоетидина 1 растворяли в 500 мл дистиллированной воды, содержащей 1,2 г лимонной кислоты, раствор фильтровали, стерилизовали и разливали в стерильной комнате в 100 флаконов, которые быстро замораживали и подвергали сушке при ниже 0^oC.5 g of foetidine 1 was dissolved in 500 ml of distilled water containing 1.2 g of citric acid, the solution was filtered, sterilized and poured in a sterile room into 100 vials, which were quickly frozen and dried at below 0 ^o C.

Claims

1. Alkaloid compounds of the general formula I

in which R represents hydrogen or methoxy.

2. The compound according to claim 1, which is foetidine 1, in which R is hydrogen.

3. The compound according to claim 1, which is foetidine 2, in which R is methoxy.

4. The method of producing compounds I according to claim 1, characterized in that they carry out:
a) extraction of various parts of the plants of Mappia foetida with aliphatic low-molecular-weight alcohols or ketones, alone or in a mixture with water, at room temperature;
C) concentration of the extracts at a temperature below 25 ^o C in vacuum;
c) extraction of the water-acetone concentrate obtained by partial removal of the organic solvent with chlorinated solvents to recover slightly alkaline alkaloids;
d) extraction of the aqueous phase with n-butanol;
f) purification of butanol extracts obtained by concentration at low temperature in vacuum, using chromatography on silica gel, using mixtures of chlorinated solvents and aliphatic alcohols as solvents;
f) concentration to dryness of the fractions containing alkaloids, and purification of the residue by preparative HPLC, elution with a methanol / water gradient, starting from methanol / water = 1: 1 to pure methanol;
g) freeze-drying the obtained aqueous extract and crystallization of pure foetidine 1;
h) chromatographic purification of the mother liquor from crystallization with reverse phase using the same eluent as in stage f) to obtain foetidine 2.

5. The method according to claim 4, characterized in that in step e) methylene chloride and methanol or ethanol are used respectively as chlorinated solvents and aliphatic alcohols in a ratio in the mixture from 4: 1 to 1: 1.

6. The method according to claim 4, characterized in that in stage f) use the column "LiChroprep RP8".

7. A pharmaceutical composition having antitumor and antiviral activity, containing as an active ingredient one of the compounds according to claims 1 to 3 in an effective amount.

8. The compound according to any one of claims 1 to 3, having antiviral and antitumor effects.