RU2121505C1

RU2121505C1 - Method of chitosan-glucane complex preparing

Info

Publication number: RU2121505C1
Application number: RU95110112A
Authority: RU
Inventors: В.П. Козлов; Е.Г. Наумов; Д.В. Немцев; В.В. Немцева; Е.П. Феофилова; В.М. Терешина
Original assignee: Акционерное общество закрытого типа "Цитробел"
Priority date: 1995-06-15
Filing date: 1995-06-15
Publication date: 1998-11-10
Also published as: RU95110112A

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: biomass of Aspergillus niger is treated with 2N hydrochloric acid followed by treatment with a mixture of reagents (detergent, mild alkali, ethanol) at 96 C for 35-45 min. Deacetylation is carried out with 20-25% alkali for 1-2 h at 100-110 C and the end product is washed out from alkali with alcohols at their decreasing concentration and water. Method provides preparing chitosan-glucane complex containing glucane and chitosan at concentrations 25-60% and deacetylation degree 15-70%. EFFECT: accelerated, universal method, improved ecology. 2 cl, 4 dwg

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения из мицелиальных грибов полисахаридов, в том числе полиаминосахаридов - хитина и хитозана. The invention relates to the field of biotechnology and can be used to obtain polysaccharides from mycelial fungi, including polyaminosaccharides - chitin and chitosan.

Известно, что основная часть биотехнологической продукции приходится на долю промышленной микробиологии, где с помощью мицелиальных грибов получают почти 80% биологически активных соединений (БАС), в том числе антибиотики, витамины, органические кислоты, ферменты. В последнее время в биотехнологии наблюдается четкая тенденция увеличения объема и расширения ассортимента продуктов, получаемых с использованием мицелиальных грибов. В связи с этим особое значение приобретают вопросы утилизации отходов этих производств и в первую очередь грибного мицелия. Остающаяся грибная биомасса при хранении в отвалах становится опасной для здоровья людей, так как делается источником загрязнения окружающей местности канцерогенами, иммунносупрессорами и особенно аллергенами. В то же время известно, что в клеточной стенке (КС) грибов содержится значительное количество хитина и других полисахаридов, что делает отходы от грибных производств привлекательным сырьем для получения ценных БАС. Следует указать, что основной биополимер КС грибов - хитин и особенно его производное хитозан начинают широко использоваться в медицине, сельском хозяйстве, косметике и промышленности. Особенно велико значение полиаминосахаридов в медицине, где они используются как основа для создания ранозаживляющих повязок, входят в состав лекарств от пародонтоза и служат основным полимером для мембран искусственных почек. It is known that the main part of biotechnological products falls on industrial microbiology, where almost 80% of biologically active compounds (BAS) are obtained with the help of mycelial fungi, including antibiotics, vitamins, organic acids, enzymes. Recently, in biotechnology, there has been a clear tendency to increase the volume and expand the range of products obtained using mycelial fungi. In this regard, the utilization of waste from these industries, and especially mushroom mycelium, is of particular importance. The remaining mushroom biomass when stored in dumps becomes hazardous to human health, as it becomes a source of pollution of the surrounding area with carcinogens, immunosuppressants and especially allergens. At the same time, it is known that the fungal cell wall (CS) contains a significant amount of chitin and other polysaccharides, which makes waste from mushroom production an attractive raw material for obtaining valuable ALS. It should be pointed out that the main biopolymer of CS fungi is chitin and especially its derivative chitosan are beginning to be widely used in medicine, agriculture, cosmetics and industry. Polyaminosaccharides are especially important in medicine, where they are used as the basis for creating wound dressings, are part of periodontal medication and serve as the main polymer for artificial kidney membranes.

Однако в отличие от хорошо исследованных и широкоиспользуемых способов получения хитина и хитозана из панцирей ракообразных технология выделения этих полиаминосахаридов из КС мицелиальных грибов нуждается в существенных доработках. Эта задача осложняется еще и тем, что химический состав КС грибов не одинаков и зависит от природы грибного мицелия, его возраста и условий выращивания. However, in contrast to the well-studied and widely used methods for producing chitin and chitosan from crustacean shells, the technology for isolating these polyamino saccharides from CS of mycelial fungi needs significant modifications. This task is further complicated by the fact that the chemical composition of CS of mushrooms is not the same and depends on the nature of the fungal mycelium, its age and growing conditions.

Целью настоящего изобретения является разработка способа получения хитинсодержащего комплекса из мицелия Aspergillus niger, с помощью которого получают лимонную кислоту. Отметим, что ввиду особенности химического состава КС этого гриба технологически более выгодно не выделять индивидуальный хитин, а получать комплекс хитина с другим полисахаридом KC-β-(1→3) глюканом (хитинглюкановый или хитозанглюкановый комплекс - ХГК). По своим физико-химическим свойствам β-(1→3) глюкан близок хитину, в частности является также щелоченерастворимым, что затрудняет его отделение от хитина. В то же время наличие в комплексе глюкана позволяет использовать ХГК в более широком направлении, например в качестве флокулянта, для получения более активных сорбентов, в качестве элиситорных соединений в сельском хозяйстве /4,6/. The aim of the present invention is to develop a method for producing a chitin-containing complex from Aspergillus niger mycelium, with which citric acid is obtained. Note that, due to the chemical composition of the CS of this fungus, it is technologically more profitable not to isolate individual chitin, but to obtain a chitin complex with another polysaccharide KC-β- (1 → 3) glucan (chitin-glucan or chitosanglucan complex - ChGC). According to its physicochemical properties, β- (1 → 3) glucan is close to chitin, in particular it is also alkaline-soluble, which makes it difficult to separate it from chitin. At the same time, the presence of glucan in the complex allows the use of CHC in a wider direction, for example, as a flocculant, to obtain more active sorbents, as elicitor compounds in agriculture / 4.6 /.

ХГК был впервые получен в 1979 г. /3/. более поздние патенты относятся к 1981 г. /2/ и 1083 г. /1/. В открытой печати способ получения комплекса хитина и глюкана из A.niger был опубликован в 1980 г. /5/, где подробно описывались его хелатирующие, коагулирующие и пленкообразующие свойства. Сущность описанного в этих патентах способа состояла в обработке мицелия A.niger и других грибов щелочью, имеющей концентрацию 2,5% и 40%. Описан способ получения ХГК из A.niger и Fusarium moniliforme, отличающийся тем, что для обработки мицелия используют только концентрированную щелочь /6/. HCG was first obtained in 1979/3 /. later patents relate to 1981/2 / and 1083/1 /. In the open press, a method for producing a complex of chitin and glucan from A.niger was published in 1980/5 /, where its chelating, coagulating and film-forming properties were described in detail. The essence of the method described in these patents consisted in the treatment of A. niger mycelium and other fungi with alkali, having a concentration of 2.5% and 40%. Describes a method for producing ChGC from A.niger and Fusarium moniliforme, characterized in that only concentrated alkali is used for processing mycelium / 6 /.

Наиболее близким по технической сущности к предполагаемому изобретению является способ получения хитозанглюканового комплекса из мицелиальных грибов, в частности из A.niger /1/. Согласно этому способу биомасса A.niger (черного цвета) после получения на заводе лимонной кислоты в количестве 1 кг подвергается отмывке в течение 30 минут 2,5% NaOH (1:10). Выход биомассы после отмывки составляет 50%, так как часть белков, липидов, пигментов и часть растворимых полисахаридов извлекается из мицелия во время этой обработки. Далее продукт (500 г) подвергают воздействию 40% NaOH (1:2,5) в течение 6 часов при t=128^oC для удаления оставшихся биополимеров и проведения деацетилирования. Получают белый конечный продукт (ХГК), содержащий 32% хитозана. Выход ХГК от лиофильно высушенной биомассы составляет 55%.The closest in technical essence to the proposed invention is a method for producing a chitosanglucan complex from mycelial fungi, in particular from A.niger / 1 /. According to this method, A.niger biomass (black), after receiving 1 kg of citric acid at the plant, is washed with 2.5% NaOH (1:10) for 30 minutes. The biomass yield after washing is 50%, since part of the proteins, lipids, pigments and part of the soluble polysaccharides are extracted from the mycelium during this treatment. Next, the product (500 g) was exposed to 40% NaOH (1: 2.5) for 6 hours at t = 128 ^o C to remove the remaining biopolymers and deacetylation. A white end product (CGC) containing 32% chitosan is obtained. The yield of CHC from freeze-dried biomass is 55%.

В указанном выше способе получения ХГК из отходов биомассы A.niger мицелий получают на среде, не содержащей мелассы (отход от свекловичных производств при получении сахара). Однако современные заводы по производству лимонной кислоты используют среду, содержащую этот отход как дешевый и легкодоступный источник углерода. В процессе подготовки среды для ферментации мелассу подвергают соответствующим обработкам, обработки проводят и в конце ферментации, в частности, с этой целью используют K₃Fe(CN)₆. Все это приводит к значительному загрязнению отработанного мицелия металлами и органическими веществами, присутствующими в виде комплексов с металлами. Поэтому указанный выше способ получения ХГК /1/ может быть использован только в ограниченных случаях. Кроме того, в способе, описанном в прототипе, используют для получения ХГК более концентрированную (40%) щелочь, что приводит к накоплению агрессивных стоков, представляющих опасность для заводских коммуникаций и может привести к экологическим нарушениям. Наконец, время получения ХГК составляет около 7 часов, а учитывая отмывки щелочной биомассы, длительность процесса получения увеличивается до 10-12 часов.In the above method for producing HCG from A.niger biomass waste, mycelium is obtained on a medium that does not contain molasses (a departure from beet production in sugar production). However, modern citric acid plants use a medium containing this waste as a cheap and readily available carbon source. In the process of preparing the medium for fermentation, molasses is subjected to appropriate treatments, treatments are carried out and at the end of fermentation, in particular, K ₃ Fe (CN) _{6 is} used for this purpose. All this leads to significant pollution of spent mycelium with metals and organic substances present in the form of complexes with metals. Therefore, the above method of producing HCG / 1 / can be used only in limited cases. In addition, in the method described in the prototype, more concentrated (40%) alkali is used to obtain CHC, which leads to the accumulation of aggressive effluents, which are dangerous for factory communications and can lead to environmental damage. Finally, the time for obtaining HCG is about 7 hours, and given the washing of alkaline biomass, the duration of the production process increases to 10-12 hours.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является разработка нового способа получения ХГК из мицелия A.niger. Способ должен быть более широко используемым, т. к. должен учитывать специфические особенности выращивания мицелия в условиях заводов. Кроме того, предлагаемый способ должен быть экологически более чистым, не требовать концентрированных кислот и щелочей, и процесс должен занимать меньшее количество времени, чем в прототипе. Thus, it is an object of the present invention to provide a new method for producing HCG from A. niger mycelium. The method should be more widely used, because it must take into account the specific features of growing mycelium in plants. In addition, the proposed method should be environmentally friendly, not require concentrated acids and alkalis, and the process should take less time than in the prototype.

Как указывалось выше, в прототипе A.niger выращивают в условиях завода, не используя мелассу. Применение этого дешевого отхода в большинстве других технологий способствует, однако, значительному увеличению зольности биомассы, которая в условиях заводов, например АО "Цитробел" (Белгород), может достигать 12-15% и выше. Как показал рентгено-структурный анализ, основным элементом, загрязняющим мицелий, является кальций, однако присутствуют и другие металлы, например Fe⁺², Ni⁺², S, P и др. (фиг. 1, 1).As mentioned above, in the prototype A.niger is grown in a plant without molasses. The use of this cheap waste in most other technologies, however, contributes to a significant increase in the ash content of biomass, which in plants, for example, JSC Tsitrobel (Belgorod), can reach 12-15% and higher. As shown by x-ray structural analysis, the main element polluting the mycelium is calcium, but other metals are also present, for example, Fe ⁺² , Ni ⁺² , S, P, etc. (Fig. 1, 1).

Загрязнение мицелия A.niger кристаллическими примесями подтвердил микроскопический контроль биомассы, которая имеет темно-серый цвет. Отмеченные загрязнения значительно мешают получению ХГК, поэтому в предлагаемом нами способе первоначально их удаляют кратковременной обработкой разведенной соляной кислотой. Далее для удаления цитоплазматического содержимого мицелия биомассу гриба обрабатывают детергентом, слабой щелочью и спиртом. Такое сочетание реагентов позволяет в течение короткого времени удалить клеточные биополимеры мицелия (белки, сложные липиды), нарушив их ковалентные и ионные связи с хитином и глюканом. Проводимая далее щелочная обработка благодаря использованию указанных выше реагентов позволяет проводить деацетилирование хитина в менее жестких условиях и снизить концентрацию щелочи до 20%, т.е. в два раза. Contamination of A.niger mycelium with crystalline impurities confirmed the microscopic control of biomass, which has a dark gray color. Marked contaminants significantly interfere with the production of CHC, therefore, in our proposed method, they are initially removed by short-term treatment with diluted hydrochloric acid. Further, to remove the cytoplasmic contents of the mycelium, the biomass of the fungus is treated with detergent, weak alkali and alcohol. This combination of reagents allows for a short time to remove the cell biopolymers of mycelium (proteins, complex lipids), breaking their covalent and ionic bonds with chitin and glucan. The alkaline treatment carried out further, due to the use of the above reagents, makes it possible to carry out deacetylation of chitin under less severe conditions and reduce the alkali concentration to 20%, i.e. twice.

Полученный целевой продукт подвергают отмывке в спиртах понижающейся концентрации (от 96% до 30%), что позволяет значительно сократить расход воды при отмывке препарата от щелочи и значительно убыстрить эту процедуру, сократив время с 2-3 до 1 часа. Конкретная методика предлагаемого способа получения ХГК приведена в примере 1. The obtained target product is subjected to washing in alcohols of decreasing concentration (from 96% to 30%), which can significantly reduce water consumption when washing the drug from alkali and significantly speed up this procedure, reducing the time from 2-3 to 1 hour. The specific methodology of the proposed method for producing HCG is shown in example 1.

Пример 1. Example 1

Биомассу A. niger, полученную после ферментации на заводе с целью получения лимонной кислоты, подвергают обработке 2 н. соляной кислотой из расчета на 200 г отжатой биомассы 1 л кислоты в течение 15-20 мин при t= 45-50^oC. После отмывки водой получают мицелий, зольность которого составляет всего 0,8% (вместо 14% в исходной биомассе) (фиг. 1,2). Далее биомассу обрабатывают смесью реагентов, содержащих 0,1% детергента (стиральный порошок "Лотос"), 1% этанола (96%), 2% NaOH их расчета к биомассе (3:1) при t=98^oC в течение 35-45 минут. После отмывки водой продукт повергают воздействию 20% NaOH при t= 100-110^oC в течение 1 часа. Полученный ХГК отмывают от щелочи спиртами понижающейся концентрации: 96%, 70%, 50%, 30% и далее водой. Конечный продукт подвергают лиофильной сушке.A. niger biomass obtained after fermentation in a plant to produce citric acid is treated with 2 N hydrochloric acid per 200 g of squeezed biomass of 1 liter of acid for 15-20 minutes at t = 45-50 ^o C. After washing with water, mycelium is obtained, the ash content of which is only 0.8% (instead of 14% in the original biomass) ( Fig. 1,2). Next, the biomass is treated with a mixture of reagents containing 0.1% detergent (laundry detergent "Lotus"), 1% ethanol (96%), 2% NaOH calculated to biomass (3: 1) at t = 98 ^o C for 35- 45 minutes. After washing with water, the product is exposed to 20% NaOH at t = 100-110 ^o C for 1 hour. The obtained HGC is washed from alkali with alcohols of decreasing concentration: 96%, 70%, 50%, 30% and then with water. The final product is freeze dried.

Полученный продукт белого цвета, имеет зольность 0,8%, не содержит ионов K, Fe, S и Cl. Из металлов в нем присутствует только Ca⁺² в количестве 0,68%. Вес полученного продукта составляет 38,3% от биомассы, очищенной от неорганических кристаллов. Целевой продукт содержит 15-17% глюкана и 37-38% деацетилированного хитина. ИКС целевого продукта имеет характерные для полиаминосахаридов полосы в области 1100, 1400, 1550 и 1680 сл^-1 и более сглаженную структуру пиков в области 1100-1400 сл^-1, что более характерно для хитозана, чем для хитина. Степень деацетилирования (СД) - 10-15%.The resulting product is white, has an ash content of 0.8%, does not contain ions of K, Fe, S and Cl. Of the metals in it, only Ca ^{+2 is} present in an amount of 0.68%. The weight of the resulting product is 38.3% of the biomass purified from inorganic crystals. The target product contains 15-17% glucan and 37-38% deacetylated chitin. The ICS of the target product has bands characteristic of polyaminosaccharides in the region of 1100, 1400, 1550, and 1680 s ^-1 and a more smoothed peak structure in the region of 1100-1400 s ^-1 , which is more characteristic of chitosan than chitin. The degree of deacetylation (DM) is 10-15%.

Пример 2. Example 2

То же, что в примере 1, но процесс деацетилирования ХГК проводят 25% NaOH в течение 2 часа • (t=110^oC). Целевой продукт содержит 52,5% глюкана и 25,0% деацетилированного хитина с СД=55%. Выход целевого продукта 35,0%. ИКС целевого продукта представлен на фиг. 2
Пример 3.The same as in example 1, but the process of deacetylation of HCG spend 25% NaOH for 2 hours • (t = 110 ^o C). The target product contains 52.5% glucan and 25.0% deacetylated chitin with diabetes = 55%. The yield of the target product is 35.0%. The IRS of the target product is shown in FIG. 2
Example 3

То же, что в примере 1, но процесс деацетилирования ведут первоначально с использованием 25% щелочи (из расчета на 16 г сырой биомассы 100 мл щелочи) в течение 45 мин при t =110^oC, далее после отмывки щелочи процедуру деацетилирования повторяют второй раз в тех же условиях, но расход щелочи уменьшают в два раза. СД целевого продукта составляет 65-70%, выход хитозана - 27,3%, глюкана - 56,7%, выход целевого продукта - 37,0. ИКС целевого продукта представлен на фиг. 3.The same as in example 1, but the deacetylation process is carried out initially using 25% alkali (based on 16 g of raw biomass 100 ml of alkali) for 45 minutes at t = 110 ^o C, then after washing the alkali, the deacetylation procedure is repeated a second time under the same conditions, but alkali consumption is halved. The SD of the target product is 65-70%, the yield of chitosan is 27.3%, glucan is 56.7%, the yield of the target product is 37.0. The IRS of the target product is shown in FIG. 3.

Таким образом, предлагаемый способ является более универсальным, так как учитывает использование при ферментации A.nigеr дешевых отходов, в частности мелассы. Кроме того, предобработка биомассы слабой кислотой и далее комплексом указанных выше 3-х реагентов позволяет значительно сократить в дальнейшем концентрацию щелочи (с 40% до 20-25%) и время обработки ( с 6 час до 2,0 - 2,5 час) при проведении процесса, а также расход воды при отмывке биомассы от щелочи за счет применения спиртов понижающейся концентрации, т.е. сделать процесс получения ХГК экологически более чистым. В способе предлагаются также условия, которые позволяют получать ХГК с различным содержанием глюкана и хитина, а также варьировать СД последнего. Thus, the proposed method is more universal, since it takes into account the use of cheap waste, in particular molasses, in A.niger fermentation. In addition, pretreatment of biomass with a weak acid and then with a complex of the above 3 reagents can significantly reduce the concentration of alkali (from 40% to 20-25%) and processing time (from 6 hours to 2.0 - 2.5 hours) during the process, as well as water consumption when washing biomass from alkali due to the use of alcohols of decreasing concentration, i.e. to make the process of obtaining CHC environmentally friendly. The method also offers conditions that allow you to get CHA with different contents of glucan and chitin, as well as vary the diabetes of the latter.

Источники информации
1. Muzzarelli R.//Chitosan-glucan complex, method for its production and uses. US Patent, N 4, 368;322 1983 (прототип).Sources of information
1. Muzzarelli R. // Chitosan-glucan complex, method for its production and uses. US Patent, N 4, 368; 322 1983 (prototype).

2. Muzzarelli R///Chitosan-glucan complex, method for its production and uses, US Patent, 4, 282, 351, 1981. 2. Muzzarelli R /// Chitosan-glucan complex, method for its production and uses, US Patent, 4, 282, 351, 1981.

3. Muzzarelli R. //Chitin-Glucan complexes UK Patent Application, N 2026516 A., 1979. 3. Muzzarelli R. // Chitin-Glucan complexes UK Patent Application, N 2026516 A., 1979.

4. Тесленко А. Я., Купцова Н.И., Гирфанова Т.Ф. и др.// Биотехнология, 1986, N 2, с. 80. 4. Teslenko A. Ya., Kuptsova NI, Girfanova T.F. et al. // Biotechnology, 1986, N 2, p. 80.

5. Muzzarelli R. , Tanfani F., Scarpini G.//Biotechnology and Bioengineering, 1980, v.22, P.885. 5. Muzzarelli R., Tanfani F., Scarpini G. // Biotechnology and Bioengineering, 1980, v. 22, P.885.

6. Доклады Болг. АН, 1990. Т.43. N 10. C.69. 6. Reports by Bolg. AN, 1990.V. 43. N 10. C.69.

Claims

1. A method of producing a chitosanglucan complex, including cultivating Aspergillus niger fungus, followed by treating the mycelium with diluted and concentrated NaOH solutions, alkali washing and freeze drying of the target product, characterized in that the mycelium obtained after cultivation is subjected to preliminary exposure to 2 N hydrochloric acid, then treated with a mixture containing 0.1% detergent, 1% ethanol (96%) based on a 2% NaOH solution with a ratio of the complex of reagents and mycelium 3: 1, as a concentrated solution of NaOH and polzujut its 20-25% solution and process are 1 - 2 hours.

2. The method according to claim 1, characterized in that the washing of the mycelium from alkali is carried out sequentially with solutions containing 96%, 70%, 50% and 30% alcohol.