RU2111754C1

RU2111754C1 - Method of isolation of human cu,zn-superoxide dismutase

Info

Publication number: RU2111754C1
Application number: RU94025968A
Authority: RU
Inventors: Л.Я. Соловьева; В.Л. Шаронова; И.В. Чурилова; Т.А. Хрущева; Н.М. Федорова
Original assignee: Соловьева Людмила Яковлевна; Чурилова Ирина Васильевна
Priority date: 1994-07-15
Filing date: 1994-07-15
Publication date: 1998-05-27

Abstract

FIELD: biochemistry. SUBSTANCE: erythrocyte waste from human blood are subjected for hemolysis at simultaneous denaturation of hemoglobin by heating at 60-64 C. Then method involves filtration and purification of Cu,Zn-superoxide dismutase (SOD)-containing filtrate by two-step ion-exchange chromatography on anionite DEAE-Spheranite at pH 5.7-6.3 using 0.01M phosphate buffer and elution of SOD with 0.1M phosphate buffer at the same pH values and then on cationite Soloza KG by elution at pH 5.1-5.3. Invention ensures to increase the yield of the end product up to 65-70% at purity 98-99%. Product can be used in medicinal industry and laboratory studies. EFFECT: increased yield and purity. 4 tbl

Description

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в медицинской промышленности и в лабораторной практике для получения Cu, Zn-супероксиддисмутазы (COД) из эритроцитов человека. The invention relates to biochemistry and can be used in the medical industry and in laboratory practice to obtain Cu, Zn superoxide dismutase (COD) from human red blood cells.

Супероксиддисмутаза находит применение в качестве антиоксидантного протектора при производстве биологических препаратов, используется для защиты от проникающей радиации, как противовоспалительное средство и антимутагенный препарат, находит применение в онкологии и геронтологии, а также в пищевой промышленности. Superoxide dismutase is used as an antioxidant protector in the manufacture of biological products, used to protect against penetrating radiation, as an anti-inflammatory agent and antimutagenic drug, and is used in oncology and gerontology, as well as in the food industry.

Известен способ выделения COД из печени крыс [1], включающий гомогенизирование сырья, экстракцию фермента, удаление марганецсодержащей COД, осаждение ацетоном с последующей хроматографией на ДЕАЕ-сефадексе А-50 при pH 7,8 с элюцией ступенчатым градиентом NaCl, причем хроматографию проводят дважды, процесс занимает около 60 ч, достигаемая степень очистки - 250. A known method for the isolation of COD from rat liver [1], including homogenization of the feed, extraction of the enzyme, removal of manganese-containing COD, precipitation with acetone, followed by chromatography on DEAE-Sephadex A-50 at pH 7.8 with elution with a stepwise gradient of NaCl, moreover, the chromatography is carried out twice, the process takes about 60 hours, the achieved degree of purification is 250.

Описан также многостадийный способ получения СOД из эритроцитов бычьей крови [2] , включающий отмывку эритроцитов, гемолиз, осаждение гемоглобина смесью этанола и хлороформа, обработку фосфатом калия, обработку ацетоном, двухкратную хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе ДЕ-32, хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе ДЕ-52, гель-фильтрацию на сефадексе G-75 и хроматографию на ДЕАЕ-сефадексе А-50. Процесс занимает около 120 ч и включает многократное центрифугирование больших объемов. При этом получают электрофоретически гомогенный препарат СОД с выходом 54%. Also described is a multi-stage method for producing SOD from bovine blood erythrocytes [2], including washing of red blood cells, hemolysis, deposition of hemoglobin with a mixture of ethanol and chloroform, treatment with potassium phosphate, treatment with acetone, double chromatography on DEAE-cellulose DE-32, chromatography on DEA-DEA-cellulose DEA -52, gel filtration on Sephadex G-75 and chromatography on DEAE-Sephadex A-50. The process takes about 120 hours and involves multiple centrifugation of large volumes. An electrophoretically homogeneous SOD preparation is obtained with a yield of 54%.

Недостатками этих способов являются многостадийность, трудоемкость, невысокая степень очистки и получение СОД животного происхождения, антигенно отличной от СОД человека, что может привести к побочным реакциям аллергического характера, это снижает ценность препаратов с точки зрения медицинской практики. The disadvantages of these methods are multi-stage, laborious, low degree of purification and obtaining SOD of animal origin, antigenically different from human SOD, which can lead to adverse reactions of an allergic nature, this reduces the value of drugs from the point of view of medical practice.

Прототипом настоящего изобретения является способ выделения СOД из эритроцитов человека [3], включающий гемолиз эритроцитов водой, доведение pH до 6,0, добавление до 33% изопропанола, инкубацию 1 ч при 50^oC, охлаждение до 15^oC, фильтрование, концентрирование фильтрата на полых волокнах, охлаждение до О-5^oC добавление 1,5 объемов охлажденного ацетона, перемешивание 3 ч, выдерживание 48 ч, отделение осадка в проточной центрифуге, перерастворение осадка в трис-HCl буфере при pH 7,0, центрифугирование для удаления нерастворимых примесей и хроматографию на поперечно сшитом декстране. Чистота получаемого продукта 87%, выход 20%.A prototype of the present invention is a method for isolating SOD from human erythrocytes [3], including the hemolysis of red blood cells with water, adjusting the pH to 6.0, adding up to 33% isopropanol, incubating for 1 h at 50 ^° C, cooling to 15 ^° C, filtering, concentrating the filtrate on hollow fibers, cooling to O-5 ^o C, adding 1.5 volumes of chilled acetone, stirring for 3 hours, keeping for 48 hours, separating the precipitate in a flow centrifuge, re-dissolving the precipitate in Tris-HCl buffer at pH 7.0, centrifuging to remove insoluble impurities and chromatography on p pepper crosslinked dextran. The purity of the obtained product 87%, yield 20%.

Недостатками способа являются сложность процесса, низкий выход и чистота конечного продукта. The disadvantages of the method are the complexity of the process, low yield and purity of the final product.

Цель настоящего изобретения - разработка способа получения СОД человека, обладающей высокой удельной активностью, повышение выхода конечного продукта, упрощение процедуры выделения, исключение органических растворителей из процесса. Указанная цель достигается путем термообработки гемолизата при 60-64^oC в течение 10-15 мин, подкисления до pH 5,8-6,3, двухстадийной хроматографии на сорбенте ДЕАЕ-сфераните при сорбции pH 5,7-6,3 с использованием 0,01 М фосфатного буфера и элюции 0,1 М фосфатным буфером при тех же значениях pH и на сорбенте Солоза КГ (товарный знак N 73018) с элюцией при pH 5,1-5,3.The purpose of the present invention is the development of a method for producing human SOD with high specific activity, increasing the yield of the final product, simplifying the isolation procedure, eliminating organic solvents from the process. This goal is achieved by heat treatment of the hemolysate at 60-64 ^o C for 10-15 minutes, acidification to pH 5.8-6.3, two-stage chromatography on a sorbent DEAE-spheranite at sorption pH 5.7-6.3 using 0 , 01 M phosphate buffer and elution with 0.1 M phosphate buffer at the same pH values and on Soloz KG sorbent (trademark N 73018) with elution at pH 5.1-5.3.

Существенными отличиями являются изменение стадии отделения основных примесей путем замены трудоемкой процедуры предварительной очистки экстракцией органическими растворителями на термообработку гемолизата при температуре 60-64^oC и доочистку фермента с использованием сорбента ДЕАЕ-сферанита, ранее для решения подобных задач не применявшегося.Significant differences are the change in the stage of separation of the main impurities by replacing the time-consuming preliminary purification by extraction with organic solvents by heat treatment of the hemolysate at a temperature of 60-64 ^o C and post-treatment of the enzyme using DEAE-spheranite sorbent, which was not previously used to solve such problems.

ДЕАЕ-сферанит - это анионообменный сорбент-сополимер 60% диэтиламиноэтилметакрилата с 40% диметилметакрилатэтиленгликолем [4]. ДЕАЕ-сферанит обладает высокой емкостью, хорошими гидродинамическими свойствами, механической прочностью, что позволяет проводить стерилизацию сорбента, тем самым предпочтительнее других анионитов. DEAE-spheranite is an anion-exchange sorbent copolymer of 60% diethylaminoethyl methacrylate with 40% dimethyl methacrylatethylene glycol [4]. DEAE-spheranite has a high capacity, good hydrodynamic properties, and mechanical strength, which allows sterilization of the sorbent, which is more preferable than other anion exchangers.

Выбор диапазона температур для обработки гемолизата объясняется тем, что при температуре выше 64^oC и pH 5,7-6,3 наблюдается заметная инактивация СОД, а ниже 60^oC резко уменьшается количество отделяемых примесей (табл. 1)
Проведение хроматографии на ДЕАЕ-сфераните вне указанного диапазона pH приводит к снижению выхода СОД (табл. 2).The choice of temperature range for the treatment of hemolysate is explained by the fact that at temperatures above 64 ^o C and pH 5.7-6.3 a noticeable inactivation of SOD is observed, and below 60 ^o C the amount of separated impurities sharply decreases (Table 1)
Chromatography on DEAE-spheranite outside the specified pH range leads to a decrease in the output of SOD (Table 2).

Согласно предлагаемому способу к осадку эритроцитов из крови человека добавили два объема дистиллированной воды и прогревали при 60-64^oC 10-15 мин, после чего добавляли 1М раствор соляной кислоты при постоянном перемешивании, в результате чего происходил гемолиз и денатурация основной массы гемоглобина, денатурированные белки отделяли фильтрованием через два слоя капроновой ткани, фильтрат разбавляли в два раза дистиллированной водой и наносили на колонку с ДЕАЕ-сферанитом, уравновешенным 0,01 М фосфатным буфером pH 5,7-6,3. Элюцию СОД проводили 0,1 М фосфатным буфером pH 5,7-6,3. Данная концентрация элюирующего буфера достаточна для полной элюции СОД (табл. 3).According to the proposed method, two volumes of distilled water were added to the erythrocyte sediment from human blood and heated at 60-64 ^° C for 10-15 minutes, after which a 1M hydrochloric acid solution was added with constant stirring, resulting in hemolysis and denaturation of the bulk of the hemoglobin denatured proteins were separated by filtration through two layers of capron tissue, the filtrate was diluted twice with distilled water and applied to a column with DEAE-spheranite, balanced with 0.01 M phosphate buffer pH 5.7-6.3. SOD was eluted with 0.1 M phosphate buffer pH 5.7-6.3. This concentration of elution buffer is sufficient for complete elution of SOD (table. 3).

Элюированную с анионита фракцию СОД, подкисленную до значения pH 4,1-4,3, сорбировали на катионите, уравновешенном 0,1М фосфатным буфером pH 4,1-4,3, и после промывки катионита тем же буфером десорбировали СОД в статических условиях при pH 5,1-5,3. Статический способ десорбции позволил получить высокий выход продукта и одновременно полностью отделить его от примесных белков, что исключено при проведении процесса в режиме хроматографии в потоке. Условия сорбции выбраны по экспериментальным данным, приведенным в табл. 4
Конечный продукт обессоливали и лиофильно высушивали. Активность СОД определяли хемилюминесцентным методом [5]. Чистоту получаемого продукта характеризовали с помощью SDS-электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии на сорбенте TSK 2000 SW * L.The SOD fraction eluted from the anion exchange resin acidified to a pH of 4.1–4.3 was sorbed on a cation exchanger balanced with 0.1 M phosphate buffer pH 4.1–4.3, and after washing the cation exchange resin with the same buffer, SOD was desorbed under static conditions under pH 5.1-5.3. The static desorption method made it possible to obtain a high yield of the product and at the same time completely separate it from impurity proteins, which is excluded during the process in the flow chromatography mode. Sorption conditions are selected according to the experimental data given in table. 4
The final product was desalted and freeze-dried. SOD activity was determined by the chemiluminescent method [5]. The purity of the obtained product was characterized by SDS electrophoresis and high performance liquid chromatography on a TSK 2000 SW * L sorbent.

В результате внесенных изменений в технологию получения СОД человека удалось повысить чистоту продукта с 87 до 98-99%. Выход возрос с 20 до 65-70%. Удельная активность составила 5000000 ед/мг белка. As a result of the changes to the technology for producing human SOD, it was possible to increase the purity of the product from 87 to 98-99%. The output increased from 20 to 65-70%. The specific activity was 5,000,000 units / mg protein.

Дополнительным преимуществом является исключение из процесса органических растворителей, требующих особого соблюдения техники безопасности. An additional advantage is the exclusion from the process of organic solvents that require special safety precautions.

Пример 1. Эритроциты разводят в двух объемах дистиллированной воды. Затем осуществляют термообработку гемолизата при подкислении до pH 6,0, варьируя температуру. Об активности СОД судят по степени подавления хемилюминесценции, выраженной в процентах, в фильтратах, остающихся после отделения осадка. Результаты сведены в табл. 1. Example 1. Red blood cells are diluted in two volumes of distilled water. Then carry out the heat treatment of the hemolysate with acidification to pH 6.0, varying the temperature. The activity of SOD is judged by the degree of suppression of chemiluminescence, expressed as a percentage, in the filtrates remaining after separation of the precipitate. The results are summarized in table. one.

Пример 2. 40 л осадка эритроцитов, оставшегося после отбора лейкоцитарной плазмы, смешивают с 80 л дистиллированной воды и прогревают, перемешивая до 60^oC, добавляют 1400 мл 1М HCl и выдерживают при этой температуре еще 12 мин. Затем содержимое реактора фильтруют через два слоя капроновой ткани в приемную емкость. Общий объем отфильтрованного гемолизата составляет 110 л, его разбавляют дистиллированной водой до 280 л. Значение pH гемолизата при этом составляет 6,3. После охлаждения смеси до комнатной температуры наносят раствор на колонку с ДЕАЕ-сферанитом объемом 15 л, уравновешенным 0,01М фосфатным буфером до pH 6,2. Объем элюированной с колонки 0,1М фосфатным буфером pH 6,3 фракции, содержащей СОД, составляет 37 л. В элюат добавляют 1М HCl до pH 4,2 и наносят его на 4 л Солозы КГ, промывают сорбент 12 л 0,1М фосфатного буфера pH 4,2. Добавляют к катиониту 4 л 0,1М фосфатного буфера pH 4,2 и доводят значение pH суспензии катионита с буфером до 5,25. Перемешивают 1 ч, отделяют раствор десорбированной СОД от катионита. Промывают катионит 6 л 0,1М фосфатного буфера pH 5,2. Объем полученного раствора СОД - 9 л. Раствор СОД концентрируют, обессоливают и лиофилизируют. В результате получают 2,6 г СОД с активностью 500000 ед/мг. Выход от теоретически возможного - 65%.Example 2. 40 L of the erythrocyte sediment remaining after the leukocyte plasma was taken, mixed with 80 L of distilled water and heated, stirring to 60 ^° C, 1400 ml of 1M HCl was added and kept at this temperature for another 12 minutes. Then the contents of the reactor are filtered through two layers of nylon fabric in a receiving tank. The total volume of the filtered hemolysate is 110 l, it is diluted with distilled water to 280 l. The pH value of the hemolysate in this case is 6.3. After the mixture was cooled to room temperature, the solution was applied to a 15 L DEAE-spheranite column balanced with 0.01 M phosphate buffer to a pH of 6.2. The volume of the 6.3-SOD fraction eluted from the column with 0.1M phosphate buffer pH 6.3 was 37 L. 1 M HCl was added to the eluate to a pH of 4.2 and applied to 4 L of KG soloses; the sorbent was washed with 12 L of 0.1 M phosphate buffer pH 4.2. Add to the cation exchanger 4 L of 0.1 M phosphate buffer pH 4.2 and adjust the pH of the suspension of cation exchanger with buffer to 5.25. Stirred for 1 h, separated the solution of desorbed SOD from cation exchanger. Cation exchange resin is washed with 6 L of 0.1 M phosphate buffer pH 5.2. The volume of the obtained SOD solution is 9 l. The SOD solution is concentrated, desalted and lyophilized. The result is 2.6 g of SOD with an activity of 500,000 units / mg. The yield from the theoretically possible is 65%.

Пример 3. Операции проводят аналогично приведенным в примере 2. Температура прогрева гемолизата 64^oC. Объем разбавленного фильтра составляет 265 л, pH 6,4. Объем фракции СОД после хроматографии на анионите 39 л, pH десорбции с катионита 5,15. В результате получают 2,76 г СОД с активностью 480000 ед/мг. Выход - 69%.Example 3. The operations are carried out similarly to those described in example 2. The temperature of heating of the hemolysate is 64 ^o C. The volume of the diluted filter is 265 l, pH 6.4. The volume of the SOD fraction after chromatography on anion exchange resin is 39 L; the pH of desorption from cation exchange resin is 5.15. The result is 2.76 g of SOD with an activity of 480,000 units / mg. The yield is 69%.

Пример 4. Операции проводятся аналогично приведенным в примере 2. Подкисление гемолизата осуществляют 2200 мл 1М HCl. Общий объем разбавленного фильтрата составил 240л, а его pH 5,8. Колонку с ДЕАЕ-сферанитом уравновешивают 0,01М фосфатным буфером pH 5,85. Объем фракции СОД после хроматографии на анионите 35 л, объем десорбированной СОД с катионита 6 л. Получают 2,95 г СОД с активностью 500000 ед/мг. Выход - 73%. Example 4. The operations are carried out similarly to those described in example 2. Acidification of the hemolysate is carried out 2200 ml of 1M HCl. The total volume of the diluted filtrate was 240 l, and its pH was 5.8. The DEAE-spheranite column was equilibrated with 0.01 M phosphate buffer pH 5.85. The volume of the SOD fraction after chromatography on anion exchange resin is 35 L; the volume of desorbed SOD from cation exchange resin is 6 L. 2.95 g of SOD with an activity of 500,000 units / mg are obtained. The yield is 73%.

Источники информации. Sources of information.

1. Комов В.П. и Иванова Е.Ю. Способ выделения ZN, CU-зависимой супероксиддисмутазы из печени крысы. Авт. свид. СССР, N 979506,1982. 1. Komov V.P. and Ivanova E.Yu. Method for isolating ZN, CU-dependent superoxide dismutase from rat liver. Auth. testimonial. USSR, N 979506.1982.

2. Симонян М.А. и Налбандян P.M. Получение электрофоретически гомогенного препарата эритрокупреина и его тепловая денатурация. Биохимия, т. 40, вып. 4, с. 726-732, 1975. 2. Simonyan M.A. and Nalbandian P.M. Obtaining an electrophoretically homogeneous preparation of erythrocuprein and its thermal denaturation. Biochemistry, vol. 40, no. 4, p. 726-732, 1975.

3. Jackson D.E., Manuzza F. J. Isolation of superoxide dismutase. Пат. США, N 4435506, 1984. 3. Jackson D.E., Manuzza F. J. Isolation of superoxide dismutase. Pat. USA, N 4435506, 1984.

4. Гаврюченкова Л. П. , Громова О.А. и др. Анионообменные хроматографические материалы для выделения биологически активных веществ в биотехнологии. Передовой производственный опыт и методы в микробиологической промышленности. M., 1989, с. 18-20. 4. Gavryuchenkova L.P., Gromova O.A. and others. Anion-exchange chromatographic materials for the isolation of biologically active substances in biotechnology. Advanced manufacturing experience and methods in the microbiological industry. M., 1989, p. 18-20.

5. Corbisier P., Houbron A., Remacle J. A new technique for highly sensitive detection of superoxide dismutase activity by chemi luminescence.- Analytical Biochem., v 164, N l, 1987, pp 240-247. 5. Corbisier P., Houbron A., Remacle J. A new technique for highly sensitive detection of superoxide dismutase activity by chemi luminescence.- Analytical Biochem., V 164, N l, 1987, pp 240-247.

Claims

The method of extraction of Cu, Zn - human superoxide dismutase by hemolysis of erythrocyte-containing raw materials, heating of the hemolysate, its acidification and chromatographic purification, characterized in that the hemolysate is heated at 60 - 64 ^o C, and chromatographic purification of superoxide dismutase from the hemolysate filtrate is carried out first on DEAE anion exchange resin at pH 5.7 - 6.3, and then on the carboxyl cation exchanger at pH 5.1 - 5.3.3