RU2051922C1

RU2051922C1 - METHOD OF ISOLATION OF RECOMBINANT INTERLEUKIN-1 β FROM MICROORGANISM BIOMASS

Info

Publication number: RU2051922C1
Authority: RU
Inventors: Людмила Яковлевна Соловьева; Евгений Александрович Протасов; Андрей Семенович Симбирцев; Александр Николаевич Полторак; Сергей Александрович Кетлинский
Original assignee: Людмила Яковлевна Соловьева; Евгений Александрович Протасов; Андрей Семенович Симбирцев; Александр Николаевич Полторак; Сергей Александрович Кетлинский
Priority date: 1992-06-19
Filing date: 1992-06-19
Publication date: 1996-01-10

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: cell biomass of recombinant strain E. coli which produces human interleukin-1 b is treated with sodium hydroxide at pH 12-13 and cellular residue is separated. The end product is prepared from obtained supernatant by chromatography purification which is carried out for three stages two of which is carried out using cationite Solosa КГ 20 x 30 and one - using anionite Q-cellulose. EFFECT: improved method of isolation. 9 cl, 4 tbl

Description

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения белков генноинженерным методом, а точнее к технологии получения высокоочищенного интерлейкина I-β (ИЛ-I β). The invention relates to biotechnology, and in particular to methods for producing proteins by the genetic engineering method, and more specifically to a technology for the production of highly purified interleukin I-β (IL-I β).

В настоящее время известны методы получения ИЛ-1 β из культуральной среды клеток человека путем многостадийной очистки. Currently known methods for obtaining IL-1 β from the culture medium of human cells by multistage purification.

Недостатками известных способов являются низкий выход целевого продукта, а также относительно невысокая активность. The disadvantages of the known methods are the low yield of the target product, as well as the relatively low activity.

Для решения проблемы получения значительных количеств ИЛ-1 β разработаны технологии его получения путем экспрессии гена в генах микроорганизма с последующим разрушением клеток и выделением конечного продукта. To solve the problem of obtaining significant amounts of IL-1 β, technologies have been developed for its preparation by gene expression in the genes of the microorganism, followed by cell destruction and isolation of the final product.

Недостатками данных методов являются сложная технология, низкий выход цитокинов. The disadvantages of these methods are complex technology, low cytokine yield.

Известен способ получения ИЛ-1 β путем культивирования Е.coli, разрушения клеток осмотическим шоком и хроматографической очистки. A known method of producing IL-1 β by culturing E. coli, destruction of cells by osmotic shock and chromatographic purification.

Недостатком способа является потеря N-концевого аланина у 50% молекул и относительно невысокая удельная активность 1 · 10⁸ единиц на мг белка.The disadvantage of this method is the loss of the N-terminal alanine in 50% of the molecules and the relatively low specific activity of 1 · 10 ⁸ units per mg of protein.

Прототипом заявленного изобретения является способ получения рекомбинантного человеческого ИЛ-1 β, разработанного авторами, который включает в себя экспрессию гена в клетки E.coli, культивирование, отделение биомассы от культуральной жидкости центрифугированием, разрушение клеток ультразвуком, отделение клеточных стенок центрифугированием, осаждение нуклеиновых кислот полиэтиленимином, удаление нуклеиновых кислот центрифугированием, осаждение общего белка сульфатом аммония, отделение белкового осаждение общего белка сульфатом аммония, отделение белкового осадка центрифугированием, растворение белкового осадка, диализ белкового раствора и последующую многостадийную очистку хроматографическими методами. The prototype of the claimed invention is a method for producing recombinant human IL-1 β, developed by the authors, which includes gene expression in E. coli cells, cultivation, separation of biomass from the culture fluid by centrifugation, destruction of cells by ultrasound, separation of cell walls by centrifugation, deposition of nucleic acids by polyethyleneimine , removal of nucleic acids by centrifugation, precipitation of total protein by ammonium sulfate, separation of protein precipitation of total protein by ammonium sulfate separation, protein precipitate separation by centrifugation, protein precipitate dissolution, protein solution dialysis and subsequent multistage purification by chromatographic methods.

Очистка включает в себя ионообменную хроматографию белкового раствора на катионите Солоза КГ 20 · 30 с последующим диализом элюата. Затем используют высокоэффективную жидкостную хроматографию с применением анионита DEAE-TSK-5РW. Purification involves ion exchange chromatography of a protein solution on Soloz KG 20 · 30 cation exchange resin followed by dialysis of the eluate. Then, high performance liquid chromatography using DEAE-TSK-5PW anion exchange resin is used.

Недостатками прототипа являются многостадийность, потери ИЛ- β, относительно низкая удельная активность, необходимость перевода целевого продукта в физиологический буфер, вследствие чего метод не может быть использован в препаративных целях. The disadvantages of the prototype are multi-stage, loss of IL-β, a relatively low specific activity, the need to transfer the target product to a physiological buffer, as a result of which the method cannot be used for preparative purposes.

Задачей являлась разработка более технологического процесса, позволяющего получать целевой продукт с большим выходом и более высокой активностью. The task was to develop a more technological process that allows you to get the target product with greater yield and higher activity.

Найдено, что технологию получения ИЛ-1β можно существенно упростить, использовав выделение ИЛ-1 β из клеток обработкой щелочным агентом при pH 12-13, изменив хроматографическую очистку и введя стадию обессоливания. В качестве щелочного агента, как правило, используют гидроокись натрия, однако возможно использование других веществ основного характера. It was found that the technology for producing IL-1β can be significantly simplified by using the isolation of IL-1 β from cells by treatment with an alkaline agent at pH 12-13, changing the chromatographic purification and introducing the desalination step. As an alkaline agent, as a rule, sodium hydroxide is used, however, other basic substances can be used.

Хроматографическая очистка включает двухстадийную хроматографию на Солозе КГ 20 · 30 и одну стадию очистки на Q целлюлозе. Обессоливание проводится на Солозе КГ 20 · 30. Chromatographic purification includes two-stage chromatography on Solose KG 20 · 30 and one stage of purification on Q cellulose. Desalination is carried out on Soloz KG 20 · 30.

Технологически эффективны две последовательности стадий очистки, а именно на Солозе КГ 20*30 Q-целлюлозе Солозе КГ 20 · 30 и Солозе КГ 20 · 30 Солозе КГ 20 · 30 Q-целлюлозе. Two sequences of purification stages are technologically effective, namely, on Soloz KG 20 * 30 Q-cellulose Soloz KG 20 · 30 and Soloz KG 20 · 30 Soloz KG 20 · 30 Q-cellulose.

При первом варианте очистки хроматографический процесс проводится в следующих условиях: на первом этапе катионит уравновешивают 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,10 + 0,05. Элюцию ИЛ-1 β осуществляют 0,050 + 0,002 М раствором трис(гидроксиметил)аминометана [трис] Затем продукт пропускают через анионит Q-целлюлоза, уравновешенный 0,010 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 8,10 + 0,05 и элюируют ИЛ-1 β повышением ионной силы раствора до 0,050 + 0,002 М. На третьей стадии хроматографической очистки ИЛ-1β сорбируют на катионит Солоза КГ 20 · 30 в присутствии 2,2 + 0,1 М сульфата аммония при pH 4,10 + 0,05. Элюируют ИЛ-1 β повышением pH элюирующего раствора до 7,90 + 0,05. In the first variant of purification, the chromatographic process is carried out under the following conditions: in the first stage, the cation exchanger is equilibrated with 0.050 + 0.002 M trisacetate buffer pH 4.10 + 0.05. The elution of IL-1 β is carried out with a 0.050 + 0.002 M solution of tris (hydroxymethyl) aminomethane [tris]. Then the product is passed through anion exchange resin Q-cellulose balanced with 0.010 + 0.002 M trisacetate buffer pH 8.10 + 0.05 and elute with an increase in IL-1 β the ionic strength of the solution is up to 0.050 + 0.002 M. In the third stage of chromatographic purification, IL-1β is adsorbed on Soloz KG 20 × 30 cation exchange resin in the presence of 2.2 + 0.1 M ammonium sulfate at a pH of 4.10 + 0.05. Elute IL-1 β by increasing the pH of the elution solution to 7.90 + 0.05.

При втором варианте на первой стадии катионит Солоза КГ 20 · 30 уравновешивают 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,10 + 0,05. В раствор ИЛ-1 β добавляют сульфат аммония до концентрации 2,2+ 0,1 М и наносят на катионит. Элюируют ИЛ-1β 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 7,90 + 0,05. Элюат подкисляют до pH 4,10-0,05 и наносят на катионит Солоза КГ 20 · 30, уравновешенный 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,10 + 0,05. Элюируют ИЛ-1β 0,050 + 0,002 М раствором триса. На третьей стадии хроматографической очистки ИЛ-1 β сорбировали на анионит Q целлюлоза, уравновешенный 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 9,50 + 0,05. После промывки сорбента тем же буфером ИЛ-1 β элюируют 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 8,00 + 0,05. In the second embodiment, in the first stage, Soloz KG 20 · 30 cation exchanger is balanced with 0.050 + 0.002 M trisacetate buffer pH 4.10 + 0.05. Ammonium sulfate is added to the IL-1 β solution to a concentration of 2.2+ 0.1 M and applied to cation exchange resin. Elute with IL-1β 0.050 + 0.002 M trisacetate buffer pH 7.90 + 0.05. The eluate is acidified to a pH of 4.10-0.05 and applied to cation exchanger Solosa KG 20 · 30, balanced with 0.050 + 0.002 M trisacetate buffer pH 4.10 + 0.05. Elute with IL-1β 0.050 + 0.002 M Tris solution. In the third stage of chromatographic purification, IL-1 β was sorbed onto anion exchange resin Q cellulose balanced with 0.050 + 0.002 M trisacetate buffer pH 9.50 + 0.05. After washing the sorbent with the same buffer IL-1 β, elute with 0.050 + 0.002 M trisacetate buffer pH 8.00 + 0.05.

На стадии обессоливания ИЛ-1 β наносили на сорбент Солоза КГ 20 · 30 при pH 4,10 + 0,05 и после промывки катионита 0,050 + 0,002 М раствором однозамещенного фосфата натрия pH 4,10 + 0,05 целевой продукт элюировали 0,050 + 0,002 М раствором двузамещенного фосфата натрия, содержащего 0,15 + 0,01 М хлористого натрия, получив таким образом готовый продукт в физиологическом буфере. At the desalination stage, IL-1 β was applied to the Soloz KG sorbent 20 × 30 at pH 4.10 + 0.05 and after washing the cation exchange resin with 0.050 + 0.002 M solution of monosubstituted sodium phosphate pH 4.10 + 0.05, the target product was eluted with 0.050 + 0.002 M solution of disubstituted sodium phosphate containing 0.15 + 0.01 M sodium chloride, thus obtaining the finished product in physiological buffer.

Технический уровень заявленного изобретения определяется условиями оригинального процесса обработки клеток Е.coli щелочью, который ранее для подобных целей не применялся. В результате указанного процесса получается раствор, обогащенный ИЛ-1 β и не содержащий растворимых нуклеаз. The technical level of the claimed invention is determined by the conditions of the original process of processing E. coli cells with alkali, which was not previously used for such purposes. As a result of this process, a solution is obtained enriched in IL-1 β and not containing soluble nucleases.

Благодаря этому полученная смесь после отделения нерастворимых продуктов стандартным методом (например, центрифугированием) может подвергаться более простой хроматографической очистке. В частности, удается исключить стадии обработки биомассы ультразвуком, осаждения нуклеиновых кислот полиэтиленимином, сульфатаммонийного осаждения белкового осадка, диализа белкового раствора, многократных центрифугирований для отделения твердой фазы, использовать только два сорбента и получить готовый препарат в физиологическом буфере. Дополнительными элементами, доказывающими новизну и технический уровень данной технологии, является новая совокупность используемых сорбентов и условий очистки. Due to this, the resulting mixture after separation of insoluble products by a standard method (for example, centrifugation) can be subjected to simpler chromatographic purification. In particular, it is possible to exclude the stages of sonication of biomass, deposition of nucleic acids by polyethyleneimine, ammonium sulfate precipitation of protein precipitate, dialysis of protein solution, multiple centrifugations to separate the solid phase, use only two sorbents and obtain the finished product in physiological buffer. Additional elements proving the novelty and technical level of this technology is a new combination of sorbents and cleaning conditions used.

В результате использования заявляемого изобретения удается сократить число стадий с 13 до 7, повысить выход на 20% и удельную активность с 1 · 10⁸ до 1,6 · 10⁸ ед/мг белка.As a result of using the claimed invention, it is possible to reduce the number of stages from 13 to 7, increase the yield by 20% and the specific activity from 1 · 10 ⁸ to 1.6 · 10 ⁸ units / mg of protein.

Сущность и преимущества способа иллюстрируются следующими примерами, в которых использовались штамм Е.coli С 600, содержащий рекомбинантную плазмиду pFR-TGATG-IL-I β, и промышленные ионообменники, разработанные в ГосНИИ особо чистых препаратов. The essence and advantages of the method are illustrated by the following examples, in which the E. coli strain C 600 was used, containing the recombinant plasmid pFR-TGATG-IL-I β, and industrial ion exchangers developed at the State Research Institute of Highly Clean Preparations.

П р и м е р 1. 600 + 20 г биомассы суспендировали в 600 + 20 мл 0,050 + 0,002 М трисацетатного буфера pH 8,0 + 0,1, содержащего 0,0020 + 0,0002 М PMSF и 0,0050 0,0005 М ЭДТА (лизисный буфер). Полученную суспензию подщелачивали при перемешивании 45 + 1% раствором гидроокиси натрия до pH 12,5 + 0,1 и инкубировали 20 + 2 мин. После этого суспензию подкисляли 1,0 + 0,1 М раствором соляной кислоты до pH 3,7 + 0,1 и отделяли нерастворимые продукты центрифугированием в течение 20 2 мин со скоростью 10000 + 100 g и температуре 4 + 2^оС.PRI me R 1. 600 + 20 g of biomass suspended in 600 + 20 ml of 0.050 + 0.002 M trisacetate buffer pH 8.0 + 0.1, containing 0.0020 + 0.0002 M PMSF and 0.0050 0, 0005 M EDTA (lysis buffer). The resulting suspension was made alkaline with stirring with 45 + 1% sodium hydroxide solution to pH 12.5 + 0.1 and incubated for 20 + 2 min. The suspension was acidified with 1.0 + 0.1 M hydrochloric acid to pH 3,7 + 0,1 and the insoluble materials were separated by centrifugation for 20 2 minutes at 10,000 g and 100 + 4 ° + 2 ° ^C.

Супернатант разводили в 1,5 раза дистиллированной водой до значения проводимости < 20 МСи/см и наносили на сорбент Солоза КГ 20 · 30 объемом 150 + 10 мл, предварительно уравновешенный 0,050 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,10 0,05. После промывки катионита тем же буфером ИЛ-1 β элюировали 0,050 + 0,002 М раствором триса. The supernatant was diluted 1.5 times with distilled water to a conductivity value of <20 MS / cm and applied to a Soloz KG 20 × 30 sorbent with a volume of 150 + 10 ml, previously equilibrated with 0.050 0.002 M trisacetate buffer pH 4.10 0.05. After washing the cation exchange resin with the same IL-1 buffer, β was eluted with a 0.050 + 0.002 M Tris solution.

Элюат подкисляли 50 + 1% раствором уксусной кислоты до pH 8,1, разводили дистиллированной водой в 2,5 раза до значения проводимости < 0,4 МСи/см и наносили на анионит Q целлюлоза объемом 150 + 10 мл, уравновешенный 0,010 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 8,10 + 0,05. После промывки сорбента тем же буфером ИЛ-1β элюировали 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 8,10 + 0,05. The eluate was acidified with a 50 + 1% solution of acetic acid to a pH of 8.1, diluted with distilled water 2.5 times to a conductivity value of <0.4 MS / cm and applied to anion exchange resin Q cellulose with a volume of 150 + 10 ml, balanced 0,010 + 0,002 M Trisacetate buffer pH 8.10 + 0.05. After washing the sorbent with the same IL-1β buffer, 0.050 + 0.002 M Trisacetate buffer pH 8.10 + 0.05 was eluted.

К элюату добавляли сульфат аммония до концентрации 2,2 + 0,1 М и наносили на катионит Солоза КГ 20 · 30 объемом 50 + 5 мл, предварительно уравновешенный 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,10 + 0,05. После промывки сорбента 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером, содержащим 2,2 + 0,1 М сульфата аммония, ИЛ-1β элюировали 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 7,90 + 0,05, содержащим 2,2 + 0,1 М сульфата аммония. Ammonium sulfate was added to the eluate to a concentration of 2.2 + 0.1 M and applied to Soloz KG 20 × 30 cation exchanger with a volume of 50 + 5 ml, previously equilibrated with 0.050 + 0.002 M with trisacetate buffer pH 4.10 + 0.05. After washing the sorbent with 0.050 + 0.002 M trisacetate buffer containing 2.2 + 0.1 M ammonium sulfate, IL-1β was eluted with 0.050 + 0.002 M trisacetate buffer pH 7.90 + 0.05 containing 2.2 + 0.1 M ammonium sulfate.

Элюат подкисляли до pH 4,10 + 0,05 50 1% раствором уксусной кислоты и с целью обессоливания наносили на катионит Солоза КГ 20 · 30 объемом 50 + 5 мл, уравновешенный 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,1 + 0,05. После промывки сорбента 0,050 + 0,002 М раствором однозамещенного фосфата натрия pH 4,10 + 0,05 ИЛ-1 β элюировали 0,050 + 0,002 М раствором двузамещенного фосфата натрия, содержащего 0,15 + 0,01 М хлористого натрия. The eluate was acidified to a pH of 4.10 + 0.05 50 with a 1% solution of acetic acid and, with the aim of desalting, it was applied to Soloz KG 20 × 30 cation exchanger with a volume of 50 + 5 ml, balanced with 0.050 + 0.002 M trisacetate buffer pH 4.1 + 0.05 . After washing the sorbent with 0.050 + 0.002 M solution of monosubstituted sodium phosphate, pH 4.10 + 0.05 IL-1 β was eluted with 0.050 + 0.002 M solution of disubstituted sodium phosphate containing 0.15 + 0.01 M sodium chloride.

Активность полученного таким образом ИЛ-1 β составляла 1,6 · 10⁸ единиц на мг белка (табл.1).The activity of IL-1 β thus obtained was 1.6 · 10 ⁸ units per mg of protein (Table 1).

Для оценки биологической активности интерлейкина-1 β использован метод костимуляции пpолиферации тимоцитов мышей. В качестве стандарта для определения единиц биологической активности интерлейкина-1β использован международный стандартный образец интерлейкина-1β 86/680 (National Institute for Biological Standards and Control, England). To evaluate the biological activity of interleukin-1 β, the method of costimulation of mouse thymocyte proliferation was used. An international standard sample of interleukin-1β 86/680 (National Institute for Biological Standards and Control, England) was used as a standard for determining the units of biological activity of interleukin-1β.

П р и м е р 2. В условиях примера I проводились эксперименты по проведению щелочной обработки при различных pH. Полученные результаты приведены в табл.2. PRI me R 2. Under the conditions of example I, experiments were carried out to conduct alkaline treatment at different pH. The results are shown in table.2.

П р и м е р 3. 600 + 20 г биомассы суспензировали в 600 + 20 мл лизисного буфера. Полученную суспензию подщелачивали при перемешивании 45 + 1% раствором гидроокиси натрия до pH 12,5 + 0,1 и инкубировали 20 + 2 мин. Затем суспензию подкисляли 1,0 + 0,1 М раствором соляной кислоты до pH 3,7 + 0,1 и центрифугировали в течение 20 + 2 мин с ускорением 10000 + 100 g при 4 + 2^о.PRI me R 3. 600 + 20 g of biomass was suspended in 600 + 20 ml of lysis buffer. The resulting suspension was made alkaline with stirring with 45 + 1% sodium hydroxide solution to pH 12.5 + 0.1 and incubated for 20 + 2 min. The suspension was then acidified with 1.0 + 0.1 M hydrochloric acid to pH 3,7 + 0,1 and centrifuged for 20 + 2 min at 10,000 g at + 4 100 + 2 ^o.

Супернатант разбавляли в 1,5 раза дистиллированной водой до значения проводимости < 20 МСи/см и наносили на сорбент Солоза КГ 20 · 30 объемом 150 + 10 мл, предварительно уравновешенный 0,05 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,01 + 0,05. После промывки сорбента тем же буфером ИЛ-1 β элюировали 0,050+ 0,002 М раствором триса. The supernatant was diluted 1.5 times with distilled water to a conductivity value of <20 MS / cm and applied to a Soloz KG 20 × 30 sorbent with a volume of 150 + 10 ml, previously equilibrated with 0.05 + 0.002 M trisacetate buffer pH 4.01 + 0.05 . After washing the sorbent with the same IL-1 buffer, β was eluted with 0.050+ of a 0.002 M Tris solution.

В элюате подводили pH до значения 8,10 + 0,05 50 +1% раствором уксусной кислоты, разбавляли в 2,5 раза дистиллированной водой до получения значения проводимости < 0,4 МСи/см и наносили на анионит Q-целлюлоза объемом 150 + 5 мл, уравновешенный 0,010 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 8,10-0,05. После промывки сорбента 0,020 + 0,002 М трис- ацетатным буфером pH 8,10 + 0,05 ИЛ-1β элюировали 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 8,10 + 0,05. В элюате растворяли сульфат аммония до концентрации 2,2 + + 0,01 М, подкисляли 50 + 1% раствором уксусной кислоты до pH 4,10 + 0,05 и наносили на сорбент Солоза КГ 20 · 30 объемом 50 + 2 мл, уравновешенный 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,10 + 0,05, содержащим 2,2 + 0,1 М сульфата аммония. После отмывки катионита 0,050 + 0,002 М раствором однозамещенного фосфата натрия pH 4,10 + 0,05 ИЛ-1 β элюировали 0,10 0,01 М раствором двузамещенного фосфата натрия. In the eluate, the pH was adjusted to a value of 8.10 + 0.05 50 + 1% acetic acid solution, diluted 2.5 times with distilled water to obtain a conductivity value <0.4 MS / cm and applied to 150-Q Q-cellulose anion exchange resin 5 ml, balanced with 0.010 + 0.002 M trisacetate buffer pH 8.10-0.05. After washing the sorbent with 0.020 + 0.002 M Tris-acetate buffer, pH 8.10 + 0.05 IL-1β was eluted with 0.050 + 0.002 M Tris-acetate buffer, pH 8.10 + 0.05. Ammonium sulfate was dissolved in the eluate to a concentration of 2.2 + +0.01 M, acidified with a 50 + 1% acetic acid solution to a pH of 4.10 + 0.05 and applied to a Solosa KG 20 × 30 sorbent with a volume of 50 + 2 ml, balanced 0.050 + 0.002 M trisacetate buffer pH 4.10 + 0.05 containing 2.2 + 0.1 M ammonium sulfate. After washing the cation exchanger with 0.050 + 0.002 M solution of monosubstituted sodium phosphate, pH 4.10 + 0.05 IL-1 β was eluted with 0.10 0.01 M solution of disubstituted sodium phosphate.

Активность полученного препарата ИЛ-1 β соответствовала 1,3 · 10⁸ единиц на мг белка.The activity of the obtained drug IL-1 β corresponded to 1.3 · 10 ⁸ units per mg of protein.

П р и м е р 4. 600 + 20 г биомассы суспендировали в 600 + 20 мл лизисного буфера. Полученную суспензию подщелачивали 45 + 1% раствором гидроокиси натрия при перемешивании до pH 12,5 + 0,1 и инкубировали 20 + 2 мин. Затем суспензию подкисляли 1,0 + 0,1 М раствором соляной кислоты до pH 3,7 + 0,1 и центрифугировали в течение 20 + 2 мин с ускорением 10000 + +100 g при 4 + 2^оС.PRI me R 4. 600 + 20 g of biomass suspended in 600 + 20 ml of lysis buffer. The resulting suspension was basified with 45 + 1% sodium hydroxide solution with stirring to a pH of 12.5 + 0.1 and incubated for 20 + 2 min. The suspension was then acidified with 1.0 + 0.1 M hydrochloric acid to pH 3,7 + 0,1 and centrifuged for 20 + 2 min at 10,000 + +100 g at 4 ^° C + 2

В супернатанте растворяли сульфат аммония до концентрации 2,2 + 0,1 М и наносили на сорбент Солоза КГ 20 · 30 объемом 150 + 10 мл, предварительно уравновешенный 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,10 + 0,05. После промывки сорбента 0,050 + 0,002 м трисацетатным буфером pH 4,10 + 0,05, содержащим 2,2 + 0,1 М сульфата аммония, ИЛ-1 β элюировали 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 7,90 + 0,05. Ammonium sulfate was dissolved in the supernatant to a concentration of 2.2 + 0.1 M and applied to the Soloz KG 20 × 30 sorbent with a volume of 150 + 10 ml, previously equilibrated with 0.050 + 0.002 M trisacetate buffer pH 4.10 + 0.05. After washing the sorbent with 0.050 + 0.002 m trisacetate buffer pH 4.10 + 0.05 containing 2.2 + 0.1 M ammonium sulfate, IL-1 β was eluted with 0.050 + 0.002 M trisacetate buffer pH 7.90 + 0.05.

В элюате подводили pH значения 4,10 + 0,05 50 + 1% раствором уксусной кислоты и наносили на сорбент Солоза КГ 20 · 30 объемом 50 + 5 мл, предварительно уравновешенную 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,10 + 0,05. После промывки сорбента этим же буфером ИЛ-1β элюировали 0,050 + 0,002 М раствором триса, добиваясь таким образом и обессоливания препарата. In the eluate, the pH was adjusted to 4.10 + 0.05 50 + 1% acetic acid solution and applied to the Soloz KG 20 × 30 sorbent with a volume of 50 + 5 ml, previously equilibrated with 0.050 + 0.002 M trisacetate buffer pH 4.10 + 0.05 . After washing the sorbent with the same buffer, IL-1β was eluted with a 0.050 + 0.002 M Tris solution, thus achieving desalination of the drug.

В элюате проверяли значение проводимости, которое не должно превышать 0,15 МСи/см, при необходимости подводили значение pH элюата до 9,50 + 0,05 и наносили на сорбент Q целлюлоза объемом 150 + + 10 мл, предварительно уравновешенный 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 9,50 + 0,05. После промывки сорбента этим же буфером ИЛ-1 β элюировали 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 8,00 + 0,05. In the eluate, the conductivity was checked, which should not exceed 0.15 MS / cm, if necessary, the pH of the eluate was adjusted to 9.50 + 0.05 and applied to sorbent Q cellulose with a volume of 150 + + 10 ml, previously balanced with 0.050 + 0.002 M Trisacetate buffer pH 9.50 + 0.05. After washing the sorbent with the same IL-1 buffer, β was eluted with 0.050 + 0.002 M trisacetate buffer pH 8.00 + 0.05.

Элюат подкисляли до pH 4,10 + 0,05 50 1% раствором уксусной кислоты и наносили с целью обессоливания на сорбент Солоза КГ 20 · 30 объемом 50 + 5 мл, уравновешенный 0,050 + 0,002 М трисацетатным буфером pH 4,10 + 0,05. После промывки сорбента 0,050 + 0,002 М раствором однозамещенного фосфата натрия pH 4,10 + 0,05 ИЛ-1 β элюировали 0,050 + 0,002 М раствором двузамещенного фосфата натрия, содержащего 0,15 + 0,01 М хлористого натрия. The eluate was acidified to pH 4.10 + 0.05 50 with a 1% solution of acetic acid and applied with the aim of desalination to a Soloz KG 20 × 30 sorbent with a volume of 50 + 5 ml, balanced with 0.050 + 0.002 M trisacetate buffer pH 4.10 + 0.05 . After washing the sorbent with 0.050 + 0.002 M solution of monosubstituted sodium phosphate, pH 4.10 + 0.05 IL-1 β was eluted with 0.050 + 0.002 M solution of disubstituted sodium phosphate containing 0.15 + 0.01 M sodium chloride.

Активность полученного таким образом ИЛ-1 β составляла 1,6 единиц на мг белка (табл.4). The activity of IL-1 β thus obtained was 1.6 units per mg of protein (Table 4).

Как показали приведенные эксперименты предложенная технология является оптимальной и позволяет получить целевой продукт, а именно высокоочищенный человеческий рекомбинантный интерлейкин с активностью 1,6 · 10⁸ единиц на мг белка в препаративных масштабах в 7 стадий вместо 13.As shown by the experiments, the proposed technology is optimal and allows you to get the target product, namely highly purified human recombinant interleukin with an activity of 1.6 · 10 ⁸ units per mg of protein in preparative scales in 7 stages instead of 13.

Claims

1. METHOD FOR ISOLATING RECOMBINANT INTERLEUKIN-1 β FROM MICROORGANISM BIOMASS, including destruction of cells of the E. coli strain producing the recombinant protein, separation of cell walls and purification of the target product by multistage chromatography using Solose KG cationite 30, which cell destruction is carried out by an alkaline agent at pH 12 - 13, chromatographic purification is carried out in three stages, one of which is carried out using Q-cellulose anion exchanger, and two - using Co cation exchanger vine KG 20 x 30, and one of the two stages of purification on cation exchange resin is carried out in the presence of ammonium sulfate, and the final product is desalted.

2. The method according to claim 1, characterized in that a solution of sodium hydroxide is used as the alkaline agent.

3. The method according to claims 1 and 2, characterized in that Q-cellulose is used in the second stage of chromatographic purification, and sorption of interleukin-1 b is carried out from (0.01 ± 0.002) M trisacetate buffer at pH 8.1 ± 0, 05, the sorbent is washed with the same buffer, and the protein is eluted by increasing the ionic strength of the buffer solution to (0.05 ± 0.002) M at the same pH value.

4. The method according to PP. 1 - 3, characterized in that at the first stage of chromatographic purification using cation exchange resin Solozu KG 20 x 30, and sorption is carried out from (0.05 ± 0.02) M trisacetate buffer with a pH of 4.1 ± 0.05, the sorbent is washed with the same solution, and the target product is eluted with (0.05 ± 0.002) M Tris solution.

5. The method according to claims 1 to 4, characterized in that the third stage of chromatographic purification is carried out on Soloz KG cation exchanger 20 x 30, balanced (0.05 ± 0.002) M with trisacetate buffer with a pH of 4.1 ± 0.05, sorption is carried out from a solution of interleukin - 1 b containing (2.2 ± 0.1) M ammonium sulfate, the cation exchange resin is washed with (0.05 ± 0.002) M trisoacetate buffer containing (2.2 ± 0.1) M ammonium sulfate, while the same pH, and the protein is eluted by increasing the pH of the solution to 7.9 ± 0.05.

6. The method according to claims 1 and 2, characterized in that ammonium sulfate is introduced into a crude preparation of interleukin-1 β to a concentration of (2.2 ± 0.1) M, the pH is adjusted to a value of 4.1 ± 0.05 and applied on the Solosa KG sorbent 20 x 30, balanced (0.05 ± 0.002) M with trisacetate buffer with a pH of 4.1 ± 0.05, and after washing the sorbent (0.05 ± 0.002) with M trisacetate buffer containing (2.2 ± 0.1) M ammonium sulfate, the protein is eluted with (0.05 ± 0.0002) M trisoacetate buffer with a pH of 7.9 ± 0.05 containing (2.2 ± 0.1) M ammonium sulfate.

7. The method according to PP.1 and 2, characterized in that the second stage of chromatographic purification is carried out on cation exchange resin Solosa KG 20 x 30, balanced (0.05 ± 0.002) M trisacetate buffer with a pH of 4.1 ± 0.05, eluate, obtained at the first stage, before application to the sorbent, acidify to pH 4.1 ± 0.05, the sorbent is washed (0.05 ± 0.002) with M trisacetate buffer with a pH of 4.1 ± 0.05, and the protein is eluted (0.05 ± 0.002) M Tris solution.

8. The method according to claims 1 and 2, characterized in that in the third stage of chromatographic purification using Q-cellulose, balanced (0.05 ± 0.002) M with trisacetate buffer with a pH of 9.5 ± 0.05, on which the eluate is applied, obtained in the second stage, the sorbent is washed with (0.05 ± 0.002) M trisoacetate buffer with a pH of 9.5 ± 0.05, and interleukin elute (0.05 ± 0.002) M trisacetate buffer with a pH of 8.0 ± 0.05.

9. The method according to claim 1, characterized in that the desalination is carried out on Soloz KG cation exchanger 20 x 30, balanced (0.05 ± 0.002) M with trisacetate buffer with a pH of 4.1 ± 0.05, onto which the eluate obtained is applied. the third stage of chromatographic purification and acidified to pH 4.1 ± 0.05, the sorbent is washed (0.05 ± 0.002) with a solution of monosubstituted sodium phosphate with a pH of 4.1 ± 0.05, and the protein is eluted (0.05 ± 0.002) M a solution of disubstituted sodium phosphate containing (0.15 ± 0.01) M sodium chloride.