RU2107296C1

RU2107296C1 - Method of electrochemical indication of immuno-chemically active macromolecules in examined solutions

Info

Publication number: RU2107296C1
Application number: RU97102274A
Authority: RU
Inventors: Дмитрий Александрович ФАРМАКОВСКИЙ; Евгений Юрьевич Милановский; Владимир Рюрикович Черкасов; Юрий Сергеевич БИРЮКОВ; Борис Владимирович Комаров
Original assignee: Дмитрий Александрович ФАРМАКОВСКИЙ; Евгений Юрьевич Милановский; Владимир Рюрикович Черкасов; Юрий Сергеевич БИРЮКОВ; Борис Владимирович Комаров
Priority date: 1997-02-20
Filing date: 1997-02-20
Publication date: 1998-03-20
Also published as: AU6300598A; WO1998037409A1

Abstract

FIELD: medicine, pharmacology, biotechnology, agriculture. SUBSTANCE: method of electrochemical indication of immuno-chemically active macromolecules in examined solution provides for formation of immuno-sensitive sensor with membrane carrying specific receptors immobilized in it, composition of electrochemical measurement cell from immuno- sensitive sensor and comparison electrode coupled by measurement instrument, placement of the latter into working solution and determination of shift of value of isoelectric point of membrane depending on content of determined macromolecules in examined solution by measuring voltage across cell under stepped change of ion intensity of working solution. Membrane is formed from electrically conductive polymer by method of electrochemical synthesis from solution of monomer with specific receptors placed in it on surface of electrode for potentiometric measurements. For determination of shift of value of isoelectric point of membrane examined solution with ion intensity higher than that of working solution is added into working solution under constant value of pH of working solution. EFFECT: simplification and reduced cost of method, diminished time of analysis, raised sensitivity of analysis and authenticity of results. 10 cl, 4 dwg

Description

Изобретение относится к области медицины, а также к фармакологии, биотехнологии, сельскому хозяйству, экологии, а именно к способам лабораторных исследований и анализов различных биологических жидкостей - сывороток крови, лимфы, мочи, слюны и пр., проводимых с целью медицинской диагностики, производственного и экологического мониторинга объектов как природного, так и искусственного происхождения. The invention relates to medicine, as well as to pharmacology, biotechnology, agriculture, ecology, and in particular to methods of laboratory research and analysis of various biological fluids - blood serum, lymph, urine, saliva, etc., carried out for the purpose of medical diagnostics, production and environmental monitoring of objects of both natural and artificial origin.

Под иммунохимически активными макромолекулами (далее макромолекулами) или антигенами (Ag) следует понимать такие макромолекулы природного и искусственного происхождения, которые при проникновении в организм высшего животного (включая и человека) вызывают образование в организме специальных белковых молекул - "антител" (Ag), обладающих способностью специфически связывать антиген с образованием слабодиссоциирующего комплекса. Антитела тоже могут являться антигенами. By immunochemically active macromolecules (hereinafter macromolecules) or antigens (Ag), it is understood that such macromolecules are of natural and artificial origin that, when penetrated into the body of a higher animal (including humans), cause the formation of special protein molecules in the body - “antibodies” (Ag), which have the ability to specifically bind antigen with the formation of a weakly dissociating complex. Antibodies can also be antigens.

Схематично реакцию взаимодействия антигена с антителом можно представить с следующем виде:
Ab + Ag = AbAg.Schematically, the reaction of the interaction of antigen with antibody can be represented as follows:
Ab + Ag = AbAg.

Константа равновесия этой реакции определяется как:
K = [AbAg]/[Ab][Ag].The equilibrium constant of this reaction is defined as:
K = [AbAg] / [Ab] [Ag].

Отсюда при фиксированной концентрации антитела равновесное отношение концентраций связанного и свободного антигенов количественно связано с общей концентрацией антигена. Это соотношение лежит в основе всех иммунохимических методов индикации антигенов и антител. Hence, at a fixed concentration of antibodies, the equilibrium ratio of the concentrations of bound and free antigens is quantitatively related to the total concentration of antigen. This ratio underlies all immunochemical methods for indicating antigens and antibodies.

Одним из основных методов индикации является твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), основанный на взаимодействии иммобилизованного на твердой фазе антигена (или антитела) со специфическим к нему антителом (антигеном) с последующим разделением связанного и свободного компонентов иммунохимической пары и использовании меченных ферментной меткой антител для выявления связанного компонента. One of the main methods of indication is enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), based on the interaction of the antigen (or antibody) immobilized on the solid phase with a specific antibody (antigen), followed by separation of the bound and free components of the immunochemical pair and the use of enzyme-labeled antibodies to detect related component.

Существенный недостаток этого метода - длительность проведения аналитических операций. Время осуществления большинства методов ИФА составляет 24 и более, что связано с необходимостью проведения ряда последовательных иммунохимических реакций, а также регистрации ферментативной активности. A significant drawback of this method is the duration of the analytical operations. The implementation time of most ELISA methods is 24 or more, which is associated with the need for a series of sequential immunochemical reactions, as well as registration of enzymatic activity.

Другой недостаток этого метода - необходимость использования значительного количества специальной аппаратуры и реагентов: микротитрационных планшетов, промывателей, термостатов, красителей, приборов для регистрации активности ферментной метки и т.п., что сказывается на трудоемкости и себестоимости анализа. Another disadvantage of this method is the need to use a significant amount of special equipment and reagents: microtiter plates, washers, thermostats, dyes, devices for recording enzyme label activity, etc., which affects the complexity and cost of analysis.

Подобные недостатки характерны и для методов, основанных на использовании и других меток: флюоресцентных, хемилюминесцентных, радионуклидных и др. Поэтому к настоящему времени появился ряд работ, в которых предпринимаются попытки объединить иммунохимические методы индикации макромолекул с электрохимическими способами детектирования, что связано с их относительно простотой и невысокой стоимостью в электрохимическом иммуноанализе. (Грин М. Дж. Новые подходы. Биосенсоры : Основы и приложения М.: Мир, 1992). Similar disadvantages are also characteristic of methods based on the use of other labels: fluorescent, chemiluminescent, radionuclide, etc. Therefore, a number of studies have appeared to date which attempt to combine the immunochemical methods of indicating macromolecules with electrochemical detection methods, due to their relatively simplicity and low cost in electrochemical immunoassay. (Green M.J. New approaches. Biosensors: Fundamentals and applications of M .: Mir, 1992).

Основной проблемой, с которой приходится сталкиваться авторам этих работ, является то, что образование комплекса антиген-антитело не сопровождается каким-либо переносом электричества, которое может быть зарегистрировано при помощи простых амперометрических (измеряющих величину силы тока) измерительных систем. The main problem that the authors of these works have to deal with is that the formation of the antigen-antibody complex is not accompanied by any transfer of electricity, which can be detected using simple amperometric (measuring current strength) measuring systems.

В связи с этим большинству авторов приходится вводить в электрохимическую измерительную систему меченные ферментной меткой антитела и осуществлять амперометрическое детектирование продуктов ферментной реакции после образования комплекса антиген-антитело. Следует отметить, что методы с использованием амперометрических систем имеют те же недостатки, что и классический иммуноферментный способ детектирования [Aizawa M. et al, Enzyme Immunosensor, III. Amperometric determination of human chorionic gonadotropin by membrane bound antibody. Analitical Biochemistry, 94, 22-8, 1979]. In this regard, most authors have to introduce antibodies labeled with the enzyme label into the electrochemical measuring system and carry out amperometric detection of the enzyme reaction products after the formation of the antigen-antibody complex. It should be noted that methods using amperometric systems have the same disadvantages as the classical enzyme-linked immunosorbent detection method [Aizawa M. et al, Enzyme Immunosensor, III. Amperometric determination of human chorionic gonadotropin by membrane bound antibody. Analitical Biochemistry, 94, 22-8, 1979].

Использование потенциометрических методов (измеряющих величину электрохимического потенциала) для индикации макромолекул основано на предпосылке, что в водных растворах белки являются полиэлектролитами, поэтому взаимодействие антигена и антитела должно изменять их заряд. The use of potentiometric methods (measuring the magnitude of the electrochemical potential) for indicating macromolecules is based on the premise that proteins are polyelectrolytes in aqueous solutions; therefore, the interaction of an antigen and an antibody should change their charge.

Однако применение потенциометрических датчиков, модифицированных антителами или антигенами, для непосредственного определения в растворах иммунохимически активных макромолекул показало, что подобные детектирующие системы отличаются низкой чувствительностью и крайне низкой специфичностью, что связано с высоким уровнем неспецифических взаимодействий компонентов исследуемых растворов с поверхностями датчиков (Yamamoto N et al, Potentimetric investigations of antigen-antibody and enzyme-enzyme inhibitor reactions using chemically modified metal electrodes. J. of Jmmunology Methads, 22, 309-17, 1978). However, the use of potentiometric sensors modified with antibodies or antigens for direct determination of immunochemically active macromolecules in solutions showed that such detection systems are characterized by low sensitivity and extremely low specificity, which is associated with a high level of nonspecific interactions of the components of the studied solutions with the surfaces of the sensors (Yamamoto N et al , Potentimetric investigations of antigen-antibody and enzyme-enzyme inhibitor reactions using chemically modified metal electrodes. J. of Jmmunology Methads, 22, 309-17, 1978).

Наиболее перспективными представляются электрохимические способы индикации макромолекул в растворах, основанные на регистрации изменения изоэлектрической точки антител или антигенов вследствие образования ими комплексов в ходе иммунохимической реакции. The most promising are electrochemical methods for indicating macromolecules in solutions based on recording changes in the isoelectric point of antibodies or antigens due to their formation of complexes during the immunochemical reaction.

Под изоэлектрической точкой белка понимают такую величину pH белкового раствора, при которой молекулы белка имеют суммарный нулевой заряд. При смещении величины pH раствора от значения, соответствующего изоэлектрической точке белка, в кислую или щелочную область белковая молекула будет приобретать соответственно положительный или отрицательный заряд. Поскольку взаимодействующие антиген и антитело, как правило, имеют разные значения изоэлектрической точки, то образовавшийся в ходе иммунохимической реакции комплекс антиген-антитело будет иметь значение изоэлектрической точки, отличающееся от исходных значений последних. Регистрация изменения изоэлектрической точки антител и антигенов вследствие иммунохимических реакций может быть осуществлена методом ионного удара (the ion-step procedure). При этом используется ионочувствительный датчик, модифицированный антителами или антигенами (Bergveld P. , A critical evaluation of direct electrical protein detection methods. Biosensors and Bioelectronics, 6, 1991). Under the isoelectric point of a protein is meant such a pH of the protein solution at which the protein molecules have a total zero charge. When the pH of the solution shifts from the value corresponding to the isoelectric point of the protein to the acidic or alkaline region, the protein molecule will acquire a positive or negative charge, respectively. Since the interacting antigen and antibody, as a rule, have different values of the isoelectric point, the antigen-antibody complex formed during the immunochemical reaction will have an isoelectric point value that differs from the initial values of the latter. Registration of changes in the isoelectric point of antibodies and antigens due to immunochemical reactions can be carried out by the ion impact method (the ion-step procedure). An ion-sensitive sensor modified with antibodies or antigens is used (Bergveld P., A critical evaluation of direct electrical protein detection methods. Biosensors and Bioelectronics, 6, 1991).

Известен способ электрохимической индикации иммунохимически активных макромолекул в растворах при помощи иммуночувствительного сенсора [1, 2, 3]. A known method of electrochemical indication of immunochemically active macromolecules in solutions using an immunosensitive sensor [1, 2, 3].

Способ основан на определении смещения значения изоэлектрической точки мембраны, размещенной на электрохимическом датчике и включающей соответствующие рецепторы, после взаимодействия последних с макромолекулами. При этом полагают, что заряд мембраны однозначно определяется зарядом расположенных в ней рецепторов и что при фиксированном времени взаимодействия величина смещения значения изоэлектрической точки пропорциональна содержанию макромолекул в исследуемом растворе. The method is based on determining the bias of the value of the isoelectric point of the membrane located on the electrochemical sensor and including the corresponding receptors, after the interaction of the latter with macromolecules. It is believed that the charge of the membrane is uniquely determined by the charge of the receptors located in it and that, for a fixed interaction time, the shift in the value of the isoelectric point is proportional to the content of macromolecules in the test solution.

Данный способ заключается в следующем. This method is as follows.

1. На поверхности электрохимического датчика - ионоселективного полевого транзистора (ИСПТ) формируют в результате химического синтеза проницаемую для ионов мембраны из латекса и агарозы. 1. On the surface of an electrochemical sensor - an ion-selective field effect transistor (ISPT) as a result of chemical synthesis, an ion-permeable membrane of latex and agarose is formed.

2. Проводят иммобилизацию в мембрану соответствующих рецептов (антигенов или антител), приводя ИСПТ с мембраной в контакт с раствором рецепторов, получая таким образом иммуночувствительный сенсор. 2. Immobilization of the corresponding recipes (antigens or antibodies) into the membrane is carried out, bringing the ISPT with the membrane into contact with the receptor solution, thereby obtaining an immunosensitive sensor.

3. Составляют электрохимическую измерительную ячейку, помещая связанные между собой электрическим измерительным прибором иммуночувствительный сенсор и электрод сравнения в емкость, через которую прокачивается рабочий раствор. 3. An electrochemical measuring cell is made by placing an immunosensitive sensor and a reference electrode connected together by an electric measuring device in a container through which the working solution is pumped.

4. Плавно изменяют pH рабочего раствора при помощи градиентного смесителя, смещая pH из кислой или нейтральной области в щелочную. 4. Smoothly change the pH of the working solution using a gradient mixer, shifting the pH from the acidic or neutral to alkaline.

5. В ходе выполнения п.4 периодически ступенчато изменяют ионную силу рабочего раствора путем введения в последний солевого раствора с большей, чем у рабочего раствора, ионной силой. 5. During the implementation of claim 4, the ionic strength of the working solution is periodically changed stepwise by introducing into the last salt solution with a greater ionic strength than that of the working solution.

6. В ходе выполнения пп. 4 и 5 при помощи электрического измерительного прибора измеряют величину напряжения на электрохимической ячейке, а также при помощи pH-метра величину pH рабочего раствора. 6. During the implementation of paragraphs. 4 and 5, using an electric measuring device, measure the voltage across the electrochemical cell, and also using a pH meter, the pH of the working solution.

7. В ходе выполнения п.6 строят график зависимости величины напряжения на электрохимической ячейке от величины pH рабочего раствора путем непрерывной регистрации при помощи соединенного с измерительным прибором двухкоординатного самописца значений величин напряжения и pH. 7. During the implementation of claim 6, a graph is plotted of the voltage on the electrochemical cell versus the pH of the working solution by continuous recording of voltage and pH values connected to a measuring device with a two-coordinate recorder.

8. Находят на графике, полученном после выполнения п.7, точку пересечения в осью абсцисс, которую определяют как изоэлектрическую точку мембраны с иммобилизованными рецепторами. Инкубируют в течение фиксированного отрезка времени иммуночувствительный сенсор с мембраной, содержащей рецепторы, в растворе, содержащем известное количество специфичных к рецепторам макромолекул. 8. Find on the graph obtained after performing paragraph 7, the intersection point in the abscissa axis, which is defined as the isoelectric point of the membrane with immobilized receptors. An immunosensitive sensor with a membrane containing receptors is incubated for a fixed period of time in a solution containing a known amount of receptor-specific macromolecules.

9. Инкубируют в течение фиксированного отрезка времени иммуночувствительный сенсор с мембраной, содержащей рецепторы, с раствором, содержащим известное количество специфичных к рецепторам макромолекул. 9. Incubate for a fixed period of time an immunosensitive sensor with a membrane containing receptors, with a solution containing a known amount of specific for the receptor macromolecules.

10. По завершении выполнения п.9 выполняют пп.3-8. 10. Upon completion of paragraph 9, perform paragraphs 3-8.

11. Определяют величину смещения значения изоэлектрической точки мембраны вследствие взаимодействия рецепторов с макромолекулами. 11. Determine the magnitude of the shift in the value of the isoelectric point of the membrane due to the interaction of receptors with macromolecules.

12. Последовательно выполняют пп. 3-11, используя при этом растворы с различным содержанием специфических макромолекул, и строят калибровочный график зависимости величины смещения значения изоэлектрической точки мембраны от концентрации макромолекул в растворе. 12. Consistently perform paragraphs. 3-11, using solutions with different contents of specific macromolecules, and build a calibration graph of the bias value of the value of the isoelectric point of the membrane on the concentration of macromolecules in the solution.

13. Полученный калибровочный график используют затем для определения содержания макромолекул в различных исследуемых растворах. 13. The resulting calibration graph is then used to determine the content of macromolecules in various test solutions.

Описанный выше способ имеет ряд недостатков:
высокая стоимость анализа, что обусловлено использованием в качестве электрохимического датчика ИСПТ и, соответственно, сложного прибора для измерения напряжения на измерительной ячейке с ИСПИ, а также другого дорогостоящего оборудования - проточной ячейки сложной конструкции, перистальтических насосов для прокачивания рабочего раствора и раствора с высокой ионной силой, смесителя для создания градиента pH, pH-метра;
высокая трудоемкость и низкая технологичность процесса нанесения на затвор ИСПТ проницаемой для ионов мембраны;
высокая вероятность получения невоспроизводимых результатов вследствие отсутствия контроля за свойствами мембраны в ходе химического синтеза и контроля процесса иммобилизации рецепторов;
значительная продолжительность анализа за счет того, что процесс взаимодействия рецепторов с макромолекулами разнесен во времени и пространстве с процессом собственно электрохимического измерения.The method described above has several disadvantages:
the high cost of analysis, which is due to the use of an ISPT as an electrochemical sensor and, accordingly, a complex device for measuring voltage on a measuring cell with ISPI, as well as other expensive equipment - a flow cell of complex design, peristaltic pumps for pumping a working solution and a solution with high ionic strength a mixer to create a pH gradient, pH meter;
high complexity and low adaptability of the process of applying an ion-permeable membrane to the ISPT gate;
a high probability of obtaining irreproducible results due to the lack of control over the properties of the membrane during chemical synthesis and control of the process of immobilization of receptors;
a significant analysis duration due to the fact that the process of interaction of receptors with macromolecules is separated in time and space with the process of the actual electrochemical measurement.

Все эти недостатки делают данный способ мало пригодным для использования его в качестве альтернативы традиционным методам индикации макромолекул. All these disadvantages make this method not very suitable for use as an alternative to traditional methods of indicating macromolecules.

Технический результат, достигается заявленным изобретением, заключается в разработке способа электрохимической индикации иммунохимически активных макромолекул, в значительной степени лишенного недостатков, характерных для способа, описанного выше, а именно в его упрощении и удешевлении, уменьшении времени проведения и увеличении чувствительности анализа, повышении достоверности получаемых результатов. The technical result achieved by the claimed invention consists in developing a method for the electrochemical indication of immunochemically active macromolecules, largely devoid of the disadvantages characteristic of the method described above, namely, its simplification and cheapening, reducing the time and increasing the sensitivity of the analysis, increasing the reliability of the results .

Сущность изобретения заключается в достижении упомянутого технического результата в способе электрохимической индикации иммунохимически активных макромолекул в исследуемых растворах, предусматривающем формирование иммуноспецифического сенсора с мембраной с иммобилизованными в нее специфическими рецепторами, составление электрохимической измерительной ячейки из связанных измерительным прибором иммуночувствительного сенсора и электрода сравнения, помещение последних в рабочий раствор, определения смещения изоэлектрической точки мембраны путем измерения напряжения на ячейке при ступенчатом изменении ионной силы рабочего раствора, в котором мембрану формируют из электропроводящего полимера путем его электрохимического синтеза из раствора мономера с помещенными в последний специфическими рецепторами на поверхности электрода для потенциометрических измерений, при этом для определения смещения изоэлектрической точки мембраны добавляют в рабочий раствор исследуемый раствор с большей, чем у рабочего раствора, ионной силой при постоянном значении pH рабочего раствора. The essence of the invention is to achieve the mentioned technical result in a method for electrochemical indication of immunochemically active macromolecules in the studied solutions, which provides for the formation of an immunospecific sensor with a membrane with specific receptors immobilized in it, compiling an electrochemical measuring cell from an immunosensitive sensor and a reference electrode connected to the measuring device, placing the latter in a working working electrode solution, determination of isoelectric t displacement cell membrane by measuring the voltage across the cell with a stepwise change in the ionic strength of the working solution, in which the membrane is formed from an electrically conductive polymer by electrochemical synthesis from a monomer solution with specific receptors placed on the electrode surface for potentiometric measurements, while determining the bias of the membrane isoelectric point add the test solution with a greater ionic strength than the working solution at a constant pH value solution.

Более подробно изобретение заключается в следующем:
1 В качестве электрохимического датчика используют электрод для потенциометрических измерений. Электрод может иметь произвольную форму и может быть выполнен из любого материала, обладающего металлической проводимостью и устойчивого в водных растворах.In more detail, the invention is as follows:
1 An electrode for potentiometric measurements is used as an electrochemical sensor. The electrode may have an arbitrary shape and may be made of any material with metallic conductivity and stable in aqueous solutions.

Это позволяет существенно снизить стоимость анализа за счет использования менее дорогого по сравнению с ИСПТ электрохимического датчика, а также за счет того, что появляется возможность использования в качестве измерительного прибора стандартных и недорогих приборов для потенциометрии. This allows to significantly reduce the cost of analysis due to the use of an electrochemical sensor less expensive than the ISPT, as well as due to the fact that it becomes possible to use standard and inexpensive devices for potentiometry as a measuring device.

2. Мембрану на поверхности электрохимического датчика формируют из электропроводящего полимера путем электрохимического синтеза. Мембрана из электропроводящего полимера выполняет при этом двоякую функцию, обеспечивая, с одной стороны, фиксацию рецепторов на поверхности электрохимического датчика и, с другой стороны, чувствительность электрохимического датчика к изменению ионной силы раствора. 2. The membrane on the surface of the electrochemical sensor is formed from an electrically conductive polymer by electrochemical synthesis. The membrane of the electrically conductive polymer performs a dual function, providing, on the one hand, the fixation of receptors on the surface of the electrochemical sensor and, on the other hand, the sensitivity of the electrochemical sensor to changes in the ionic strength of the solution.

3. Иммобилизацию рецептора в мембрану проводят одновременно с электрохимическим синтезом мембраны, что позволяет контролировать процесс иммобилизации. 3. The immobilization of the receptor in the membrane is carried out simultaneously with the electrochemical synthesis of the membrane, which allows you to control the process of immobilization.

Это позволяет существенно поднять технологичность процесса изготовления иммуночувствительного сенсора, упростить и удешевить его конструкцию, а использование электрохимического синтеза для формирования мембраны позволяет не только строго контролировать ее свойства, но и управлять ими (например, проводимостью и чувствительностью к ионам). Все это в конечном итоге ведет к снижению стоимости анализа и способствует повышению воспроизводимости получаемых результатов. This allows one to significantly increase the manufacturability of the process of manufacturing an immunosensitive sensor, simplify and reduce the cost of its design, and the use of electrochemical synthesis to form a membrane allows not only strictly controlling its properties, but also controlling them (for example, conductivity and sensitivity to ions). All this ultimately leads to a decrease in the cost of analysis and helps to increase the reproducibility of the results.

4. Измерения величины напряжения на электрохимической измерительной ячейке проводят при фиксированном значении pH рабочего раствора за счет использования в качестве последнего растворов с высокой буферной емкостью. 4. Measurements of the magnitude of the voltage at the electrochemical measuring cell is carried out at a fixed pH of the working solution due to the use of solutions with a high buffer capacity as the last.

Это позволяет при осуществлении заявленного способа обойтись без дорогостоящего оборудования для изменения и контроля pH рабочего раствора и проточных ячеек, увеличивая тем самым технологичность и экспрессность анализа, существенно снижая его стоимость и увеличивая достоверность получаемых результатов за счет элиминирования погрешностей, связанных с изменением и контролем pH. This allows the implementation of the claimed method to dispense with expensive equipment for changing and controlling the pH of the working solution and flow cells, thereby increasing the manufacturability and expressness of the analysis, significantly reducing its cost and increasing the reliability of the results by eliminating errors associated with changing and controlling the pH.

5. В качестве раствора с большей, чем у рабочего раствора, ионной силой используют раствор, содержащий макромолекулы, специфичные к биорецепторам на электрохимическом датчике. 5. As a solution with a greater ionic strength than that of the working solution, a solution containing macromolecules specific for bioreceptors on an electrochemical sensor is used.

Это ведет к существенному уменьшению времени проведения анализа за счет совмещения во времени и пространстве процесса взаимодействия рецепторов с макромолекулами и процесса электрохимического измерения. This leads to a significant reduction in the analysis time due to the combination in time and space of the process of interaction of receptors with macromolecules and the process of electrochemical measurement.

6. О величине смещения значения изоэлектрической точки мембраны в результате взаимодействия рецепторов с макромолекулами судят по характеру изменения величины напряжения на электрохимической ячейке во время и после взаимодействия электрохимического датчика с раствором с большей, чем у рабочего раствора, ионной силой, содержащим макромолекулы, специфичные к рецепторам на сенсоре. 6. The magnitude of the shift in the value of the isoelectric point of the membrane as a result of the interaction of receptors with macromolecules is judged by the nature of the change in the voltage on the electrochemical cell during and after the interaction of the electrochemical sensor with a solution with a greater ionic strength than macromolecules specific for receptors macromolecules on the sensor.

Заявленный способ поясняется чертежами, где изображены основные этапы его осуществления. The claimed method is illustrated by drawings, which depict the main stages of its implementation.

Фиг. 1 - формирование на поверхности электрохимического датчика 1 ионочувствительной мембраны из электропроводящего полимера 2 с рецепторами 3;
фиг. 2 - составление электрохимической ячейки, где 4 - электрохимический датчик с мембраной, 5 - электрод сравнения, 6 - измерительный прибор, 7 - регистратор, 8 - рабочий раствор;
фиг. 3 - введение в электрохимическую ячейку раствора 9, содержащего макромолекулы 10, специфичные к рецепторам на сенсоре;
фиг. 4 - графики изменения величины напряжения на электрохимической ячейке во время взаимодействия иммуночувствительного сенсора с раствором, содержащим макромолекулы, специфичные к рецепторам на сенсоре в различной концентрации 11 - 13 и с раствором, не содержащим макромолекул, специфичных к рецепторам на сенсоре 14.FIG. 1 - the formation on the surface of the electrochemical sensor 1 of an ion-sensitive membrane of an electrically conductive polymer 2 with receptors 3;
FIG. 2 - compilation of an electrochemical cell, where 4 is an electrochemical sensor with a membrane, 5 is a reference electrode, 6 is a measuring device, 7 is a recorder, 8 is a working solution;
FIG. 3 - introduction into the electrochemical cell of a solution 9 containing macromolecules 10 specific for receptors on the sensor;
FIG. 4 are graphs of changes in the magnitude of the voltage across the electrochemical cell during the interaction of the immunosensitive sensor with a solution containing macromolecules specific for receptors on the sensor at various concentrations 11 - 13 and with a solution not containing macromolecules specific for receptors on the sensor 14.

Новизна заявленного технического решения состоит в том, что заявителем предложен новый способ с новой совокупностью признаков, отличающихся от прототипа. The novelty of the claimed technical solution is that the applicant proposed a new method with a new set of features that differ from the prototype.

Все признаки, характеризующие заявленный объект и внесенные в формулу изобретения, являются существенными, т.к. только благодаря их совокупности достигается тот положительный эффект, который ожидается от использования заявленного технического решения. All the signs characterizing the claimed object and included in the claims are essential, because only thanks to their combination is achieved the positive effect that is expected from the use of the claimed technical solution.

Кроме того, указанные отличительные признаки проявляют новые свойства, не известные в науке и технике. In addition, these distinguishing features exhibit new properties not known in science and technology.

Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения "новизна", "положительный эффект" и "существенные отличия". Thus, this technical solution meets the criteria of the invention of "novelty", "positive effect" and "significant differences".

Заявленный способ осуществляют следующим образом. The claimed method is as follows.

1. Формируют на поверхности электрода для потенциометрических измерений мембраны из электропроводящего полимера. 1. Form on the surface of the electrode for potentiometric measurements of a membrane of an electrically conductive polymer.

Основными требованиями, предъявляемыми к электроду, используемому для осуществления заявленного способа, являются наличие металлической или квазиметаллической проводимости и устойчивость в водных средах. В качестве электрода можно использовать как стандартные потенциометрические электроды, пригодные для биохимических исследований, так и специально сконструированные для осуществления заявленного способа (Хаваш Е., Ионо- и молекулярно-селективные электроды в биохимических системах. М.: Мир, 1988). The main requirements for the electrode used to implement the claimed method are the presence of metallic or quasi-metallic conductivity and stability in aqueous media. As the electrode, you can use both standard potentiometric electrodes suitable for biochemical studies, and specially designed to implement the claimed method (Havash E., Ion - and molecular-selective electrodes in biochemical systems. M .: Mir, 1988).

Формирование мембраны осуществляют путем электрохимического синтеза из раствора мономера (анилина, тиофена, фурана, пиррола) в полярном растворителе (воде, ацетонитриле). Способы электрохимического синтеза, которые могут быть использованы при осуществлении заявленного способа, известны и описаны в Электрохимии полимеров. М.: Наука, 1990. Membrane formation is carried out by electrochemical synthesis from a solution of monomer (aniline, thiophene, furan, pyrrole) in a polar solvent (water, acetonitrile). Methods of electrochemical synthesis, which can be used in the implementation of the claimed method, are known and described in the Electrochemistry of polymers. M .: Nauka, 1990.

2. Одновременно с электрохимическим синтезом мембраны осуществляют включение в последнюю рецепторов. Для этого рецепторы растворяют в растворе для электрохимического синтеза. В качестве рецепторов в зависимости от типа анализа можно использовать моноклональные и поликлональные антитела (для индикации антигенов), белковые антигены (вирусные лизаты, рекомбинантные белки, синтетические пептиды, гормоны) (для индикации антител), однонитиевые молекулы ДНК (для индикации ДНК), фрагменты микробных, растительных и животных клеток, целые микробные клетки, различные химические соединения, коньюгированные с инертными белками (гаптены). Концентрация рецепторов в растворе может варьировать в пределах 0,1 - 10000 мкг/мл. Наличие в растворе для электрохимического синтеза рецепторов может привести к некоторому изменению режимов синтеза (времени синтеза, величины силы тока, величины приложенного потенциала) по сравнению с режимами, при которых используется раствор, содержащий только мономер. В каждом конкретном случае эти режимы подбираются специально в зависимости от типа рецепторов, их концентрации и т.п. 2. Simultaneously with the electrochemical synthesis of the membrane, the inclusion of receptors in the latter is carried out. For this, the receptors are dissolved in a solution for electrochemical synthesis. Monoclonal and polyclonal antibodies (for indicating antigens), protein antigens (viral lysates, recombinant proteins, synthetic peptides, hormones) (for indicating antibodies), single-stranded DNA molecules (for indicating DNA), fragments, can be used as receptors, depending on the type of analysis. microbial, plant and animal cells, whole microbial cells, various chemical compounds conjugated with inert proteins (haptens). The concentration of receptors in the solution can vary between 0.1 - 10,000 μg / ml. The presence of receptors in the solution for electrochemical synthesis can lead to some change in the synthesis modes (synthesis time, current strength, applied potential) compared to the modes in which a solution containing only monomer is used. In each case, these modes are selected specifically depending on the type of receptors, their concentration, etc.

Таким образом получают иммуночувствительный сенсор. Выбор в качестве материала для мембраны иммуночувствительного сенсора электропроводящих полимеров обусловлен их высокой технологичностью и дешевизной, хорошими ионообменными и ионселективными свойствами, обеспечивающими сенсору чувствительность к изменению ионной силы раствора, а также способностью электропроводящих полимеров удерживать значительное количество белкового материала (Электрохимия полимеров. М.: Наука, 1990). In this way, an immunosensitive sensor is obtained. The choice of a material for the membrane of an immunosensitive sensor of electrically conductive polymers is due to their high manufacturability and low cost, good ion-exchange and ion-selective properties, which provide the sensor with sensitivity to changes in the ionic strength of the solution, as well as the ability of electrically conductive polymers to retain a significant amount of protein material (Polymer Electrochemistry. M .: Science , 1990).

3. Составляют электрохимическую ячейку путем погружения связанных измерительным прибором иммуночувствительного сенсора и электрода сравнения в емкость, заполненную рабочим раствором с фиксированным значением pH. В качестве электрода сравнения можно использовать как стандартные продажные электроды сравнения (Органическая электрохимия. М.: Химия, 1988), так и специально сконструированные для использования в медицинских измерениях. В качестве измерительного прибора можно использовать стандартные приборы для потенциометрических измерений или потенциостат (Методы измерения в электрохимии. М. : Мир, 1977). Возможно также использование и специально сконструированных для осуществления заявленного способа измерительных устройств. В качестве рабочего раствора можно использовать водные буферные растворы с высокой буферной емкостью, обеспечивающей постоянство значения pH, пригодные как для электрохимических измерений, так и для иммунологических исследований - фосфатно-солевой, Tris-HCl, карбонатно-бикарбонатный, ацетатный, боратный и др. (Иммунологические методы исследования. М.: Мир, 1988). 3. An electrochemical cell is made by immersion of an immunosensitive sensor and a reference electrode connected by a measuring device into a container filled with a working solution with a fixed pH value. As a reference electrode, you can use standard commercial reference electrodes (Organic electrochemistry. M: Chemistry, 1988), and specially designed for use in medical measurements. As a measuring device, you can use standard devices for potentiometric measurements or a potentiostat (Measurement methods in electrochemistry. M.: Mir, 1977). You can also use and specially designed to implement the claimed method of measuring devices. As a working solution, you can use aqueous buffer solutions with a high buffer capacity, ensuring a constant pH value, suitable for both electrochemical measurements and immunological studies - phosphate-salt, Tris-HCl, carbonate-bicarbonate, acetate, borate, etc. ( Immunological research methods. M: Mir, 1988).

В отличие от прототипа заявленного способа, в котором использовалась исключительно проточная ячейка специальной конструкции, при осуществлении заявленного способа в качестве емкости для рабочего раствора можно использовать любую подходящую по размерам емкость, выполненную из материала с минимальными адсорбционными свойствами, например лунку стандартного микротитрационного планшета. Объем рабочего раствора в электрохимической ячейке может составлять от 50 до 5000 мкл в зависимости от типа анализа. Unlike the prototype of the claimed method, which used exclusively a flow cell of a special design, when implementing the claimed method, any suitable sized container made of a material with minimal adsorption properties can be used as a working solution container, for example, a well of a standard microtiter plate. The volume of the working solution in the electrochemical cell can be from 50 to 5000 μl, depending on the type of analysis.

4. Регистрируют в течение фиксированного отрезка времени (100-300 c в зависимости от типа анализа) при помощи регистрирующего прибора (самописца или специальной платы расширения для персонального компьютера), связанного с измерительным прибором, величину напряжения на электрохимической ячейке. 4. Register for a fixed period of time (100-300 s depending on the type of analysis) using the recording device (recorder or special expansion card for a personal computer) associated with the measuring device, the voltage value on the electrochemical cell.

Таким образом получают значение фонового напряжения на ячейке при фиксированном значении pH рабочего раствора. Thus, the value of the background voltage on the cell is obtained at a fixed pH value of the working solution.

5. Ступенчато изменяют ионную силу раствора в электрохимической ячейке и одновременно осуществляют контакт иммуночувствительного сенсора с определяемыми макромолекулами путем введения в электрохимическую ячейку раствора с большей, чем у рабочего раствора, ионной силой с известным содержанием определяемых макромолекул. 5. Stepwise change the ionic strength of the solution in the electrochemical cell and at the same time contact the immunosensitive sensor with the detected macromolecules by introducing into the electrochemical cell a solution with a greater ionic strength than the working solution with a known content of the detected macromolecules.

В случае, когда заявленный способ используется для индикации иммунохимически активных макромолекул в биологических жидкостях (сыворотках крови, лимфе, моче, слюне, сперме), в качестве раствора с большей ионной силой используют эти же биологические жидкости. Использование последних возможно, поскольку их ионная сила, как правило, существенно превышает ионную силу буферных растворов, использующихся в качестве рабочего раствора. С целью уменьшения естественной вариабельности ионного состава и pH биологических жидкостей используют их максимально возможное разведение рабочим раствором. В зависимости от типа анализа разведение может составлять 1:10 - 1:1000. In the case when the claimed method is used to indicate immunochemically active macromolecules in biological fluids (blood serum, lymph, urine, saliva, semen), the same biological fluids are used as a solution with higher ionic strength. The use of the latter is possible because their ionic strength, as a rule, significantly exceeds the ionic strength of the buffer solutions used as a working solution. In order to reduce the natural variability of the ionic composition and pH of biological fluids, their maximum possible dilution with a working solution is used. Dilution may be 1:10 - 1: 1000, depending on the type of analysis.

В случае, когда заявленный способ используется для исследования других жидкостей природного или искусственного происхождения, в качестве раствора с большей ионной силой используют эти жидкости, а их ионную силу повышают искусственно (если это необходимо), добавляя фоновый электролит, не сдвигающий значение pH и не препятствующий протеканию иммунохимической реакции (например, NaCl, KCl или Na₂SO₄).In the case when the claimed method is used to study other liquids of natural or artificial origin, these liquids are used as a solution with a higher ionic strength, and their ionic strength is increased artificially (if necessary) by adding a background electrolyte that does not shift the pH value and does not interfere an immunochemical reaction (for example, NaCl, KCl or Na ₂ SO ₄ ).

Введение раствора в электрохимическую ячейку может быть осуществлено либо добавлением непосредственно в емкость с рабочим раствором, либо переносом иммуночувствительного сенсора и электрода сравнения из емкости с чистым рабочим раствором в емкость, содержащую рабочий раствор и раствор с большей ионной силой. Последнее боле предпочтительно, поскольку позволяет точно контролировать разведение раствора с большей ионной силой и, следовательно, повышает точность анализа. The introduction of the solution into the electrochemical cell can be carried out either by adding directly to the container with the working solution, or by transferring the immunosensitive sensor and the reference electrode from the container with a clean working solution to a container containing the working solution and a solution with a higher ionic strength. The latter is preferable because it allows you to precisely control the dilution of the solution with greater ionic strength and, therefore, increases the accuracy of the analysis.

Содержание определяемых макромолекул в растворе с большей ионной силой может варьироваться в зависимости от типа анализа в пределах от 0 до 10000 мкг/мл. The content of detectable macromolecules in a solution with a higher ionic strength may vary from 0 to 10,000 μg / ml depending on the type of analysis.

6. В течение фиксированного отрезка времени регистрируют (аналогично п. 4) величину напряжения на электрохимической ячейке, а также характер изменения напряжения в присутствии раствора с большей ионной силой. 6. Over a fixed period of time, the voltage on the electrochemical cell, as well as the nature of the voltage change in the presence of a solution with a higher ionic strength, is recorded (similar to step 4).

Время нахождения раствора с большей ионной силой в электрохимической ячейке и, соответственно, время регистрации величины и характера изменения напряжения в зависимости от типа анализа может составлять от 30 до 1200 c. Критерием является минимальное время, за которое реакция между иммунохимически активными макромолекулами и рецепторами в мембране сенсора приведет к заметному изменению значения изоэлектрической точки мембраны. The residence time of a solution with a higher ionic strength in the electrochemical cell and, accordingly, the time of recording the magnitude and nature of the voltage change depending on the type of analysis can be from 30 to 1200 s. The criterion is the minimum time for which the reaction between immunochemically active macromolecules and receptors in the sensor membrane will lead to a noticeable change in the value of the isoelectric point of the membrane.

7. По завершении выполнения п. 6 замещают раствор с большей ионной силой в электрохимической ячейке на рабочий раствор. Замещение осуществляют либо путем вытеснения раствора с большей ионной силой из емкости с рабочим раствором, либо путем переноса иммуночувствительного сенсора и электрода сравнения из емкости с раствором с большей ионной силой в емкость с рабочим раствором. 7. Upon completion of step 6, a solution with a greater ionic strength in the electrochemical cell is replaced by a working solution. Substitution is carried out either by displacing a solution with a higher ionic strength from a container with a working solution, or by transferring an immunosensitive sensor and a reference electrode from a container with a solution with a higher ionic strength into a container with a working solution.

8. По завершении выполнения п. 7 регистрируют (аналогично п. 6) величину напряжения на электрохимической ячейке, а также характер изменения напряжения в рабочем растворе. Период времени, в течение которого осуществляют регистрацию, может составлять в зависимости от типа анализа 60-1200 с, что обусловлено десорбцией с поверхности мембраны иммуночувствительного сенсора не прореагировавших с рецепторами макромолекул, а также с установлением ионного равновесия между мембраной и рабочим раствором. 8. Upon completion of paragraph 7, register (similarly to paragraph 6) the magnitude of the voltage on the electrochemical cell, as well as the nature of the voltage change in the working solution. The time period during which registration is carried out may be 60-1200 s depending on the type of analysis, which is caused by desorption from the membrane surface of the immunosensitive sensor that did not react with the macromolecule receptors, as well as with the establishment of ionic equilibrium between the membrane and the working solution.

Таким образом получают значение конечного напряжения на ячейке после взаимодействия иммуночувствительного сенсора с раствором с большей, чем у рабочего раствора, ионной силой. Thus, the value of the final voltage on the cell is obtained after the interaction of the immunosensitive sensor with a solution with a greater ionic strength than that of the working solution.

9. Оценивают величину смещения изоэлектрической точки мембраны, исходя из изменения величины напряжения на электрохимической ячейке во время и после взаимодействия иммуночувствительного сенсора с раствором с большей ионной силой. 9. The magnitude of the displacement of the isoelectric point of the membrane is estimated based on the change in the magnitude of the voltage on the electrochemical cell during and after the interaction of the immunosensitive sensor with a solution with a higher ionic strength.

Это осуществимо при фиксированном значении pH рабочего раствора, поскольку смещение изоэлектрической точки мембраны вследствие иммунохимической реакции приводит к изменению отклика иммуночувствительного сенсора на изменение ионной силы раствора практически при всех значениях pH. This is feasible at a fixed pH of the working solution, since the shift of the isoelectric point of the membrane due to the immunochemical reaction leads to a change in the response of the immunosensitive sensor to a change in the ionic strength of the solution at almost all pH values.

Для количественной оценки характера изменения величины напряжения можно использовать ряд показателей, в том числе:
разность между величинами фонового и конечного напряжений на электрохимической ячейке;
разность между максимальной величиной напряжения, зарегистрированной в ходе выполнения п. 6, и величиной фонового напряжения;
разность между максимальной величиной напряжения, зарегистрированной в ходе выполнения п. 6, и величиной конечного напряжения;
величину (в условных единицах) площади под кривой изменения во времени величины напряжения, полученной в ходе выполнения п. 6;
начальную, конечную, среднюю или максимальную скорости изменения величины напряжения на электрохимической ячейке в ходе выполнения п. 6.To quantify the nature of the change in the magnitude of the voltage, you can use a number of indicators, including:
the difference between the values of the background and final stresses on the electrochemical cell;
the difference between the maximum voltage recorded during the execution of p. 6, and the value of the background voltage;
the difference between the maximum voltage recorded during the execution of p. 6, and the value of the final voltage;
the value (in arbitrary units) of the area under the curve of the change in time of the voltage value obtained during the implementation of paragraph 6;
the initial, final, average or maximum rate of change of the magnitude of the voltage across the electrochemical cell during the implementation of paragraph 6.

Возможно также комплексное использование вышеперечисленных показателей для повышения достоверности получаемых результатов. It is also possible the integrated use of the above indicators to increase the reliability of the results.

10. Выполняют пп. 4-9, используя растворы с большей, чем у рабочего раствора, ионной силой с различным известным содержанием определяемых макромолекул. 10. Perform paragraphs. 4-9, using solutions with a greater ionic strength than the working solution with different known contents of the determined macromolecules.

11. На основании полученных в ходе выполнения п. 10 данных строят калибровочный график зависимости характера изменения напряжения на электрохимической ячейке от содержания определяемых макромолекул в растворе с большей, чем у рабочего раствора, ионной силой. 11. On the basis of the data obtained during the execution of paragraph 10, a calibration graph is constructed for the dependence of the nature of the voltage change on the electrochemical cell on the content of the determined macromolecules in the solution with a greater ionic strength than that of the working solution.

12. Полученный калибровочный график используют для определения содержания (индикации) макромолекул в исследуемых растворах (с неизвестным содержанием макромолекул). Для этого выполняют пп. 4-8, используя в качестве растворов с большей ионной силой исследуемые растворы. При этом исследуемые растворы должны быть аналогичными по ионной силе, pH и ионному составу растворам, которые были использованы в ходе выполнения п. 11. 12. The obtained calibration graph is used to determine the content (indication) of macromolecules in the studied solutions (with unknown content of macromolecules). To do this, paragraphs. 4-8, using the investigated solutions as solutions with higher ionic strength. In this case, the investigated solutions should be similar in ionic strength, pH and ionic composition to the solutions that were used during the execution of paragraph 11.

Заявленный способ поясняется следующими примерами. The claimed method is illustrated by the following examples.

Пример 1. Example 1

1.1 Использовали следующие реактивы и материалы:
в качестве мономера - пиррол (Pyrrole, > 98%, Merck, ФРГ), который перед применением был дважды очищен методом вакуумной перегонки и хранился под N₂ в непроницаемой для света посуде при температуре +4^oC;
в качестве фонового электролита для электрохимического синтеза - KCl (≈ 99%, Sigma, США);
в качестве специфических рецепторов - мышиные моноклональные антитела к хорионическому гонадотропину человека (Mouse Monoclanal antibodies Anti-Chorionic Gonadotropin, Human, Affinity constant 1•10⁹ L/mol, Calbiochem, США), которые перед применением хранились в фосфатно-солевом буферном растворе при температуре +4^oC;
для приготовления водных растворов - деионизованную воду (reagent grade, сопротивление > 18 МОм), полученную при помощи установки "Milli-Ro/Milli-Q" (Millipore, США);
для приготовления рабочего раствора - "Phosphate Buffered Saline Tablets" (Sigma, США);
в качестве электрода для потенциометрических измерений - торец запаянной в стеклянную трубку платиновой проволоки площадью 0,07 см², предпочтительно отшлифованный абразивной пастой с диаметром частиц 0,3 мкм и промытый деонизованной водой;
в качестве электрода сравнения - стандартный продажный хлорсеребряный электрод сравнения (Ag/AgCl/3 M KCl, Radelkis, Венгрия);
в качестве емкости для рабочего раствора - лунки микротитрационного планшета, выполненного из полистирола (Linbro, Великобритания);
в качестве исследуемого раствора с известным содержанием определяемых макромолекул - образцы женской мочи с фиксированным содержанием хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) (Chorionic Gonadotropin, Standard Grade, Female Human Urine, > 3000 IU/mg, Calbiochem, США), разделенные рабочим раствором в разных пропорциях;
в качестве исследуемого раствора с неизвестным содержанием макромолекул - образцы мочи, взятые от различных лиц.1.1 Used the following reagents and materials:
as a monomer, pyrrole (Pyrrole,> 98%, Merck, Germany), which before use was twice purified by vacuum distillation and stored under N ₂ in an impervious to light at a temperature of +4 ^o C;
KCl (≈ 99%, Sigma, USA) as the background electrolyte for electrochemical synthesis;
as specific receptors, mouse monoclonal antibodies to human chorionic gonadotropin (Mouse Monoclanal antibodies Anti-Chorionic Gonadotropin, Human, Affinity constant 1 • 10 ⁹ L / mol, Calbiochem, USA), which were stored in phosphate-buffered saline before use at a temperature + 4 ^o C;
for the preparation of aqueous solutions, deionized water (reagent grade, resistance> 18 MΩ) obtained using the Milli-Ro / Milli-Q installation (Millipore, USA);
for the preparation of working solution - "Phosphate Buffered Saline Tablets" (Sigma, USA);
as an electrode for potentiometric measurements, the end face of a platinum wire sealed in a glass tube with an area of 0.07 cm ² , preferably sanded with an abrasive paste with a particle diameter of 0.3 μm and washed with deionized water;
as a reference electrode, a standard commercial silver chloride comparison electrode (Ag / AgCl / 3 M KCl, Radelkis, Hungary);
as a container for the working solution - wells microtiter tablet made of polystyrene (Linbro, UK);
samples of female urine with a fixed content of human chorionic gonadotropin (hCG) (Chorionic Gonadotropin, Standard Grade, Female Human Urine,> 3000 IU / mg, Calbiochem, USA) separated by a working solution in different proportions as a test solution with a known content of determined macromolecules ;
as a test solution with an unknown macromolecule content - urine samples taken from various individuals.

1.2. Использовали следующее оборудование:
для проведения электрохимического синтеза - тефлоновую ячейку объемом 100 мл и потенциостат-гальваностат ПИ-50.1 (Россия);
для контроля pH рабочего раствора - pH-метр Checkmate (Mettler, Швейцария);
для измерения напряжения на электрохимической ячейке - цифровой милливольтметр OP 211/1 (Radelkis, Венгрия);
для контроля за процессом электрохимического синтеза и регистрации напряжения на электрохимической ячейке - двухканальный самописец 2210 (LKB-Приборы, Швеция).1.2. Used the following equipment:
for electrochemical synthesis - a 100 ml Teflon cell and a PI-50.1 potentiostat-galvanostat (Russia);
to control the pH of the working solution - Checkmate pH meter (Mettler, Switzerland);
for measuring voltage on an electrochemical cell - digital millivoltmeter OP 211/1 (Radelkis, Hungary);
for monitoring the process of electrochemical synthesis and registration of voltage on the electrochemical cell - two-channel recorder 2210 (LKB-Instruments, Sweden).

1.3 Проводили электрохимический синтез мембраны на электроде из водного раствора пиррола в присутствии фонового электролита и специфических рецепторов. Концентрации пиррола, фонового электролита и специфических рецепторов при этом составляли 0,10 М, 0,15 М и 50 мг/Л соответственно. Синтез проводили в режиме циклического развертывания потенциала электрода в диапазоне от -800 до +1200 мВ (относительно Ag/AgCl-электрода сравнения) и скоростью развертки 100 мВ/с. По достижении заданной толщины мембраны (≈ 1 мкм) процесс останавливали. Далее электрод с мембраной извлекали из ячейки, промывали раствором фонового электролита и помещали в ячейку для электрохимического синтеза, заполненную чистым раствором фонового электролита, где потенциостатировали при потенциале +500 мВ (относительно Ag/AgCl-электрода сравнения) до стабилизации фонового тока. 1.3 Conducted an electrochemical synthesis of the membrane on the electrode from an aqueous solution of pyrrole in the presence of a background electrolyte and specific receptors. The concentrations of pyrrole, background electrolyte, and specific receptors were 0.10 M, 0.15 M, and 50 mg / L, respectively. The synthesis was carried out in the mode of cyclic unfolding of the electrode potential in the range from -800 to +1200 mV (relative to the Ag / AgCl reference electrode) and a sweep speed of 100 mV / s. Upon reaching the specified membrane thickness (≈ 1 μm), the process was stopped. Then, the electrode with the membrane was removed from the cell, washed with a background electrolyte solution and placed in an electrochemical synthesis cell filled with a pure background electrolyte solution, where it was potentiostated at a potential of +500 mV (relative to the Ag / AgCl reference electrode) until the background current was stabilized.

Полученный таким образом иммуночувствительный сенсор хранили при температуре +4^oC в фосфатно-солевом буферном растворе с добавлением 0,01% азида натрия.Thus obtained immunosensitive sensor was stored at a temperature of +4 ^o C in phosphate-buffered saline with the addition of 0.01% sodium azide.

1.4. Готовили рабочий раствор со значением pH 7,4. 1.4. Prepared a working solution with a pH value of 7.4.

1.5. Готовили серию образцов исследуемого раствора с содержанием ХГЧ в диапазоне 0,1-10 IU/мл. 1.5. A series of samples of the test solution was prepared with an hCG content in the range of 0.1-10 IU / ml.

1.6. Составляли электрохимическую ячейку, помещая иммуночувствительный сенсор и хлорсеребряный электрод сравнения в рабочий раствор и подключая их к входам цифрового милливольтметра, соединенного с самописцем. При этом иммуночувствительный сенсор помещали в лунку микротитрационного планшета, содержащую 100 мкл рабочего раствора, а электрод сравнения помещали в большую по объему емкость с рабочим раствором. Контакт между лункой планшета и емкостью, в которой находился электрод сравнения, осуществляли с помощью солевого мостика, заполненного 0,1 М раствором KCl. 1.6. An electrochemical cell was made by placing an immunosensitive sensor and a silver chloride reference electrode in a working solution and connecting them to the inputs of a digital millivoltmeter connected to a recorder. In this case, an immunosensitive sensor was placed in a well of a microtiter tablet containing 100 μl of the working solution, and the reference electrode was placed in a large volume container with the working solution. Contact between the well of the plate and the container in which the reference electrode was located was carried out using a salt bridge filled with a 0.1 M KCl solution.

1.7. В течение 100 с регистрировали величину напряжения на электрохимической ячейке - получали значение фонового напряжения на ячейке,
1.8. В лунку микротитрационного планшета, предварительно отобрав из него 20 мкл рабочего раствора, добавляли образец исследуемого раствора в количестве 20 мкл с наименьшим содержанием ХЧГ.1.7. For 100 s, the voltage on the electrochemical cell was recorded — the background voltage on the cell was obtained,
1.8. A sample of the test solution in the amount of 20 μl with the lowest content of hCG was added to the well of a microtiter tablet, after having taken 20 μl of the working solution from it.

1.9. Регистрировали в течение 400 с изменение напряжения на ячейке. 1.9. The change in cell voltage was recorded for 400 s.

1.10. По завершении выполнения п. 1.9. переносили иммуночувствительный сенсор и солевой мостик в лунку с чистым рабочим раствором и регистрировали в течение 600 с величину напряжения на ячейке - получали значение конечного напряжения на ячейке. 1.10. Upon completion of paragraph 1.9. the immunosensitive sensor and the salt bridge were transferred to a well with a clean working solution and the voltage on the cell was recorded for 600 s — the final voltage on the cell was obtained.

1.11. Последовательно выполняли пп. 1.7 - 1.10, используя каждый раз образец исследуемого раствора с более высоким содержанием ХГЧ. 1.11. Consistently performed paragraphs. 1.7 - 1.10, using each time a sample of the test solution with a higher content of hCG.

1.12. Характер смещения потенциала на ячейке численно оценивали по разности в милливольтах между величинами фонового и конечного напряжения на ячейке. 1.12. The nature of the potential bias on the cell was numerically evaluated by the difference in millivolts between the values of the background and final voltage on the cell.

1.13. Строили калибровочный график зависимости разности фонового и конечного напряжений на ячейке от содержания ХГЧ в исследуемом растворе. 1.13. We built a calibration graph of the dependence of the difference between the background and final stresses on the cell on the hCG content in the test solution.

1.14. Полученный калибровочный график использовали затем для определения содержания ХГЧ в образцах мочи, взятых от разных пациентов. Для этого выполняли пп. 1.7 - 1.12, используя при этом в качестве исследуемого раствора вышеозначенные образцы. 1.14. The resulting calibration graph was then used to determine the hCG content in urine samples taken from different patients. For this, paragraphs were performed. 1.7 - 1.12, using the above-mentioned samples as the test solution.

Пример 2. Example 2

2.1. Использовали следующие реактивы и материалы:
в качестве мономера - см. п. 1.1;
в качестве фонового электролита для электрохимического синтеза - Na₂SO₄ (ACS Reagent, Sigma, США);
в качестве специфических рецепторов - рекомбинантные белки оболочки вируса HIV-1 p24, gp41 и gp120 (American Bio-Technologies Inc., США), которые перед применением хранились в фосфатно-солевом буферном растворе при температуре +4^oC;
для приготовления водных растворов - см. п. 1.1;
для приготовления рабочего раствора - см. п. 1.1;
в качестве электрода для потенциометрических измерений - планарный электрод 0,5 • 10 мм, выполненный из золота и расположенный на керамической подложке размером 8,0 • 30 мм, предварительно обезжиренный горячим изопропанолом (Merck, ФРГ) и высушенный в парах последнего;
в качестве электрода сравнения для проведения электрохимического синтеза - см. п. 1.1;
в качестве электрода сравнения для составления электрохимической ячейки - специально сконструированный миниатюрный Ag/AgCl-электрод сравнения диаметром 3 мм и заполненный насыщенной KCl агарозой (Serva, ФРГ);
В качестве емкости для рабочего раствора - см. п.1.1.;
в качестве образцов исследуемого раствора с известным содержанием определяемых макромолекул - смесь моноклональных антител к p24, gp41 и gp 120 (Orbit Enterprises, США), разведенную нормальной человеческой сывороткой (Кардиологический Научный центр АМН РФ, Россия) в разных пропорциях;
в качестве исследуемого раствора с неизвестным содержанием макромолекул - образцы сывороток крови, взятых у лиц, инфицированных ВИЧ-1.2.1. The following reagents and materials were used:
as a monomer, see paragraph 1.1;
Na ₂ SO ₄ (ACS Reagent, Sigma, USA) as a background electrolyte for electrochemical synthesis;
as specific receptors, recombinant HIV-1 envelope proteins p24, gp41 and gp120 (American Bio-Technologies Inc., USA), which were stored in phosphate-buffered saline at +4 ^° C before use;
for the preparation of aqueous solutions - see paragraph 1.1;
for the preparation of working solution - see paragraph 1.1;
as an electrode for potentiometric measurements - a planar electrode of 0.5 • 10 mm, made of gold and located on a ceramic substrate of 8.0 • 30 mm in size, previously degreased with hot isopropanol (Merck, Germany) and dried in pairs of the latter;
as a reference electrode for conducting electrochemical synthesis - see paragraph 1.1;
as a reference electrode for compiling the electrochemical cell, a specially designed miniature Ag / AgCl reference electrode with a diameter of 3 mm and filled with KCl-saturated agarose (Serva, Germany);
As a container for a working solution - see p.1.1 .;
as samples of the test solution with a known content of the determined macromolecules - a mixture of monoclonal antibodies to p24, gp41 and gp 120 (Orbit Enterprises, USA), diluted with normal human serum (Cardiology Scientific Center of the Academy of Medical Sciences of the Russian Federation, Russia) in different proportions;
as a test solution with an unknown macromolecule content - blood serum samples taken from persons infected with HIV-1.

2.2. Использовали следующее оборудование:
для проведения электрохимического синтеза - см. п.1.1;
для контроля pH рабочего раствора - см. п.1.1;
для измерения и регистрации напряжения на электрохимической ячейке - специально сконструированное на базе IBM-совместимого персонального компьютера измерительное устройство, включающее усилитель и аналого-цифровой преобразователь и управляемое специализированной программой;
2.3. Проводили электрохимический синтез мембраны на электроде из водного раствора пиррола в присутствии фонового электролита и специфических рецепторов. Концентрации пиррола, фонового электролита и специфических рецепторов при этом составляли 0,30 М, 0,15 М и 100 мг/л соответственно. Синтез проводили в потенциостатическом режиме при потенциале +950 мВ (относительно Ag/AgCl-электрода сравнения). По достижении заданной толщины мембраны (≈ 3 мкм) процесс останавливали. Далее электрод с мембранной извлекали из ячейки, промывали раствором фонового электролита и помещали в ячейку для электрохимического синтеза, заполненную раствором фонового электролита, где потенциостатировали при потенциале +700 мВ (относительно Ag/AgCl-электрода сравнения) до стабилизации фонового тока.2.2. Used the following equipment:
for electrochemical synthesis - see p.1.1;
to control the pH of the working solution - see p.1.1;
for measuring and recording the voltage at the electrochemical cell - a measuring device specially designed on the basis of an IBM-compatible personal computer, including an amplifier and an analog-to-digital converter and controlled by a specialized program;
2.3. The membrane was electrochemically synthesized on an electrode from an aqueous pyrrole solution in the presence of a background electrolyte and specific receptors. The concentrations of pyrrole, background electrolyte, and specific receptors were 0.30 M, 0.15 M, and 100 mg / L, respectively. The synthesis was carried out in a potentiostatic mode at a potential of +950 mV (relative to the Ag / AgCl reference electrode). Upon reaching the specified membrane thickness (≈ 3 μm), the process was stopped. Next, the electrode with the membrane was removed from the cell, washed with a background electrolyte solution and placed in an electrochemical synthesis cell filled with a background electrolyte solution, where it was potentiostatized at a potential of +700 mV (relative to the Ag / AgCl reference electrode) until the background current was stabilized.

Полученный таким образом иммунночувствительный сенсор хранили при температуре +4^oC в фосфатно-солевом буферном растворе с добавлением 0,01% азида натрия.Thus obtained immunosensitive sensor was stored at a temperature of +4 ^o C in phosphate-buffered saline with the addition of 0.01% sodium azide.

2.4. Готовили рабочий раствор со значением pH 7,4. 2.4. Prepared a working solution with a pH value of 7.4.

2.5. Готовили серию образцов исследуемого раствора с содержанием антител в диапазоне 0 - 10 мкг/мл. 2.5. A series of samples of the test solution was prepared with an antibody content in the range of 0-10 μg / ml.

2.6. Составляли электрохимическую ячейку, помещая иммуночувствительный сенсор и электрод сравнения в лунку микротитрационного планшета, заполненную 100 мкл рабочего раствора, и подключая их в входам измерительного устройства. 2.6. An electrochemical cell was made by placing an immunosensitive sensor and a reference electrode in a microtiter plate well filled with 100 μl of working solution, and connecting them to the inputs of the measuring device.

2.7. В течение 200 с регистрировали величину напряжения на электрохимической ячейке - получали значение фонового напряжения на ячейке. 2.7. For 200 s, the voltage on the electrochemical cell was recorded — the background voltage on the cell was obtained.

2.8. В лунку микротитрационного планшета, предварительно отобрав из него 5 мкл рабочего раствора, добавляли образец исследуемого раствора в количестве 5 мкл с наименьшим содержанием антител. 2.8. A sample of the test solution in the amount of 5 μl with the lowest content of antibodies was added to the well of a microtiter tablet, after taking 5 μl of the working solution from it.

2.9. Регистрировали в течение 900 с изменение напряжения на ячейке. 2.9. The change in cell voltage was recorded for 900 s.

2.10. По завершении выполнения п.2.9 переносили иммуночувствительный сенсор и электрод сравнения в лунку с чистым рабочим раствором и регистрировали в течение 900 с величину напряжения на ячейке - получали значение конечного напряжения на ячейке. 2.10. Upon completion of step 2.9, the immunosensitive sensor and reference electrode were transferred to a well with a clean working solution and the voltage on the cell was recorded for 900 s — the final voltage on the cell was obtained.

2.11. Последовательно выполняли пп. 2.7 - 2.10, используя каждый раз образец исследуемого раствора с более высоким содержанием антител. 2.11. Consistently performed paragraphs. 2.7 - 2.10, using each time a sample of the test solution with a higher antibody content.

2.12. Характер смещения потенциала на ячейке численно оценивали по максимальному значению напряжения на ячейке, зарегистрированному в ходе выполнения п. 2.9. 2.12. The nature of the potential bias on the cell was numerically evaluated by the maximum value of the voltage on the cell, recorded during the implementation of paragraph 2.9.

2.13. Строили калибровочный график зависимости максимального значения напряжения на ячейке от содержания антител в исследуемом растворе. 2.13. We built a calibration graph of the dependence of the maximum voltage on the cell on the content of antibodies in the test solution.

2.14. Полученный калибровочный график использовали затем для определения содержания антител в образцах сыворотки крови лиц, инфицированных ВИЧ-1. 2.14. The resulting calibration graph was then used to determine the antibody content in the blood serum of individuals infected with HIV-1.

Пример 3. Example 3

3.1. Использовали следующие реактивы и материалы:
в качестве мономера - см. п.1.1;
в качестве фонового электролита для электрохимического синтеза - NaCl (ACS Reagent, Sigma, США);
в качестве специфических рецепторов - мышиные моноклональные антитела к поверхностному антигену вируса гепатита B (Mouse Monoclonal Anti-HBsAg, Affinity constant 1 • 10¹⁰ L/Mol, Calbiochem, США), которые перед применением хранились в фосфатно-солевом буферном растворе с добавлением 0,01% азида натрия при температуре +4^oC;
для приготовления водных растворов - см. п.1.1;
для приготовления рабочего раствора - см. п.1.1;
для изготовления электрода для потенциометрических измерений - пленка лавсановая толщиной 500 мкм (Владимирский химкомбинат, Россия), распыляемая в вакууме хромовая мишень, раствор хлорного золота (Sigma, США), фоторезист ФП-383 (НИИПИК, Россия), раствор сернокислого церия (Sigma, США), водный раствор KOH (Sigma, США);
в качестве электрода сравнения для проведения электрохимического синтеза - см. п.1.1;
в качестве электрода сравнения для составления электрохимической ячейки - см. п.2.1;
в качестве емкости для рабочего раствора - см. п.1.1.;
в качестве образцов исследуемого раствора с известным содержанием определяемых макромолекул - лиофилизированный препарат поверхностного антигена вируса гепатита B (HBsAg) (Государственный институт стандартизации и контроля при Комитета по санитарно-эпидемиологическому надзору РФ, Россия), разведенный нормальной человеческой сывороткой (Кардиологический научный центр АМН РФ, Россия) в разных пропорциях;
в качестве исследуемого раствора с неизвестным содержанием макромолекул - образцы сывороток крови, взятых у лиц, больных различными формами гепатита B.3.1. The following reagents and materials were used:
as a monomer, see paragraph 1.1;
NaCl (ACS Reagent, Sigma, USA) as a background electrolyte for electrochemical synthesis;
as specific receptors, mouse monoclonal antibodies to the surface antigen of hepatitis B virus (Mouse Monoclonal Anti-HBsAg, Affinity constant 1 • 10 ¹⁰ L / Mol, Calbiochem, USA), which were stored in phosphate-buffered saline with the addition of 0 before use, 01% sodium azide at a temperature of +4 ^o C;
for the preparation of aqueous solutions - see p.1.1;
for the preparation of working solution - see p.1.1;
for the manufacture of an electrode for potentiometric measurements, a lavsan film 500 μm thick (Vladimir Chemical Plant, Russia), a chromium target sprayed in vacuum, a solution of gold chloride (Sigma, USA), photoresist FP-383 (NIIPIK, Russia), cerium sulfate solution (Sigma, USA), an aqueous solution of KOH (Sigma, USA);
as a reference electrode for conducting electrochemical synthesis - see p.1.1;
as a reference electrode for compiling an electrochemical cell - see clause 2.1;
as a container for a working solution - see p.1.1 .;
as samples of the test solution with a known content of detectable macromolecules - a lyophilized preparation of hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) (State Institute for Standardization and Control under the Committee for Sanitary and Epidemiological Surveillance of the Russian Federation, Russia), diluted with normal human serum (Cardiology Scientific Center of the Academy of Medical Sciences of the Russian Federation, Russia) in different proportions;
as a test solution with an unknown macromolecule content - samples of blood serum taken from patients with various forms of hepatitis B.

3.2. Использовали следующее оборудование:
для изготовления электрода для потенциометрических измерений - установка вакуумного напыления типа УВН (Россия), установка нанесения фоторезиста ПНФ-6Ц (Россия), установка нанесения фоторезиста ПНФ-6Ц (Россия), фотошаблон, установка фотоэкспонирования СТП-300 (Россия), сухожаровой шкаф EU 18 (Jouan, Франция), ячейка, аналогичная использующейся для электрохимического синтеза, потенциостат ПИ-50.1 (Россия);
для проведения электрохимического синтеза - см. п.1.1;
для контроля pH рабочего раствора - см. п.1.1;
для измерения и регистрации напряжения на электрохимической ячейке - см. п.2.2;
3.3. Заготавливали подложки из лавсановой пленки размером 60 x 48 мм, отмывали последние в горячем изопропаноле (Merck, ФРГ) и высушивали в парах изопропанола. Методом магнетронного распыления наносили на подложки слой хрома толщиной 0,05 мкм. На слой хрома наносили фоторезист методом центрифугирования и высушивали при температуре +80^oC в течение 20 мин. Экспонировали слой фоторезиста ультрафиолетом через фотошаблон с определенным рисунком. Проявляли слой фоторезиста в растворе KOH с последующим высушиванием при температуре +100^oC в течение 20 мин. Получали рисунок из хрома методом травления в растворе сернокислого церия. Удаляли фоторезист диметилформамидом (Merck, ФРГ) с последующими отмывкой и высушиванием в парах изопропанола. Высаживали слой золота толщиной 0,50 мкм на рисунок из хрома методом гальванического осаждения из раствора хлорного золота с последующими отмывкой и сушкой в парах изопропанола.3.2. Used the following equipment:
for the manufacture of an electrode for potentiometric measurements - a UVN type vacuum deposition unit (Russia), a PNF-6Ts photoresist application unit (Russia), a PNF-6Ts photoresist application unit (Russia), a photomask, a STP-300 photoexposure unit (Russia), an EU dry heat oven 18 (Jouan, France), a cell similar to that used for electrochemical synthesis, potentiostat PI-50.1 (Russia);
for electrochemical synthesis - see p.1.1;
to control the pH of the working solution - see p.1.1;
for measuring and recording voltage on an electrochemical cell - see clause 2.2;
3.3. 60 x 48 mm lavsan films were prepared, the latter was washed in hot isopropanol (Merck, Germany) and dried in isopropanol vapor. Magnetron sputtering applied a 0.05 μm thick layer of chromium to the substrates. A photoresist was applied to the chromium layer by centrifugation and dried at a temperature of +80 ^o C for 20 minutes. A photoresist layer was exposed to ultraviolet light through a photomask with a specific pattern. A photoresist layer was revealed in a KOH solution, followed by drying at a temperature of +100 ^° C for 20 minutes. Received a pattern of chromium by etching in a solution of cerium sulfate. The photoresist was removed with dimethylformamide (Merck, Germany), followed by washing and drying in isopropanol vapors. A 0.50 μm thick gold layer was deposited onto a chromium pattern by galvanic deposition from a solution of gold chloride followed by washing and drying in isopropanol vapor.

Таким образом получали электрод для потенциометрических измерений. Thus, an electrode was obtained for potentiometric measurements.

3.4. Проводили электрохимический синтез мембраны на электроде из водного раствора пиррола в присутствии фонового электролита и специфических рецепторов. Концентрации пиррола, фонового электролита и специфических рецепторов при этом составляли 0,15 М, 0,10 М и 5 мг/л соответственно. Синтез и последующую обработку электрода с мембраной проводили аналогично описанному в п. 2.3. 3.4. The membrane was electrochemically synthesized on an electrode from an aqueous pyrrole solution in the presence of a background electrolyte and specific receptors. The concentrations of pyrrole, background electrolyte, and specific receptors were 0.15 M, 0.10 M, and 5 mg / L, respectively. The synthesis and subsequent processing of the electrode with the membrane was carried out as described in paragraph 2.3.

3.5. Готовили рабочий раствор со значением pH 7,4. 3.5. Prepared a working solution with a pH value of 7.4.

3.6. Готовили серию образцов исследуемого раствора с содержанием HBsAg в диапазоне 0 - 1,00 мкг/мл. 3.6. A series of samples of the test solution was prepared with the content of HBsAg in the range of 0 - 1.00 μg / ml.

3.7. Составляли электрохимическую ячейку аналогично описанному в п.3.6. 3.7. An electrochemical cell was made as described in clause 3.6.

3.8. В течение 100 с регистрировали величину напряжения на электрохимической ячейке - получали значение фонового напряжения на ячейке. 3.8. For 100 s, the voltage on the electrochemical cell was recorded — the value of the background voltage on the cell was obtained.

3.9. В лунку микротитрационного планшета, предварительно отобрав из него 10 мкл рабочего раствора, добавляли образец исследуемого раствора в количестве 10 мкл с наименьшим содержанием HBsAg. 3.9. A sample of the test solution in the amount of 10 μl with the lowest content of HBsAg was added to the well of a microtiter plate, after preliminary taking 10 μl of the working solution from it.

3.10. Регистрировали в течение 300 с изменение напряжения на ячейке. 3.10. The change in cell voltage was recorded for 300 s.

3.11. По завершении выполнения п. 3.10 переносили иммуночувствительный сенсор и электрод сравнения в лунку с чистым рабочим раствором и регистрировали в течение 300 с величину напряжения на ячейке - получали значение конечного напряжения на ячейке. 3.11. Upon completion of paragraph 3.10, the immunosensitive sensor and reference electrode were transferred to a well with a clean working solution and the voltage on the cell was recorded for 300 s — the final voltage on the cell was obtained.

3.12. Последовательно выполняли пп.3.8 - 3.11, используя каждый раз образец исследуемого раствора с более высоким содержанием HBsAg. 3.12. Sections 3.8 - 3.11 were sequentially performed, using each time a sample of the test solution with a higher content of HBsAg.

3.13. Характер смещения потенциала на ячейке численно оценивали по величине (в условных единицах) площади под кривой изменения во времени напряжения на ячейке, полученной в выполнения п. 3.10, и по величине начальной скорости (мВ/с) изменения величины напряжения. 3.13. The nature of the potential displacement on the cell was numerically evaluated by the value (in arbitrary units) of the area under the curve of the time variation of the voltage on the cell obtained in accordance with Section 3.10, and by the magnitude of the initial velocity (mV / s) of the change in the voltage value.

3.14. Строили калибровочные графики зависимости величины площади под кривой изменения напряжения во времени и величины начальной скорости изменения напряжения от содержания HBsAg в исследуемом растворе. 3.14. Calibration plots were plotted as a function of the area under the curve of voltage over time and the initial rate of voltage change as a function of HBsAg content in the test solution.

3.15. Полученные калибровочные графики использовали затем для определения содержания HBsAg в образцах сыворотки крови лиц, больных гепатитом B. Ыв 3.15. The obtained calibration graphs were then used to determine the content of HBsAg in the blood serum of individuals with hepatitis B. Eu

Claims

1. A method for the electrochemical indication of immunochemically active macromolecules in the studied solutions, which provides for the formation of an immunosensitive sensor with a membrane with specific receptors immobilized into it, compiling an electrochemical measuring cell from an immunosensitive sensor and a reference electrode connected by a measuring device, placing the latter in the working solution and determining the bias of the value of the isoelectric point membranes depending on the content of the determined macromolecules in an edible solution by measuring the voltage on the cell with a stepwise change in the ionic strength of the working solution, characterized in that the membrane is formed from an electrically conductive polymer by electrochemical synthesis from a monomer solution with specific receptors placed on the electrode surface for potentiometric measurements, while determining the isoelectric point displacement membranes add the test solution with a greater ionic strength than the working solution at a constant value and pH of the working solution.

2. The method according to claim 1, characterized in that aniline, thiophene, furan, pyrrole are used as a monomer for the electrochemical synthesis of the membrane.

3. The method according to claim 1, characterized in that monoclonal and polyclonal antibodies, viral lysates, recombinant proteins, synthetic peptides, hormones, single-stranded DNA molecules, fragments of microbial, plant and animal cells, whole microbial cells, are used as specific receptors chemical compounds conjugated with inert proteins (haptens).

4. The method according to claim 1, characterized in that as the test solution with a greater ionic strength than the working solution, biological fluids, such as blood serum, lymph, urine, saliva, sperm, are used.

5. The method according to claim 1, characterized in that the introduction of the test solution with a greater ionic strength than the working solution in the electrochemical cell is carried out by adding directly to the container with the working solution.

6. The method according to claim 1, characterized in that the introduction of the test solution with a greater ionic strength than the working solution in the electrochemical cell is carried out by transferring the immunosensitive sensor and the reference electrode from the container with a clean working solution to the container containing the working solution and solution with greater ionic strength.

7. The method according to claim 1, characterized in that for the quantitative assessment of the nature of the change in the magnitude of the voltage on the electrochemical cell, the difference between the values of the background and final voltages on the electrochemical cell is used.

8. The method according to claim 1, characterized in that for the quantitative assessment of the nature of the change in the magnitude of the voltage across the electrochemical cell, the difference between the maximum magnitude of the voltage across the electrochemical cell recorded upon contact of the immunosensitive sensor with the test solution and the magnitude of the background voltage across the electrochemical cell is used.

9. The method according to claim 1, characterized in that for the quantitative assessment of the nature of the change in the magnitude of the voltage on the electrochemical cell, use the difference between the maximum magnitude of the voltage on the electric cell recorded upon contact of the immunosensitive sensor with the test solution and the value of the final voltage on the electrochemical cell.

10. The method according to claim 1, characterized in that for the quantitative assessment of the nature of the change in the magnitude of the voltage on the electrochemical cell, use (in arbitrary units) the area under the curve of the change in time of the magnitude of the voltage on the electrochemical cell obtained by contact of the immunosensitive sensor with the test solution.

11. The method according to claim 1, characterized in that for the quantitative assessment of the nature of the change in the magnitude of the voltage on the electrochemical cell, the initial, final, average or maximum rate of change in the magnitude of the voltage on the electrochemical cell is used when the immunosensitive sensor contacts the test solution.