RU2102134C1

RU2102134C1 - Method of immunosorbent producing

Info

Publication number: RU2102134C1
Application number: RU95121203A
Authority: RU
Inventors: А.В. Брыкалов; И.В. Жарникова
Original assignee: Ставропольская Государственная Сельскохозяйственная Академия
Priority date: 1995-12-09
Filing date: 1995-12-09
Publication date: 1998-01-20

Abstract

FIELD: immunochemistry. SUBSTANCE: method involves activation of aerosil with an organic modifying agent dextran. At the following oxidation of modified sorption material with sodium perchlorate solution a carrier is activated with aldehyde groups which are able for chemical interaction with plague, tularemia and choleraic immunoglobulins. Invention is used for detection of specific reaction antigen-antibody in diagnosis using immunoenzymatic analysis, immunofluorescence reaction and bacteriological method. EFFECT: improved method of producing. 1 tbl

Description

Изобретение относится к иммунохимии и может быть использовано для выявления специфической реакции антиген-антитело в диагностике с помощью иммуноферментного анализа, реакции иммунофлуоресценции и бактериологического метода. The invention relates to immunochemistry and can be used to detect a specific antigen-antibody reaction in diagnosis using enzyme immunoassay, immunofluorescence reaction and bacteriological method.

Известен способ получения иммуносорбента на основе целлюлозы, включающий ковалентное связывание белкового лиганда с носителем. Недостатком способа является низкий уровень специфичности сорбента, кроме того, органический носитель непрочен, подвержен разрушению при воздействии микроорганизмов [1]
Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения полиакриламидного иммуносорбента методом эмульсионной полимеризации, содержащего магнитный порошок (Fe₂O₃) [2]
Недостатками указанного способа являются низкий уровень специфической емкости иммуносорбента, длительность и многостадийность процесса его получения, использование дорогостоящих импортных токсичных реактивов.A known method of producing an immunosorbent based on cellulose, comprising covalent binding of a protein ligand to a carrier. The disadvantage of this method is the low level of specificity of the sorbent, in addition, the organic carrier is weak, prone to destruction when exposed to microorganisms [1]
Closest to the proposed method is a method for producing a polyacrylamide immunosorbent by emulsion polymerization method containing magnetic powder (Fe ₂ O ₃ ) [2]
The disadvantages of this method are the low level of the specific capacity of the immunosorbent, the duration and multi-stage process of its preparation, the use of expensive imported toxic reagents.

Цель изобретения повышение специфической емкости, чувствительности и упрощение способа получения иммуносорбента. The purpose of the invention is the increase in specific capacity, sensitivity and simplification of the method of producing immunosorbent.

Цель достигается тем, что для увеличения специфической емкости, чувствительности иммуносорбента проводят модифицирование кремнеземного носителя аэросила 0,2 0,4% -ным раствором декстрана с последующим окислением полученного сорбента перхлоратом натрия. The goal is achieved in that in order to increase the specific capacity and sensitivity of the immunosorbent, the silica support of Aerosil is modified with a 0.2 0.4% dextran solution, followed by oxidation of the resulting sorbent with sodium perchlorate.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что осуществляется активирование носителя органическим полимерным материалом декстраном, представляющим собой полисахарид линейный полимер на основе циклической формы глюкозы, где звенья связаны α -1,6-гликозидной связью. При последующем оксилении модифицированного сорбционного материала раствором перхлората натрия получаемый продукт активирован альдегидными группами, которые способны к химическому взаимодействию с чумными, туляремийными и холерными иммуноглобулинами. The essence of the proposed method lies in the fact that the carrier is activated with an organic polymer material, dextran, which is a linear polysaccharide polymer based on the cyclic form of glucose, where the units are linked by an α -1,6-glycosidic bond. In the subsequent oxidation of the modified sorption material with sodium perchlorate solution, the resulting product is activated by aldehyde groups, which are capable of chemical interaction with plague, tularemia and cholera immunoglobulins.

1. Пример 1. Смесь, состоящую из 5 г аэросила и 1 г магнитного порошка, суспендируют в 100 мл 0,5%-ного водного раствора декстрана и далее выдерживают при температуре 24^oC 1 ч. Полученный сорбент высушивают при 100 - 110^oC в течение 30 мин. К полученному препарату добавляют 50 мл водного раствора, содержащего 2 г перхлората натрия, инкубируют смесь в темноте 1 ч. Затем сорбент отмывают 100 мл дистиллированной воды. К 0,02 г носителя приливают 1 мл чумных иммуноглобулинов с концентрацией по белку 4 мг/мл. Смесь оставляют при 24^oC в течение 2 ч, далее надсадочную жидкость удаляют, а носитель трижды по 10 мл промывают 0,9%-ным раствором хлорида натрия. Длительность получения иммуносорбента составляет 4,5 ч.1. Example 1. A mixture consisting of 5 g of aerosil and 1 g of magnetic powder is suspended in 100 ml of a 0.5% aqueous solution of dextran and then kept at a temperature of 24 ^o C for 1 hour. The resulting sorbent is dried at 100 - 110 ^o C for 30 minutes To the resulting preparation, add 50 ml of an aqueous solution containing 2 g of sodium perchlorate, incubate the mixture in the dark for 1 hour. Then, the sorbent is washed with 100 ml of distilled water. To 0.02 g of the carrier, 1 ml of plague immunoglobulins with a protein concentration of 4 mg / ml is poured. The mixture was left at 24 ^° C for 2 hours, then the supernatant was removed, and the support was washed three times with 10 ml each with 0.9% sodium chloride solution. The duration of the immunosorbent is 4.5 hours

Результаты определения специфической емкости иммуносорбента проводят методом иммунофлуоресценции. К 0,5 мл 10%-ного раствора иммуносорбента приливают 1 мл чумного микроба в концентрации 10³ микробных тел (м.т.)/мл и инкубируют смесь 1 ч при 24^oC. Далее иммуносорбент отмывают 50 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия. Вносят 0,5 мл иммуноглобинов чумных люминесцирующих в рабочем разведении и инкубируют 30 мин. 30 мин. Отмывают сорбент 0,9%-ным раствором хлорида натрия и проводят регистрацию результатов в люминесцирующем микроскопе Люмам P-2 по общепринятой DASS-системе. Параллельно с опытной пробой измеряют люминесценцию контрольной пробы (иммуносорбент без контакта с чумным микробом). Специфическая емкость иммуносорбента, измеренная методом иммунофлуоресценции, составляет 10 у.е. /мг. Чувствительность метода составляет 10³ м.т./мл чумного микроба.The results of determining the specific capacity of the immunosorbent are carried out by immunofluorescence. To 0.5 ml of a 10% solution of the immunosorbent is added 1 ml of the plague microbe at a concentration of 10 ³ microbial bodies (bw) / ml and the mixture is incubated for 1 h at 24 ^o C. Next, the immunosorbent is washed with 50 ml of 0.9% - solution of sodium chloride. Contribute 0.5 ml of plague luminescent immunoglobins in working dilution and incubate for 30 minutes. 30 min. The sorbent is washed with a 0.9% sodium chloride solution and the results are recorded in a Lumam P-2 luminescent microscope using the generally accepted DASS system. In parallel with the experimental sample, the luminescence of the control sample (immunosorbent without contact with the plague microbe) is measured. The specific capacity of the immunosorbent, measured by immunofluorescence, is 10 cu / mg The sensitivity of the method is 10 ³ MT / ml of the plague microbe.

Пример 2. Способ получения иммуносорбента осуществляют по методике примера 1, но для модифицирования аэросила используют 0,4%-ный раствор декстрана. Специфическая емкость составляет 10 у.е./ мг. Чувствительность метода составляет 10³ м.т./мл чумного микроба.Example 2. A method of obtaining an immunosorbent is carried out according to the method of example 1, but to modify aerosil using a 0.4% solution of dextran. The specific capacity is 10 cu / mg. The sensitivity of the method is 10 ³ MT / ml of the plague microbe.

Пример 3. Способ получения иммуносорбента осуществляют по методике примера 1, но для модифицирования аэросила используют 0,3%-ный раствор декстрана. Специфическая емкость составляет 9 у.е. /мг. Чувствительность метода составляет 10³ м.т./мл чумного микроба.Example 3. The method of producing immunosorbent is carried out according to the method of example 1, but for the modification of Aerosil using a 0.3% solution of dextran. The specific capacity is 9 cu / mg The sensitivity of the method is 10 ³ MT / ml of the plague microbe.

Пример 4. Способ получения иммуносорбента осуществляют по методике примера 1, но для модифицирования аэросила используют 0,2%-ный раствор декстрана. Специфическая емкость составляет 6 у.е./мг. Чувствительность метода составляет 10³м.т /мл чумного микроба.Example 4. The method of producing immunosorbent is carried out according to the method of example 1, but to modify aerosil using a 0.2% solution of dextran. The specific capacity is 6 cu / mg. The sensitivity of the method is 10 ³ mt / ml of the plague microbe.

Пример 5. Способ получения иммуносорбента осуществляют по методике примера 1, но для модифицирования аэросила используют 0,1%-ный раствор декстрана. Специфическая емкость составляет 4 у.е./мг. Чувствительность метода составляет 10³ м.т./мл чумного микроба.Example 5. The method of producing immunosorbent is carried out according to the method of example 1, but to modify aerosil using a 0.1% solution of dextran. The specific capacity is 4 cu / mg. The sensitivity of the method is 10 ³ MT / ml of the plague microbe.

Пример 6. Способ получения иммуносорбента осуществляют по методике примера 1, но на последнем этапе синтеза к 0,02 г активированного носителя приливают 1 мл туляремийных иммуноглобулинов с концентрацией по белку 4 мг/мл. Специфическая емкость иммуносорбента составляет 10³м.т./мл туляремийного микроба.Example 6. A method for producing an immunosorbent is carried out according to the procedure of Example 1, but at the last stage of synthesis, 1 ml of tularemia immunoglobulins with a protein concentration of 4 mg / ml is poured into 0.02 g of the activated carrier. The specific capacity of the immunosorbent is 10 ³ MT / ml of tularemia microbe.

Пример 7. Способ получения иммуносорбента осуществляют по методике примера 1, но на последнем этапе синтеза к 0,02 г активированного носителя приливают 1 мл холерных иммуноглобулинов с концентрацией по белку 4 мг/мл. Специфическая емкость иммуносорбента составляет 10 у.е./мг. Чувствительность метода составляет 10³м.т./мл. холерного вибриона.Example 7. A method for producing an immunosorbent is carried out according to the method of Example 1, but at the last stage of synthesis, 1 ml of cholera immunoglobulins with a protein concentration of 4 mg / ml are poured into 0.02 g of the activated carrier. The specific capacity of the immunosorbent is 10 cu / mg. The sensitivity of the method is 10 ³ mt / ml. cholera vibrio.

В отличие от прототипа предлагаемый способ получения иммуносорбента повышает специфическую емкость препарата в 3 3,5 раза, увеличивает чувствительность и при этом сокращается длительность синтеза иммуносорбента в 9 раз. Результаты представлены в таблице. In contrast to the prototype, the proposed method for producing an immunosorbent increases the specific capacity of the drug by 3.5 times, increases sensitivity, and at the same time, the duration of the synthesis of immunosorbent is reduced by 9 times. The results are presented in the table.

Как видно из таблицы, для модифицирования аэросила оптимален раствор декстрана с концентрацией 0,2 0,4% При увеличении концентрации до 0,5% не наблюдается увеличение специфической емкости иммуносорбента, тогда как уменьшение до 0,1% снижает специфическую емкость иммуносорбента. As can be seen from the table, dextran solution with a concentration of 0.2 0.4% is optimal for modifying aerosil. When the concentration is increased to 0.5%, the specific capacity of the immunosorbent is not increased, while a decrease to 0.1% decreases the specific capacity of the immunosorbent.

Положительный эффект и преимущества предлагаемого способа получения иммуносорбента объясняются тем, что в процессе получения композиционного органо-минерального носителя осуществляется активирование его поверхности декстраном. При последующем поверхностном окислении функциональных групп полисахарида образуются высокоактивные группы, которые реагируют с молекулами лиганда белковой природы иммуноглобулины чумные, туляремийные и холерные. Иммуносорбент, полученный по предлагаемому способу, обеспечивает повышение специфической емкости, чувствительности, характеризуется механической, химической и микробиологической устойчивостью. Кроме того, в отличие от прототипа способ отличается простотой технологии получения, исключающей токсические химические реагенты. The positive effect and advantages of the proposed method for producing an immunosorbent are explained by the fact that in the process of obtaining a composite organo-mineral carrier, its surface is activated by dextran. Subsequent surface oxidation of the functional groups of the polysaccharide results in the formation of highly active groups that react with ligand molecules of a protein nature, plague, tularemia and cholera immunoglobulins. The immunosorbent obtained by the proposed method provides an increase in specific capacity, sensitivity, characterized by mechanical, chemical and microbiological stability. In addition, in contrast to the prototype, the method is characterized by the simplicity of the production technology, excluding toxic chemicals.

Claims

A method of producing an immunosorbent, providing for covalent binding of a protein ligand of nature to a modified carrier, characterized in that aerosil modified with a 0.2 0.4% dextran solution and oxidized with sodium perchlorate is used as a carrier.