RU2098825C1

RU2098825C1 - Method for detecting proteins on histologic sections in applying methods of immunochemistry

Info

Publication number: RU2098825C1
Application number: RU94003431A
Authority: RU
Inventors: Д.В. Козлов; С.Г. Жабин
Original assignee: Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей
Priority date: 1994-01-28
Filing date: 1994-01-28
Publication date: 1997-12-10

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: method involves carrying out rehydration of histologic sections and removing paraffin residues, blocking endogenous peroxidase and then carrying out nonspecific sorption of immunoglobulins, treating the histologic sections with primary antibodies followed by their incubating with secondary antibodies, treating with avidin - peroxidase complex, detecting peroxidase activity, dying and detecting proteins by gold brown color being available. Polyethylene glycol 6000 is added to primary antibodies solution to achieve end concentration of 5% before treating the histologic sections with primary antibodies. EFFECT: enhanced reliability of diagnosis based on bioptic histologic sections or mammary gland cancer operation material.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии. The invention relates to medicine, namely to immunology.

Известен способ усиления чувствительности иммуногистохимического метода выявления антигенов путем применения солей некоторых металлов на конечном этапе метода. Следует отметить, что применение их не столько повышает чувствительность метода, сколько контрастирует искомые объекты, переводя золотисто-коричневую окраску их, получаемую без применения солей металлов, в сине-черные цвета. Отрицательными сторонами метода являются возрастание фонового окрашивания срезов, а также то, что некоторые соли металлов, например четырехокись осмия, являются токсичными веществами, в силу чего они малодоступны широкому применению (Дж. Полак и С.Ван Норден. М. Мир, 1987). A known method of enhancing the sensitivity of the immunohistochemical method for detecting antigens by using salts of certain metals at the final stage of the method. It should be noted that their use does not so much increase the sensitivity of the method as contrasts the desired objects, translating their golden brown color, obtained without the use of metal salts, into blue-black colors. The negative sides of the method are the increase in background staining of the sections, as well as the fact that some metal salts, for example osmium tetroxide, are toxic substances, and therefore they are inaccessible to widespread use (J. Polak and S. Van Norden. M. Mir, 1987).

Известен способ, выбранный в качестве прототипа, повышения детекции антигенов на гистологических срезах с помощью низких значений pH растворов, используемых в иммуногистохимическом методе, в частности и на этапе обработки гистологических срезов первичными антителами [1] Однако известно, что в таких случаях отмечается неспецифическое окрашивание срезов. Есть данные, что использование ацетатных буферов pH 5,0-5,1 не повышает чувствительность метода, что связано с тем, что авидность антигенов и антител при низких значениях pH резко снижается (Т. Нго и Р.Ленхофф. М. Мир, 1988.)
Задача изобретения заключается в увеличении чувствительности иммуногистохимической детекции протеинов в гистологических срезах путем повышения вязкости раствора, что увеличивает, ускоряет и усиливает сцепление искомых антигенов с применяемыми антителами.The known method, selected as a prototype, increasing the detection of antigens on histological sections using low pH solutions used in the immunohistochemical method, in particular at the stage of processing histological sections with primary antibodies [1] However, it is known that in such cases, non-specific staining of sections . There is evidence that the use of acetate buffers pH 5.0-5.1 does not increase the sensitivity of the method, due to the fact that the avidity of antigens and antibodies at low pH values decreases sharply (T. Ngo and R. Lenhoff. M. Mir, 1988 .)
The objective of the invention is to increase the sensitivity of immunohistochemical detection of proteins in histological sections by increasing the viscosity of the solution, which increases, accelerates and enhances the adhesion of the desired antigens with the antibodies used.

Поставленная задача достигается тем, что в способе, основанном на использовании иммунопероксидазной реакции на этапе обработки гистологических срезов первичными антителами в последние дополнительно вводят 5-ный раствор полиэтиленгликоля-6000 (ПЭГ-6000). The problem is achieved in that in a method based on the use of an immunoperoxidase reaction at the stage of processing histological sections with primary antibodies, the 5th solution of polyethylene glycol-6000 (PEG-6000) is additionally introduced into the latter.

Способ иммуногистохимической детекции протеинов на гистологических срезах основан на следующем. Иммуногистохимический метод представляет собой высокоспецифическую иммунную реакцию для идентификации антигенов в тканях. Любые тканевые антигены, против которых получены антитела, могут быть наглядно представлены с помощью распознающих их антител, меченных, например, ферментом пероксидазой хрена. Основные сложности в развитии иммунопероксидазного метода состоят в том, чтобы соединить пероксидазу с антителом без потери ферментной и антительной активности данного конъюгата. Высокая эффективность сцепления является решающей в этом процессе, поскольку немеченные антитела будут эффективно конкурировать с меченными пероксидазой антителами в иммуногистохимической реакции. The method of immunohistochemical detection of proteins on histological sections is based on the following. The immunohistochemical method is a highly specific immune response for the identification of antigens in tissues. Any tissue antigens against which antibodies are obtained can be visually represented using antibodies recognizing them, labeled, for example, with horseradish peroxidase enzyme. The main difficulties in the development of the immunoperoxidase method are to combine peroxidase with an antibody without loss of enzymatic and antibody activity of this conjugate. High coupling efficiency is critical in this process, since unlabeled antibodies will effectively compete with peroxidase-labeled antibodies in an immunohistochemical reaction.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем. The essence of the proposed method is as follows.

1. Регидратация срезов и удаление из них остатков парафина. Основной задачей данного этапа является обезвоживание и максимальное удаление парафина из тканей, так как минимальные остатки последнего приводят к повышению фонового окрашивания. Для этого срезы проводят через три порции о-ксилола, абсолютный этанол, спирт 70^o и 56^o, а также забуференный физиологический раствор (ЗФР) по 3 мин в каждой порции жидкости.1. Rehydration of sections and removal of paraffin residues from them. The main objective of this stage is to dehydrate and maximize the removal of paraffin from the tissues, since the minimum residues of the latter lead to an increase in background staining. To do this, the sections are carried out through three portions of o-xylene, absolute ethanol, alcohol 70 ^o and 56 ^o , as well as buffered saline solution (PBS) for 3 minutes in each portion of the liquid.

2. Блокирование эндогенной пероксидазы осуществляют путем внесения на срез нескольких капель 3-ной перекиси водорода на 10 мин. 2. Blocking of endogenous peroxidase is carried out by introducing into the cut several drops of 3rd hydrogen peroxide for 10 minutes.

3. Блокирование неспецифической сорбции иммуноглобулинов достигают путем нанесения на срез лошадиной сыворотки в разведении 1:20 на 30 мин. 3. Blocking non-specific sorption of immunoglobulins is achieved by applying horse serum to a slice at a dilution of 1:20 for 30 minutes.

4. Этап обработки гистологических срезов первичными антителами концентрации 8 мкг/мл, разведенными в ЗФР, с добавлением 3-ного альбумина и 0,01-ного азида натрия. К полученному раствору добавляют 5-ный раствор ПЭГ-6000. Данная концентрация подбиралась опытным путем и оказалась наиболее результативной среди испытанных растворов ПЭГ-6000 с концентрацией 0,2-15 Усиление прочности и скорости сцепления первичных антител с выявляемыми антигенами обеспечивается за счет увеличения вязкости раствора первичных антител при добавлении к ним раствора ПЭГ-6000, что приводит к увеличению чувствительности иммунной реакции. Инкубация срезов осуществляется в течение 30 мин при 37^oC.4. The stage of processing histological sections with primary antibodies of a concentration of 8 μg / ml, diluted in PBS, with the addition of 3-m albumin and 0,01-m sodium azide. To the resulting solution was added a 5% PEG-6000 solution. This concentration was selected empirically and turned out to be the most effective among the tested PEG-6000 solutions with a concentration of 0.2-15. Strengthening the strength and adhesion rate of primary antibodies to detectable antigens is ensured by increasing the viscosity of the primary antibody solution when PEG-6000 solution is added to them, which leads to an increase in the sensitivity of the immune response. Incubation of sections is carried out for 30 min at 37 ^o C.

5. Инкубация гистологических срезов вторичными антителами в разведении 10 мкг/мл ЗФР на 30 мин. 5. Incubation of histological sections with secondary antibodies at a dilution of 10 μg / ml PBS for 30 minutes.

6. Обработка срезов комплексом авидин-пероксидаза в концентрации 25 мкг/мл в течение 30 мин. 6. Processing sections with a complex of avidin-peroxidase at a concentration of 25 μg / ml for 30 minutes

7. Проявление пероксидазной активности 3,3'-диаминобензидина тетрахлоридом (ДАБ) в ЗФР при соотношении 500 мкг ДАБ на 1 мл ЗФР. К свежеприготовленному раствору прибавляют 0,03-ную перекись водорода и срезы инкубируют с субстратом в течение 10 мин. Реакцию останавливают погружением срезов в дистиллированную воду. В дальнейшем срезы докрашивают гематоксидином в течение 3 мин, проводят по спиртам восходящей концентрации и трем порциям о-ксилола, заключают в канадский бальзам. 7. The manifestation of peroxidase activity of 3,3'-diaminobenzidine tetrachloride (DAB) in PBS at a ratio of 500 μg DAB per 1 ml of PBS. 0.03% hydrogen peroxide is added to the freshly prepared solution and the sections are incubated with the substrate for 10 minutes. The reaction is stopped by immersion of the slices in distilled water. Subsequently, the sections were stained with hematoxidine for 3 minutes, carried out with ascending alcohols and three portions of o-xylene, and enclosed in Canadian balsam.

При осуществлении иммуногистохимического метода всякий раз обязательно используют "положительный контроль", то есть срезы аналогичной исследуемой ткани с заведомо позитивной реакцией. В качестве положительного контроля в данном случае используются гистологические срезы без добавления ПЭГ-6000. Кроме того, используют "отрицательный контроль", то есть срезы аналогичной ткани, в которых опускаются 4 или 5 этапы реакции с целью обнаружения возможного фонового окрашивания. Другими словами это тест на качество забивки эндогенной пероксидазы. When implementing the immunohistochemical method, always use the "positive control", that is, sections of a similar test tissue with a positive reaction. In this case, histological sections without adding PEG-6000 are used as a positive control. In addition, a “negative control” is used, that is, sections of a similar tissue in which 4 or 5 reaction steps are omitted in order to detect possible background staining. In other words, this is a test for the quality of clogging of endogenous peroxidase.

Результаты предлагаемого способа представляли собой увеличение чувствительности метода, что проявлялось более интенсивным и детальным прокрашиванием искомых структур в гистологических препаратах, достигающим 30 по сравнению с "положительным контролем". The results of the proposed method was an increase in the sensitivity of the method, which was manifested by a more intense and detailed staining of the desired structures in histological preparations, reaching 30 compared with the "positive control".

Пример 1. Иммуногистохимическая детекция альфа₂-макроглобулина в ткани рака молочной железы.Example 1. Immunohistochemical detection of alpha ₂ -macroglobulin in breast cancer tissue.

Фрагменты операционного материала рака молочной железы фиксируют 15-ным водным нейтральным раствором формалина в течение суток при комнатной температуре. В последующем материал подвергают парафиновой проводке, заключающейся в проведении его по батарее, включающей ряд жидкостей: о-ксилол 30 мин, две порции 70^o и 80^o этанола по 6 ч в каждой; три порции 96^o этанола по 6 ч в каждой; абсолютный спирт 30 мин; абсолютный спирт-ксилол в равных соотношениях в течение 2 ч; ксилол-парафин в равных соотношениях при температуре 37^oC 2 ч; три порции парафина при 58^oC по одному часу в каждой. Последняя порция парафина отличается от первых двух тем, что на 500 г его внесено 30 г пчелиного воска. Пропитанные парафином кусочки охлаждают на воздухе, наклеивают на деревянные блоки. Гистологические срезы толщиной 5-8 мкм готовят с помощью микротома. Депарафинирование гистологических срезов проводят обработкой их в трех порциях о-ксилола по 5 мин в каждой и последующим прогреванием срезов в термостате при 58^oC в течение 5 мин. Обезвоживание гистологических срезов достигают обработкой их в четырех порциях этанола (абсолютный, 96^o, 70^o и 56^o) по 3 мин в каждой. Далее срезы переводят на 5 мин в 0,05 М ЗФР pH 7,6. Блокирование эндогенной пероксидазы (этот и последующие этапы проводят в чашках Петри) осуществляют свежим 3-ным раствором перекиси водорода. Длительность этапа 10 мин. ЗФР 5 мин. Далее выдерживают срезы под каплей 5-ного раствора лошадиного сывороточного альбумина (50 мг альбумина в 1 мл ЗФР). После этого избыток альбумина стряхивают и аккуратно обтирают предметные стекла вокруг среза. На последний наносят каплю афинно очищенных кроличьих первичных антител против альфа₂-макроглобулина в концентрации 8 мкг/мл ЗФР. Раствор антител включает 3 альбумина и 0,01 азида натрия. С целью увеличения вязкости раствора добавляют ПЭГ-6000 до конечной его концентрации в растворе 5 Инкубацию срезов проводят в течение 30 мин при 37^oC в чашках Петри с созданием условий влажной камеры (на дно чашки укладывают фильтровальную бумагу, смоченную ЗФР). Две порции ЗФР по 5 мин в каждой, после чего ЗФР меняют. Инкубируют гистологические срезы во вторичных биотилинированных антителах в разведении 10 мкг на 1 мл ЗФР в течение 30 мин. ЗФР 5 мин. Обрабатывают срезы комплексом авидин-пероксидаза ("Пептос", Москва) в течение 30 мин. Непосредственно перед применением комплекс разводят в 200 раз в ЗФР. ЗФР 5 мин. Иммунологическое проявление осуществляют в 0,03-ном растворе субстрата в течение 10 мин. Раствор получают смешивая непосредственно перед использованием 1 мг ДАБ ("Sigma", США) с 2 мл ЗФР и 0,2 мл 0,3 -ной перекиси водорода. Реакцию останавливают споласкиванием срезов в двух порциях дистиллированной воды.Fragments of the surgical material for breast cancer are fixed with a 15th aqueous neutral formalin solution for 24 hours at room temperature. Subsequently, the material is subjected to paraffin wiring, which consists in conducting it through a battery, including a number of liquids: o-xylene for 30 minutes, two portions of 70 ^° and 80 ^{° of} ethanol for 6 hours each; three servings of 96 ^° ethanol for 6 hours each; absolute alcohol 30 min; absolute alcohol-xylene in equal proportions for 2 hours; xylene-paraffin in equal proportions at a temperature of 37 ^o C 2 h; three portions of paraffin at 58 ^o C for one hour each. The last portion of paraffin differs from the first two in that 30 g of beeswax are added to 500 g of it. The paraffin-impregnated pieces are cooled in air and glued onto wooden blocks. Histological sections 5-8 μm thick are prepared using a microtome. Histological sections were dewaxed by treating them in three portions of o-xylene for 5 minutes each and then heating the sections in an thermostat at 58 ^° C for 5 minutes. Dehydration of the histological sections is achieved by treating them in four portions of ethanol (absolute, 96 ^° , 70 ^° and 56 ^° ) for 3 minutes each. Next, the sections are transferred for 5 min in 0.05 M SFR pH 7.6. Blocking endogenous peroxidase (this and subsequent steps is carried out in Petri dishes) is carried out with a fresh 3-nd solution of hydrogen peroxide. The duration of the stage is 10 minutes. SFR 5 min. Next, the sections are kept under a drop of a 5th solution of equine serum albumin (50 mg of albumin in 1 ml of PBS). After that, excess albumin is shaken off and the glass slides carefully wiped around the slice. A drop of affinity purified rabbit primary antibody against alpha ₂ -macroglobulin at a concentration of 8 μg / ml PBS is applied to the latter. The antibody solution includes 3 albumin and 0.01 sodium azide. In order to increase the viscosity of the solution, PEG-6000 is added to its final concentration in solution 5. The sections were incubated for 30 min at 37 ^° C in Petri dishes with the conditions of a wet chamber (filter paper moistened with PBS was placed on the bottom of the cup). Two portions of PBS for 5 minutes each, after which the PBS is changed. Histological sections were incubated in secondary biotilinated antibodies at a dilution of 10 μg per 1 ml of PBS for 30 minutes. SFR 5 min. Slices are treated with avidin-peroxidase complex (Peptos, Moscow) for 30 minutes. Immediately before use, the complex is diluted 200 times in PBS. SFR 5 min. Immunological manifestation is carried out in a 0.03-mm solution of the substrate for 10 minutes The solution is prepared by mixing immediately before use 1 mg DAB (Sigma, USA) with 2 ml of PBS and 0.2 ml of 0.3% hydrogen peroxide. The reaction is stopped by rinsing the sections in two portions of distilled water.

Учитывая, что полученные темно-коричневые преципитаты ДАБ нерастворимы в воде, спирте, ксилоле осуществляют окраску ядер клеток гематоксилином Майера в течение 3 мин. Далее срезы проводят через свежие спирты восходящей концентрации (56^o, 70^o, 96^o и абсолютный этанол) и три ксилола путем тщательного споласкивания в каждой жидкости, затем срезы заключают в бальзам.Considering that the obtained dark brown DAB precipitates are insoluble in water, alcohol, xylene, the nuclei of the cells are stained with Mayer hematoxylin for 3 minutes. Next, the sections are carried out through fresh alcohols of ascending concentration (56 ^o , 70 ^o , 96 ^o and absolute ethanol) and three xylenes by thorough rinsing in each liquid, then the sections are enclosed in a balm.

Результат читают под разными увеличениями светового микроскопа по наличию золотисто-коричневого окрашивания изучаемого белка в опытных микропрепаратах и "положительном контроле", при отсутствии окраски в "отрицательном контроле". Использование 5-ного ПЭГ-6000 на уровне первичных антител увеличивает чувствительность метода на 25 по сравнению с "положительным контролем". Это проявляется большей интенсивностью окраски белка в опытных микропрепаратах, достигающей в основном темно-коричневого цвета. Повышение иммунопероксидазной детекции исследуемого белка расширяет диагностические возможности исследователя-патологоанатома, за счет чего улучшается диагностика злокачественных опухолей, в частности рака молочной железы. The result is read under different magnifications of the light microscope by the presence of a golden brown staining of the studied protein in the experimental micropreparations and the "positive control", in the absence of color in the "negative control". The use of the 5th PEG-6000 at the level of primary antibodies increases the sensitivity of the method by 25 compared with the "positive control". This is manifested by a higher intensity of protein staining in the experimental micropreparations, reaching mainly a dark brown color. An increase in the immunoperoxidase detection of the protein under investigation expands the diagnostic capabilities of the pathologist researcher, thereby improving the diagnosis of malignant tumors, in particular breast cancer.

Пример 2. Иммуногистохимическая детекция ассоциированного с беременностью альфа₂-гликопротеина в ткани рака молочной железы.Example 2. Immunohistochemical detection of pregnancy-associated alpha ₂ -glycoprotein in breast cancer tissue.

Для реакции использовались гистологические срезы операционного материала рака молочной железы, полученные согласно описанной в примере 1 схеме. Отличий было два. Прежде всего использовались афинно очищенные кроличьи первичные антитела против ассоциированного с беременностью альфа₂-гликопротеина. Последний так же, как и альфа₂-макроглобулин является представителем семейства макроглобулинов и тоже является ингибитором протеиназ. Во-вторых, на заключительном этапе иммуногистохимической реакции осуществлялось контрастирование гистологических срезов солями кобальта, которые добавлялись в приготовленный раствор субстрата, как описано выше (см. пример 1). Для приготовления раствора брали 0,04 мл 1-ного водного раствора хлорида кобальта на 2 мл свежеприготовленного раствора ДАБ. Срезы обрабатывались в течение 10 мин, после чего реакция останавливалась споласкиванием их в дистиллированной воде. Далее следовали этапы заключения срезов и их микроскопия.For the reaction, histological sections of the surgical material for breast cancer were used, obtained according to the scheme described in example 1. There were two differences. First of all, affinity purified rabbit primary antibodies were used against pregnancy-associated alpha ₂ -glycoprotein. The latter, like alpha ₂ -macroglobulin, is a member of the macroglobulin family and is also an inhibitor of proteinases. Secondly, at the final stage of the immunohistochemical reaction, histological sections were contrasted with cobalt salts, which were added to the prepared substrate solution, as described above (see example 1). To prepare the solution, 0.04 ml of a 1% aqueous solution of cobalt chloride was taken per 2 ml of a freshly prepared DAB solution. Slices were processed for 10 min, after which the reaction was stopped by rinsing them in distilled water. This was followed by the stages of the conclusion of the slices and their microscopy.

Исследование готовых микропрепаратов показало увеличение чувствительности метода, проявляющееся большей на 30 против "положительного контроля" интенсивностью и детализацией структур искомого белка в опытных препаратах. Увеличение чувствительности метода реализовалось в улучшении диагностики злокачественной опухоли в гистологических срезах биоптатов или операционного материала рака молочной железы. The study of finished micropreparations showed an increase in the sensitivity of the method, which manifests itself by 30 more against the "positive control" of the intensity and detail of the structures of the desired protein in the experimental preparations. An increase in the sensitivity of the method was realized in improving the diagnosis of a malignant tumor in histological sections of biopsy specimens or surgical material for breast cancer.

Claims

The method of immunohistochemical detection of proteins on histological sections, including their rehydration and removal of paraffin residues from them, blocking endogenous peroxidase and then non-specific sorption of immunoglobulins, processing of histological sections with primary antibodies, followed by incubation with secondary antibodies, treatment with avidin peroxidase complex, manifestation of peroxidase activity, manifestation, and detection of proteins by the presence of golden brown staining, characterized in that before processing histo logical sections of primary antibodies in their solution is additionally introduced polyethylene glycol 6000 to a final concentration in solution of 5%