RU2094464C1

RU2094464C1 - Method of incorporation of exogenous plasmid dna to mammalian cells culturing in vitro

Info

Publication number: RU2094464C1
Application number: RU93038111A
Authority: RU
Inventors: И.П. Савченкова; Н.И. Сергеев
Original assignee: Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства
Priority date: 1993-07-26
Filing date: 1993-07-26
Publication date: 1997-10-27

Abstract

FIELD: biotechnology, genetic engineering. SUBSTANCE: mammalian cells culturing in vitro were pressed by cover glass perpendicularly to monolayer surface in PBS-buffer containing exogenous DNA at concentration 10-40 mcg/ml. Glass is removed and cells were incubated in the same solution at 37 C for 40-60 min. Method can be used for study of genetic members (promoters, enhancers) taking part in gene expression regulation, tissue specificity and related branches. Invention can be used in genetic engineering studies, agriculture, biotechnology, medicine, veterinary science. EFFECT: improved method of DNA incorporation, simplified method. 2 tbl

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии. The invention relates to biotechnology, in particular to genetic engineering.

Известен кальций-фосфатный способ генетической трансформации клеток млекопитающих. Принцип способа заключается в соосаждении ДНК с фосфатом кальция и обработки клеток образующимся преципитатом. Способ позволяет значительно повысить устойчивость ДНК в составе преципитата к действию внутриклеточных и внеклеточных дезоксирибонуклеаз. При этом кальций-фосфатный преципитат ДНК образуется в широком диапазоне концентраций ДНК и значений pH раствора (Глебов О.К. Абрамян Д.С. Томилин Н.В. Генетическая трансформация соматических клеток. 1. Клон клеток китайского хомячка дефектных по тимидинкиназе, отличающийся высокой эффективностью трансформации. -Цитология, 1985, т.27, N 4, с.467-476). Стандартный кальций-фосфатный метод трансфекции обеспечивает частоту стабильной трансформации в пределах 10^-5. Этот метод мало эффективен. Кроме того, эффективность этого способа зависит от образования ДНК-преципитата, который очень чувствителен к значению pH растворов.Known calcium phosphate method for the genetic transformation of mammalian cells. The principle of the method is the coprecipitation of DNA with calcium phosphate and the treatment of cells with the resulting precipitate. The method can significantly increase the resistance of DNA in the composition of the precipitate to the action of intracellular and extracellular deoxyribonucleases. In this case, calcium phosphate precipitate of DNA is formed in a wide range of DNA concentrations and pH values of the solution (Glebov OK, Abramyan D.S. Tomilin N.V. Genetic transformation of somatic cells. 1. Clone of Chinese hamster cells defective in thymidine kinase, characterized by high the effectiveness of the transformation. — Cytology, 1985, v. 27, No. 4, pp. 467-476). The standard calcium phosphate transfection method provides a stable transformation frequency in the range of 10 ^-5 . This method is not very effective. In addition, the effectiveness of this method depends on the formation of a DNA precipitate, which is very sensitive to the pH of the solutions.

При улучшении обычной кальций-фосфатной процедуры путем добавления в среду сразу после глициринового шока бутирата натрия число клеток, экспрессирующих вводимый ген, увеличивается в среднем в четыре раза (Томилин Н.В. Новые системы генетической трансформации соматических клеток млекопитающих. Биотехнология, 1987, т. 3, N 3, с. 343-354). When the usual calcium-phosphate procedure is improved by adding sodium butyrate to the medium immediately after glycine shock, the number of cells expressing the introduced gene increases on average by a factor of four (Tomilin N.V. New systems for the genetic transformation of somatic mammalian cells. Biotechnology, 1987, vol. 3, N 3, pp. 343-354).

При замене стандартного буфера HEPES на BBS и сдвига pH с 7,15 на 6,95 эффективность стабильной трансформации ДНК кальций-фосфатного метода повышается до 50% (Chen C. Okayma H. High-effiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol. and Cell Biology. 1987, v. 8, N 8, p. 2745-2752). By replacing the standard HEPES buffer with BBS and shifting the pH from 7.15 to 6.95, the stability of the DNA transformation of the calcium phosphate method is increased to 50% (Chen C. Okayma H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol. and Cell Biology. 1987, v. 8, N 8, p. 2745-2752).

Известны способы введения изолированной ДНК в клетки млекопитающих ДЕАД-декстран (Holter Wolfgang, Fordis C.Michael et.al.Efficient gene transfer by sequentiel treatment of mammalian cells with DEAE-dextran. Exp.cell.Res. 1989, v. 184, N 2, p. 546-551), а также с помощью фосфат-стронция (Brash D. E. Redel R. R. Strontium phosphate transfection of human cell in primary culture: stable expression of the simian virus 4C large-T-antigen gene in primary human bronchial epithelial cell.-Mol.Cell.Biol. 1987, v. 7, N 5, p. 2031-2034) и слияния мембран (Felgner P.L. Ringold G.M. Cationic liposome-mediated transfection. Nature, 1989, v. 337, N 6205, p. 387-388.). Эти способы используются в практике, но недостаточно эффективны. Known methods for introducing isolated DNA into mammalian cells are DEAD-dextran (Holter Wolfgang, Fordis C. Michael et.al. Efficient gene transfer by sequentiel treatment of mammalian cells with DEAE-dextran. Exp.cell.Res. 1989, v. 184, N 2, p. 546-551), as well as using strontium phosphate (Brash DE Redel RR Strontium phosphate transfection of human cell in primary culture: stable expression of the simian virus 4C large-T-antigen gene in primary human bronchial epithelial cell .-Mol. Cell Biol. 1987, v. 7, N 5, p. 2031-2034) and membrane fusion (Felgner PL Ringold GM Cationic liposome-mediated transfection. Nature, 1989, v. 337, N 6205, p. 387-388.). These methods are used in practice, but not effective enough.

Известны способы микроинъекции (Cappecchi M.R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells.-Cell, 1980, v. 22, N 2, p. 479-488) и микроукалывания клеток (Такада Синдзи, Обината Масуа. Введение генов с помощью микроинъекций и уколов клетки. Био индастри. Bio Industry, 1986, v. 3, N 10, p. 821-826). Эти способы эффективны, но очень трудоемки и требуют наличия дорогого оборудования. Known methods of microinjection (Cappecchi MR High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells.-Cell, 1980, v. 22, No. 2, p. 479-488) and cell micro-stabilization (Takada Shinji, Obinata Masua. Introduction of genes with using microinjections and injections of the cell. Bio Industry. Bio Industry, 1986, v. 3, N 10, p. 821-826). These methods are effective, but very laborious and require expensive equipment.

Способы с использованием физических агентов: импульсов электрического тока (Latsuca Masaaki, Orita Satoshi. An improved method of electroporation for introducing biologically active foreign genes into cultured mammalian cells. Exp.Cell.Res. 1988, v. 178, N 1, p. 154-162), лазерного облучения и ультразвука (Fechheimer M. Boylan J.F. Parker S. et al. Transfections of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonification loading. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, v. 84, p. 8463-8471) не во всех лабораториях могут быть использованы. Methods using physical agents: electric current pulses (Latsuca Masaaki, Orita Satoshi. An improved method of electroporation for introducing biologically active foreign genes into cultured mammalian cells. Exp.Cell.Res. 1988, v. 178, No. 1, p. 154 -162), laser irradiation and ultrasound (Fechheimer M. Boylan JF Parker S. et al. Transfections of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonification loading. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, v. 84 , p. 8463-8471) not all laboratories may be used.

Способ введения ДНК путем инфицирования клеток рекомбинантными вирусами и вирусными частицами, собранными in vitro (Edlitis M.A. Kantoff P.W. Retroviral-mediated gene transfer into hemopoiietic cells. Mol. Biol. Hemopoiesis. Proc. 3rd Annu Symp. Rye. Brook, N.Y. Nov. 6-7, 1987, New York: London, 1988, p. 19-27) обеспечивает высокий уровень (до 100%) заражения клеток. Его существенным недостатком является возможность активизации клеточного онкогена при интеграции ретровируса, что может привести к злокачественной трансформации. Method for introducing DNA by infecting cells with recombinant viruses and viral particles collected in vitro (Edlitis MA Kantoff PW Retroviral-mediated gene transfer into hemopoiietic cells. Mol. Biol. Hemopoiesis. Proc. 3rd Annu Symp. Rye. Brook, NY Nov. 6- 7, 1987, New York: London, 1988, p. 19-27) provides a high level (up to 100%) of cell infection. Its significant drawback is the possibility of activating the cellular oncogen with the integration of a retrovirus, which can lead to malignant transformation.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ, взятый в качестве прототипа, сущность которого заключается в том, что ДНК механически вводят в ядра культивируемых клеток путем прокалывания клеток. Непосредственно перед трансфекцией на клетки наслаивают буфер PBS, содержащий экзогенную ДНК в концентрации 5-1000 мкг/мл. Все клетки прокалывают по возможности один раз в области ядра стеклянной микроиглой, пока кончик иглы не коснется подложки. Сразу после прокалывания среду (ДНК в буфере PBS) меняют на нормальную ростовую среду (Спандидос Д. Уюки Н. Эксспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих. В кн. Транскрибция и трансляция. Методы. М. Мир, 1987, с. 48). The closest in technical essence and the achieved result is a method taken as a prototype, the essence of which is that DNA is mechanically introduced into the nuclei of cultured cells by puncturing the cells. Immediately prior to transfection, PBS buffer containing exogenous DNA at a concentration of 5-1000 μg / ml is layered onto the cells. All cells are punctured whenever possible in the core region with a glass microneedle until the tip of the needle touches the substrate. Immediately after piercing, the medium (DNA in PBS buffer) is changed to normal growth medium (Spandidos D. Uyuki N. Expression of exogenous DNA in mammalian cells. In the book. Transcription and translation. Methods. M. Mir, 1987, p. 48).

Этот способ обеспечивает сравнительно высокую эффективность введения ДНК в клетки млекопитающих. Однако он требует наличия дорогой и часто недоступной микроманипуляционной техники, очень трудоемок и требует хороших навыков исследователя в области "прокалывания". Даже опытный специалист может проколоть за 1 ч не более 100 клеток. This method provides a relatively high efficiency of introducing DNA into mammalian cells. However, it requires an expensive and often inaccessible micromanipulation technique, it is very laborious and requires good research skills in the field of “piercing”. Even an experienced specialist can inject no more than 100 cells in 1 h.

Цель изобретения создание простого, не требующего дорогого специального оборудования (микроскопов, микроманипуляторов и т.д.), быстрого способа получения клеток с трансформированным фенотипом, обладающего достаточно высокой эффективностью. The purpose of the invention is the creation of simple, not requiring expensive special equipment (microscopes, micromanipulators, etc.), a quick way to obtain cells with a transformed phenotype, which has a sufficiently high efficiency.

Поставленная цель достигается тем, что предложен способ, согласно которому клетки млекопитающих, культивируемые in vitro, придавливают покровным стеклом перпендикулярно поверхности монослоя в PBS-буфере, содержащем экзогенную ДНК в концентрации 10-40 мкг/мл, стекло убирают, а клетки инкубируют (в буфере с донорной ДНК) в течение 40-60 мин при 37^oC.This goal is achieved by the fact that the proposed method, according to which mammalian cells cultured in vitro, is pressed with a cover glass perpendicular to the surface of the monolayer in a PBS buffer containing exogenous DNA at a concentration of 10-40 μg / ml, the glass is removed, and the cells are incubated (in buffer with donor DNA) for 40-60 minutes at 37 ^o C.

Пример. Для введения трансгена, т.е. экзогенной ДНК плазмид, в клетки, культивируемые in vitro, использовали ДНК плазмид: pCMV-lacZ, содержащую ген lacZ; pSV-neo; ДНК спермы лосося (Sigma). В опыте использовали клетки почки эмбриона свиньи (СПЭВ); клетки трахеи эмбриона коров (FBT) и клетки эмбриональных фибробластов мыши (ЗТЗ Bald/C). Example. For the introduction of a transgene, i.e. exogenous plasmid DNA, plasmid DNA was used in cells cultured in vitro: pCMV-lacZ containing the lacZ gene; pSV-neo; Salmon sperm DNA (Sigma). In the experiment, pig embryonic kidney cells (SPEV) were used; cows embryonic tracheal cells (FBT) and mouse embryonic fibroblast cells (ZTZ Bald / C).

За день перед трансфекцией клетки рассеивают в чашки Петри с d=3,5 см в концентрации 10⁵ см² и инкубируют при 37^oC в течение ночи. Непосредственно перед трансфекцией клетки промывают 2-3 раза буфером PBS pH 7,2. Переосаждают двухкратно в 70^o этаноле при 5 тыс. оборотов в течение 15 мин донорную ДНК и растворяют в буфере (0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ трис-HCl, pH 8,0) а затем добавляют к клеткам, находящимся в PBS, до конечной концентрации ДНК 10-40 мкг/мл. Клетки в растворе с донорной ДНК накрывают стерильным покровным стеклом и придавливают перпендикулярно поверхности монослоя равномерными, круговыми движениями. Затем покровное стекло удаляют, а клетки инкубируют при 37^oC с 5%-ным CO₂ в этом же растворе в течение 40-60 мин. После клетки тщательно промывают буфером PBS 3 раза и среду меняют на нормальную ростовую среду.The day before transfection, the cells are scattered in Petri dishes with d = 3.5 cm at a concentration of 10 ⁵ cm ² and incubated at 37 ^o C overnight. Immediately prior to transfection, cells are washed 2-3 times with PBS pH 7.2. Reprecipitate twice in 70 ^o ethanol at 5 thousand revolutions for 15 min donor DNA and dissolve in buffer (0.1 mm EDTA, 1 mm Tris-HCl, pH 8.0) and then add to the cells in PBS to final DNA concentration of 10-40 μg / ml. Cells in a solution with donor DNA are covered with a sterile coverslip and squeezed perpendicular to the surface of the monolayer with uniform, circular motions. Then the coverslip was removed and the cells were incubated at 37 ^° C with 5% CO ₂ in the same solution for 40-60 minutes. After the cells are thoroughly washed with PBS 3 times and the medium is changed to normal growth medium.

Температура 37^oC и наличие CO₂ является одним из основных общепринятых условий, необходимых для культивирования клеток in vitro.The temperature of 37 ^o C and the presence of CO ₂ is one of the main generally accepted conditions necessary for culturing cells in vitro.

Временная экспрессия гена lacZ, связанная с выявлением β-gal активности в трансформированных клетках, была обнаружена на второй день после проведения трансфекции. Temporary expression of the lacZ gene associated with the detection of β-gal activity in transformed cells was detected on the second day after transfection.

Установлено, что оптимальное время инкубирования культивируемых клеток в растворе экзогенной ДНК, при котором наблюдается экспрессия трансгена, составило от 40 до 60 мин (табл. 1). Ниже этого значения экспрессия трансгена не наблюдалась, при более длительной инкубации клеток в растворе с ДНК наблюдалась гибель клеток. It was found that the optimal incubation time of cultured cells in a solution of exogenous DNA, at which transgene expression is observed, ranged from 40 to 60 minutes (Table 1). Below this value, transgene expression was not observed; during a longer incubation of cells in a solution with DNA, cell death was observed.

Результаты опытов показали также, что оптимальный уровень концентрации экзогенной (донорной) ДНК в буфере PBS составил 10-40 мкг/мл (табл. 2). При величине этого показателя ниже и выше отмеченного уровня экспрессия трансгена не была установлена. The experimental results also showed that the optimal concentration level of exogenous (donor) DNA in the PBS buffer was 10–40 μg / ml (Table 2). With the value of this indicator below and above the noted level, transgene expression has not been established.

Частота трансформации, т. е. число трансформантов на использованное в опыте количество клеток, составила 2,7 • 10^-4-5,2 • 10^-4 клеток. Эффективность трансформации, выраженная числом трансформантов в расчете на 1 мкг/мл плазмидной ДНК, составляла 1,3 • 10^-4-2,8 • 10^-4.The frequency of transformation, i.e., the number of transformants per cell number used in the experiment, amounted to 2.7 • 10 ^-4 -5.2 • 10 ^-4 cells. The transformation efficiency, expressed as the number of transformants per 1 μg / ml plasmid DNA, was 1.3 • 10 ^-4 -2.8 • 10 ^-4 .

Изобретение применимо в генно-инженерных лабораториях для быстрого анализа и характеристики клонированных генов. Это удобный способ для изучения генетических элементов (промоторов, энхансеров), участвующих в регуляции экспрессии гена, в научных исследованиях, направленных на изучение экспрессии трансгена (в частности тканеспецифичности). Изобретение может быть использовано для получения генетически трансформированных клеток млекопитающих, в том числе сельскохозяйственных животных в культуре, продуцирующих биологически активные белки, используемые в народном хозяйстве, медицине, ветеринарии. The invention is applicable in genetic engineering laboratories for rapid analysis and characterization of cloned genes. This is a convenient way to study the genetic elements (promoters, enhancers) involved in the regulation of gene expression, in scientific studies aimed at studying the expression of transgene (in particular tissue specificity). The invention can be used to obtain genetically transformed mammalian cells, including farm animals in culture, producing biologically active proteins used in the national economy, medicine, and veterinary medicine.

Claims

A method of introducing exogenous plasmid DNA into mammalian cells cultured in vitro, including mechanical processing of cells contained in PBS buffer, with DNA, characterized in that the mechanical processing of cells is carried out by pressing cells with a coverslip perpendicular to the surface of the monolayer in a buffer containing exogenous DNA at a concentration of 10 - 40 μg / ml, then the glass is removed, and the cells are incubated in the same solution for 40-60 minutes at 370 ^o C.