RU2092810C1

RU2092810C1 - Method for applying suspension sample for study of suspended particles, and method for evaluating particle size and number in suspension

Info

Publication number: RU2092810C1
Application number: RU95104626A
Authority: RU
Inventors: Э.Г. Побелянский; А.В. Ничиков
Original assignee: Акционерное общество закрытого типа Научно-производственное предприятие "Парус"
Priority date: 1995-03-27
Filing date: 1995-03-27
Publication date: 1997-10-10
Also published as: RU95104626A

Abstract

FIELD: medicine; powder metallurgy; production of metalloceramics, etc wherever it is necessary to study microparticles by evaluating their size and number. SUBSTANCE: method resides in preparing suspension sample to form from it monolayer in form of constant-width band on wettable surface by performing mutual movements of predetermined sample volume and said surface at constant speed. During sample preparation step, sample is diluted in preservative liquid in which polymer is dissolved in concentration 4-10%. As result of monolayer formation step, monolayer immobilized with thin polymeric film is formed. Proposed method for evaluating particle size and number is suspension comprises following steps: applying predetermined sample volume onto wettable surface, illuminating surface with particles applied thereonto by light beam, while uniformly displacing surface normally to optical axis of system, followed by studying data thus-obtained by optoelectronic methods. As suspension sample is applied onto surface, suspended particles are immobilized by polymeric film. Film-coated surface is illuminated through measuring diaphragm of optical system to record integral-differential curves of optical absorption of light radiation that had passed through film-coated particle and region around it. Horizontal dimension of particle is evaluated as function of output signal duration, while particle thickness is evaluated as function of peak positive amplitude of signal emitted as particle comes into, or comes out of, projection of measuring diaphragm. Simultaneously, particle type is determined depending on single shape, number of similar-type particles being evaluated according to number of similar-type signals. EFFECT: useful methods in study of micro particles. 2 cl, 13 dwg

Description

Изобретения относятся к методам исследования микрочастиц, а именно к определению их размеров и числа, и могут быть использованы в медицине, порошковой металлургии, металлокерамике, производстве абразивов и т.п. The invention relates to methods for the study of microparticles, namely to determine their size and number, and can be used in medicine, powder metallurgy, cermet, the production of abrasives, etc.

Для визуальных методов исследования микрочастиц по их оптическому изображению чрезвычайно важно качество нанесения пробы на предметное стекло, от которого зависит точность и достоверность определения размеров и числа частиц в заданном объеме пробы. For visual methods for studying microparticles from their optical image, the quality of applying a sample to a glass slide, which determines the accuracy and reliability of determining the size and number of particles in a given sample volume, is extremely important.

Известен способ нанесения монослоя на предметное стекло [1] который заключается в пропускании заданного объема суспензии с заданной концентрацией через фильтрующую ленту, находящуюся в движении. Из поступающей на ленту суспензии вакуумным устройством отсасывается излишняя жидкость, затем полученный монослой прижимается к предметному стеклу. Способ сложен в реализации и не гарантирует последовательное размещение частиц вдоль некоторой полосы, что значительно усложняет последующий анализ, так как становится необходимой операция поиска частиц на предметном стекле. A known method of applying a monolayer on a glass slide [1] which consists in passing a predetermined volume of a suspension with a given concentration through a filter tape in motion. Excess liquid is sucked out of the suspension coming to the tape by a vacuum device, then the resulting monolayer is pressed against a glass slide. The method is difficult to implement and does not guarantee sequential placement of particles along a certain strip, which greatly complicates the subsequent analysis, since it becomes necessary to search for particles on a glass slide.

Наиболее близким к предлагаемому способу нанесения пробы суспензии является техническое решение [2] которое заключается в подготовке пробы и формировании монослоя из заданного объема пробы с заданной концентрацией частиц на смачиваемой поверхности предметного стекла путем взаимного перемещения с постоянной скоростью объема пробы и поверхности, при этом монослой суспензии формируют в виде полосы постоянной ширины, определяемой максимальным размером частиц. Такой способ обеспечивает как упрощение процедуры нанесения монослоя, так и последующего автоматического анализа размеров и числа частиц в пробе суспензии. Closest to the proposed method for applying a suspension sample is a technical solution [2] which consists in preparing a sample and forming a monolayer from a given sample volume with a given concentration of particles on a wettable surface of a glass slide by moving each other at a constant speed of the sample volume and surface, while the monolayer of the suspension form in the form of a strip of constant width, determined by the maximum particle size. This method provides both a simplification of the monolayer deposition procedure and subsequent automatic analysis of the size and number of particles in the suspension sample.

Подготовка пробы состоит в том, что ее разбавляют до получения заданной концентрации частиц в заданном объеме. Недостатком данного способа является недолговечность препарата, так как после испарения жидкости-разбавителя (что составляет несколько секунд) частицы не удерживаются на поверхности стекла, и препарат становится непригодным для дальнейших исследований. При замедленном испарении жидкости (например, благодаря добавлению в пробу глицерина) за счет поверхностного натяжения происходит не только изменение ширины и толщины нанесенного монослоя, но также хаотическое перемещение частиц внутри монослоя, что затрудняет исследования и автоматизацию процесса анализа. Sample preparation is that it is diluted to obtain a given concentration of particles in a given volume. The disadvantage of this method is the fragility of the drug, since after evaporation of the diluent liquid (which takes several seconds), the particles are not retained on the glass surface, and the drug becomes unsuitable for further research. With slow evaporation of the liquid (for example, due to the addition of glycerol to the sample) due to surface tension, not only the width and thickness of the applied monolayer are changed, but also the particles move randomly inside the monolayer, which makes it difficult to study and automate the analysis process.

В основу предлагаемого способа нанесения пробы на предметное стекло положена задача разработки и осуществления фиксирования получаемого монослоя суспензии, исключающего повреждение микрочастиц и обеспечивающего длительную консервацию препарата для последующего автоматического анализа размеров и числа частиц. The proposed method for applying a sample to a glass slide is based on the task of developing and fixing the resulting monolayer of the suspension, which excludes damage to microparticles and ensures long-term preservation of the drug for subsequent automatic analysis of particle size and number.

Решение этой задачи достигается тем, что при подготовке пробы ее разводят в жидкости-консерванте, содержащей 4-10% растворенного в ней полимера, и в процессе формирования при испарении жидкости получают монослой, фиксированный полимерной пленкой, при этом частицы располагаются неподвижно на поверхности предметного стекла и, благодаря малой толщине пленки, сохраняют свою естественную форму. The solution to this problem is achieved by the fact that when preparing the sample, it is diluted in a preservative liquid containing 4-10% of the polymer dissolved in it, and in the process of formation during evaporation of the liquid, a monolayer fixed by a polymer film is obtained, while the particles are stationary on the surface of the glass slide and, due to the small thickness of the film, retain their natural shape.

На фиг. 1 схематично представлен монослой в разрезе вдоль нанесенной линии на предметном стекле после высыхания жидкости (проба содержит частицы неорганического порошка); на фиг. 2 то же, для монослоя пробы элементов крови; на фиг. 3 фотография пробы элементов крови под полимерной пленкой. In FIG. 1 schematically shows a monolayer in section along the plotted line on a glass slide after drying of the liquid (the sample contains particles of inorganic powder); in FIG. 2 the same for a monolayer of a sample of blood elements; in FIG. 3 photograph of a sample of blood elements under a polymer film.

Способ реализован следующим образом. The method is implemented as follows.

1. При подготовке пробы суспензии неорганического порошка BaTiO₃ было взято 10 мг порошка и 10 мм³ разбавителя (соотношение 1:100). В качестве разбавителя была использована смесь плазмозаменителей крови типа полидез и гемодез (см. Справочник по переливанию крови и кровезаменителей. М. Медицина, 1982, с.158-170). Концентрация полимера в жидкости составляла 10% Объем пробы 1,5 мм³ был введен в капиллярную трубку с внутренним диаметром 70 мкм. Ожидаемые размеры частиц составляли 0,5-25 мкм. На поверхности предметного стекла 1 данной трубкой были прописаны параллельные линии шириной 70 мкм (± 5 мкм) до истечения всего объема пробы. Общая длина непрерывной линии монослоя составила 15,25 м. Процедура длилась 3 мин 15 с. В процессе нанесения монослоя жидкая составляющая плазмозаменителя испарялась в течение долей секунды, при этом возникала тонкая полимерная пленка 2 по всей ширине и длине линии монослоя. При рассмотрении полученного препарата под микроскопом было обнаружено следующее: частицы 3 порошка расположены цепочкой в один ряд на некотором расстоянии друг от друга, каждая частица закреплена на поверхности стекла 1 посредством пленки 2, облегающей частицу сверху и по контуру. Препарат оставался пригодным для исследований более 150 суток.1. When preparing a sample of a suspension of inorganic BaTiO ₃ powder, 10 mg of powder and 10 mm ^{3 of} diluent were taken (1: 100 ratio). As a diluent, a mixture of blood plasma substitutes such as polydesis and hemodesis was used (see Handbook for blood transfusion and blood substitutes. M. Medicine, 1982, p. 158-170). The polymer concentration in the liquid was 10%. A sample volume of 1.5 mm ³ was introduced into a capillary tube with an inner diameter of 70 μm. The expected particle sizes were 0.5-25 μm. On the surface of a glass slide 1, this tube registered parallel lines with a width of 70 μm (± 5 μm) before the expiration of the entire sample volume. The total length of the continuous line of the monolayer was 15.25 m. The procedure lasted 3 min 15 s. During the deposition of a monolayer, the liquid component of the plasma substitute evaporated within fractions of a second, and a thin polymer film 2 arose along the entire width and length of the monolayer line. When examining the obtained preparation under a microscope, the following was discovered: powder particles 3 are arranged in a row in a row at a certain distance from each other, each particle is fixed to the surface of glass 1 by means of a film 2, which encloses the particle from above and along the contour. The drug remained suitable for research for more than 150 days.

2. Особый интерес у исследователей вызывает подготовка препаратов для изучения медико-биологических микрообъектов, например, при клинических анализах крови. Это связано с тем, что клетки крови в растворе очень подвижны, быстро меняют форму и разрушаются. 2. Of particular interest to researchers is the preparation of drugs for the study of biomedical micro-objects, for example, in clinical blood tests. This is due to the fact that the blood cells in the solution are very mobile, quickly change shape and are destroyed.

Предлагаемый способ нанесения пробы для исследования элементов крови был осуществлен так. The proposed method for applying a sample to study blood elements was carried out as follows.

Для подготовки пробы суспензии крови была взята кровь объемом 0,1 мм³ и в соотношении 1:100 разбавлена плазмозаменителем типа желатиноль, концентрация полимера в котором составляла 8% Объем пробы полученной суспензии (1,5 мм³) был нанесен на предметное стекло размером 76х26 мм с помощью капиллярной трубки (с внутренним диаметром 30 мкм) в виде множества параллельных линий с шагом 25 мкм. Общая длина непрерывной линии составляла 31,25 м. Процедура длилась не более 5 мин. В результате почти мгновенного испарения жидкой составляющей плазмозаменителя образовалась тонкая пленка 2, закрывающая линию монослоя по всей ее ширине и длине. При наблюдении препарата под микроскопом обнаружено, что пленка 2 покрывает форменные элементы 4,5,6 крови сверху по всему периметру и форма элементов соответствует их естественной форме, что особенно наглядно проявилось для эритроцитов 4, лимфоцитов 5, тромбоцитов 6. Изготовленные по этому способу образцы препаратов сохранялись до 150 суток без каких-либо изменений формы частиц.To prepare a sample of a blood suspension, blood was taken in a volume of 0.1 mm ³ and diluted with a gelatinol type substitute in a ratio of 1: 100, the polymer concentration of which was 8%. The sample volume of the obtained suspension (1.5 mm ³ ) was applied to a slide glass measuring 76x26 mm using a capillary tube (with an inner diameter of 30 microns) in the form of many parallel lines with a pitch of 25 microns. The total length of the continuous line was 31.25 m. The procedure lasted no more than 5 minutes. As a result of almost instantaneous evaporation of the liquid component of the plasma substitute, a thin film 2 was formed, covering the line of the monolayer along its entire width and length. When observing the drug under a microscope, it was found that film 2 covers the blood formed elements 4,5,6 from the top around the perimeter and the shape of the elements corresponds to their natural form, which was especially evident for red blood cells 4, lymphocytes 5, platelets 6. Samples made using this method preparations remained for up to 150 days without any change in particle shape.

На фиг. 3 представлена фотография пробы крови под полимерной пленкой. Поверхность пленки наблюдалась при общем увеличении 350^x при косом освещении. Измерить толщину полученной пленки не представилось возможным. Однако она может быть вычислена без особых затруднений.In FIG. Figure 3 shows a photograph of a blood sample under a polymer film. The film surface was observed at a total magnification of 350 ^x under oblique illumination. It was not possible to measure the thickness of the obtained film. However, it can be calculated without much difficulty.

Если известен объем пробы W, длина L линии монослоя и его ширина A, а также процентное содержание γ полимера в заданном объеме, то толщина d пленки представляет собой:

где S_пл площадь пленки. Для приведенного примера 2 толщина пленки δ_пл _пл=0,154 мкм.If the sample volume W, the length L of the line of the monolayer and its width A, and also the percentage γ of the polymer in a given volume are known, then the film thickness d is:

where S _{PL is} the film area. For the above example 2, the film thickness δ _PL _PL = 0.154 μm.

При концентрации полимера 4% в объеме пробы расчетная толщина пленки составляет 35-50 нм, что сравнимо с толщиной мономолекулярного слоя. Поэтому уменьшение концентрации полимера не имеет смысла, так как оно будет сопровождаться разрывами пленки. Увеличение концентрации полимера более 10% нецелесообразно, так как толщина пленки становится соизмеримой с размерами микрочастиц и будет вносить искажения при последующих измерениях. At a polymer concentration of 4% in the sample volume, the calculated film thickness is 35-50 nm, which is comparable with the thickness of the monomolecular layer. Therefore, a decrease in polymer concentration does not make sense, since it will be accompanied by film breaks. An increase in the polymer concentration of more than 10% is impractical, since the film thickness becomes comparable with the size of the microparticles and will introduce distortions in subsequent measurements.

Таким образом, экспериментальная проверка подтвердила, что предлагаемыйемый способ нанесения суспензии на предметное стекло обеспечивает изготовление долговечных препаратов, в которых неповрежденные частицы зафиксированы на поверхности предметного стекла, что упрощает задачу последующего автоматического анализа размеров частиц и исключает ошибки при подсчете числа частиц в пробе. Следует особо отметить, что полученные заявляемым способом препараты пригодны для исследования любым из известных способов люминесцентным, интерференционным или поляризационным с помощью известных сканирующих микроскопов (см. Иваницкий Г.Р. и др. Автоматический анализ микрообъектов. М-Л. Энергия, 1967, с.31-40, 79-82). Thus, an experimental verification confirmed that the proposed method for applying a suspension to a glass slide provides the production of durable preparations in which undamaged particles are fixed on the surface of the glass slide, which simplifies the task of subsequent automatic analysis of particle sizes and eliminates errors in counting the number of particles in the sample. It should be especially noted that the preparations obtained by the claimed method are suitable for investigation by any of the known methods by luminescent, interference or polarization using known scanning microscopes (see Ivanitsky GR and other Automatic analysis of microobjects. M-L. Energy, 1967, p. .31-40, 79-82).

В настоящее время известно несколько визуальных методов измерения размеров и числа частиц в суспензии, нанесенной на предметное стекло, путем использования оптоэлектронных устройств. К ним относится способ "технического зрения", который заключается в автоматическом анализе изображения препарата с помощью ЭВМ. Этот способ использован в аппаратуре фирмы Opton(DE). Прилагается рекламный проспект 1986 г. (Приложение N1). Недостатком этого способа является длительность обработки информации вследствие использования на некоторых этапах (визуальное распределение частиц по типам) ручного труда оператора и сложность автоматизации при подсчете большого числа частиц. Кроме того, этим способом невозможно измерить параметры неокрашенных прозрачных частиц. Currently, several visual methods are known for measuring the size and number of particles in a suspension deposited on a glass slide using optoelectronic devices. These include the method of "technical vision", which consists in the automatic analysis of the image of the drug using a computer. This method was used in Opton (DE) equipment. The 1986 brochure is attached (Appendix N1). The disadvantage of this method is the duration of information processing due to the use at some stages (visual distribution of particles by type) of the manual labor of the operator and the complexity of automation when counting a large number of particles. In addition, in this way it is impossible to measure the parameters of unpainted transparent particles.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ измерения размеров и числа частиц в жидкости [3] заключающийся в нанесении заданного объема пробы на смачиваемую поверхность предметного стекла, в освещении поверхности с частицами пучком света при ее равномерном перемещении перпендикулярно оптической оси системы и в последующем анализе полученных данных оптоэлектронными методами. Оптическая система проецирует изображение освещенной частицы на линейку элементов фотоприемника поочередно, а сигналы от фотоэлементов подаются на вход линии задержки электронного блока. За счет увеличения времени накопления сигналов от частицы (по числу элементов фотоприемника) обеспечивают повышение чувствительности измерений. Хотя в данном способе исключен ручной труд оператора, но в нем используется довольно сложная оптическая система, требующая тщательной настройки, а измерения размеров и числа частиц производятся в отраженном свете по углу рассеяния света частицей, что не обеспечивает необходимой точности измерений. Известный способ позволяет определить только линейный размер частицы и подсчитать их общее число. Кроме того, данным способом невозможно достоверно измерять параметры прозрачных частиц, а биологические препараты требуют дополнительного окрашивания. Closest to the proposed method is a method of measuring the size and number of particles in a liquid [3] consisting in applying a predetermined sample volume to a wettable surface of a glass slide, illuminating a surface with particles with a light beam when it is uniformly moved perpendicular to the optical axis of the system and in the subsequent analysis of the data obtained optoelectronic methods. The optical system projects the image of the illuminated particle onto the line of photodetector elements in turn, and the signals from the photocells are fed to the input of the delay line of the electronic unit. By increasing the time of accumulation of signals from the particles (by the number of photodetector elements), they provide an increase in the sensitivity of measurements. Although the operator’s manual labor is excluded in this method, it uses a rather complex optical system that requires careful tuning, and measurements of particle size and number are made in reflected light by the angle of light scattering by the particle, which does not provide the necessary measurement accuracy. The known method allows you to determine only the linear particle size and calculate their total number. In addition, using this method, it is impossible to reliably measure the parameters of transparent particles, and biological preparations require additional staining.

В основу настоящего изобретения положена задача разработки и осуществления способа определения размеров и числа частиц, который обеспечил бы повышение точности измерений, а также позволил бы определять толщину прозрачных и непрозрачных частиц, достоверно распределять их по типам, и производить автоматизированный анализ суспензий. The basis of the present invention is the development and implementation of a method for determining the size and number of particles, which would increase the accuracy of measurements, and would also allow to determine the thickness of transparent and opaque particles, reliably distribute them by type, and perform automated analysis of suspensions.

Решение поставленной задачи достигается тем, что в способ, который заключается в нанесении заданного объема пробы суспензии на смачиваемую поверхность, в ступенчатом освещении этой поверхности пучком света и в последующем анализе полученных данных оптоэлектронными методами, введены новые операции:
при нанесении пробы на поверхность предметного стекла частицы фиксируются полимерной пленкой;
покрытую пленкой поверхность с частицами освещают проходящим светом через щель измерительной диафрагмы оптической системы;
во время движения поверхности в заданном направлении записывают интегрально-дифференциальные кривые интенсивности оптического поглощения излучения, прошедшего через покрытую полимерной пленкой частицу и область вокруг нее;
при анализе полученных кривых определяют горизонтальный размер частицы по длительности выходного сигнала, толщину частицы по максимальной положительной амплитуде сигнала при входе или выходе частицы из проекции измерительной диафрагмы, одновременно по изменению формы сигнала во времени определяют тип частицы, а число однотипных частиц определяют по количеству однотипных сигналов.The solution to this problem is achieved by the fact that in the method, which consists in applying a predetermined volume of a suspension sample to a wettable surface, in stepwise illumination of this surface with a light beam and in the subsequent analysis of the obtained data by optoelectronic methods, new operations are introduced:
when applying the sample to the surface of a glass slide, the particles are fixed with a polymer film;
the film-coated surface with particles is illuminated by transmitted light through the slit of the measuring diaphragm of the optical system;
during surface movement in a given direction, integral-differential intensity curves of optical absorption of radiation transmitted through a particle coated with a polymer film and the region around it are recorded;
when analyzing the obtained curves, the horizontal particle size is determined by the duration of the output signal, the particle thickness by the maximum positive amplitude of the signal when the particle enters or exits the projection of the measuring diaphragm, while the type of particle is determined by the change in waveform over time, and the number of particles of the same type is determined by the number of signals of the same type .

На фиг. 4 представлена фотография прозрачных частиц крови под полимерной пленкой; на фиг. 5 ход лучей через плоскую пленку и щель диафрагмы; на фиг. 6 ход лучей через линзу, образованную пленкой, и через щель диафрагмы; на фиг. 7 ход лучей через прозрачную частицу, расположенную под прозрачной пленкой, и через щель диафрагмы; на фиг. 8 структурная схема прибора, с помощью которого осуществлен предлагаемый способ; на фиг. 9 электрический сигнал на выходе оптоэлектронного преобразователя, характеризующий интенсивность оптического поглощения излучения, прошедшего через покрытый пленкой тромбоцит; на фиг. 10 то же, для эритроцита; на фиг. 11 то же, для лимфоцита; на фиг. 12 то же, для нейтрофила; на фиг. 13 а, б, в - электрические сигналы на выходе оптоэлектронного преобразователя, характеризующие интенсивности оптического поглощения излучения для эритроцитов разной формы. In FIG. 4 is a photograph of transparent blood particles under a polymer film; in FIG. 5 ray path through a flat film and aperture slit; in FIG. 6 the path of the rays through the lens formed by the film, and through the slit of the diaphragm; in FIG. 7 the path of the rays through a transparent particle located under a transparent film, and through the slit of the diaphragm; in FIG. 8 is a structural diagram of a device with which the proposed method is implemented; in FIG. 9 an electrical signal at the output of an optoelectronic converter, characterizing the intensity of optical absorption of radiation transmitted through a platelet coated with a film; in FIG. 10 the same for a red blood cell; in FIG. 11 the same for a lymphocyte; in FIG. 12 the same for neutrophil; in FIG. 13 a, b, c - electrical signals at the output of the optoelectronic converter, characterizing the intensity of optical absorption of radiation for red blood cells of various shapes.

В ходе экспериментальных исследований препаратов, полученных по способу нанесения монослоя суспензии на поверхность предметного стекла с фиксированием частиц тонкой полимерной пленкой, был обнаружен неожиданный оптический эффект: прозрачные клетки крови, находящиеся под пленкой, при прохождении пучка света через них обладали резкой контрастностью по отношению к фону, а вокруг каждой клетки наблюдался светлый ореол (см. фиг. 4). Оптический эффект, названный авторами "линзовым", проявился также и в том, что обнаружились краевые искажения проекции диафрагмы и увеличение амплитуды выходных сигналов по сравнению с фоном. During experimental studies of drugs obtained by the method of applying a monolayer of a suspension on the surface of a glass slide with the particles fixed with a thin polymer film, an unexpected optical effect was discovered: the transparent blood cells under the film, when a light beam passed through them, had a sharp contrast with respect to the background , and a bright halo was observed around each cell (see Fig. 4). The optical effect, which the authors called “lens”, also manifested itself in the fact that edge distortions of the projection of the diaphragm and an increase in the amplitude of the output signals were detected in comparison with the background.

Объяснение "линзовому эффекту" может быть такое. The explanation for the "lens effect" may be this.

Через прозрачное стекло 1, плоскую пленку 2 и измерительную диафрагму 7 пучок лучей проходит беспрепятственно, как показано на фиг. 5. Если на пути лучей расположена линза, образованная пленкой 2 (фиг. 6), то она фокусирует пучок лучей, проходящих через измерительную диафрагму 7. Если же внутри линзы, образованной пленкой 2, расположена прозрачная частица 8 (фиг. 7), то при прохождении через них направленного пучка лучей центральная часть линзы фокусирует лучи, а на границе частицы и наплыва пленки происходит преломление лучей расфокусовка, то сопровождается увеличением контрастности изображения самой частицы. Возникновение светлого ореола может объяснить увеличением светового потока благодаря увеличению толщины пленки в виде наплыва вокруг частицы. Through the transparent glass 1, the flat film 2 and the measuring diaphragm 7, the beam of rays passes unhindered, as shown in FIG. 5. If the lens formed by the film 2 is located in the path of the rays (Fig. 6), then it focuses the beam of rays passing through the measuring diaphragm 7. If, however, a transparent particle 8 is located inside the lens formed by the film 2 (Fig. 7), then when a directed beam of rays passes through them, the central part of the lens focuses the rays, and at the interface between the particle and the film influx, the rays are defocused and then accompanied by an increase in the image contrast of the particle itself. The appearance of a bright halo can be explained by an increase in the luminous flux due to an increase in the film thickness in the form of an influx around the particle.

Выявленный "линзовый эффект" позволил реализовать простой и наглядный способ определения размеров и числа частиц в суспензии, нанесенной в виде зафиксированного полимерной пленкой монослоя на поверхности предметного стекла. The revealed "lens effect" made it possible to implement a simple and intuitive method for determining the size and number of particles in a suspension deposited in the form of a monolayer fixed by a polymer film on the surface of a glass slide.

Структурная схема прибора, с помощью которого производилась запись интегрально-дифференциальных кривых интенсивности оптического поглощения излучения, представлена на фиг. 8. Прибор включает сканирующий микроскоп с традиционной блок-схемой (см. Иваницкий и др. Автоматический анализ микрообъектов. М-Л. Энергия, 1967, с.31-40). В состав микроскопа входят: источник 9 света (например, галогенная лампа КГМ 9х70), оптическая система 10 концентратор пучка света (например, конденсор ОИ-14), объектив 11 микроскопа, измерительная щелевая диафрагма 7 и сканирующий столик 12, на котором устанавливается предметное стекло 1 с нанесенной на его поверхность пробой суспензии. В состав прибора входит также оптоэлектронный преобразователь 13 в виде фотодиода (типа ФД-263), к которому подключен электронный усилитель (например, микросхема УД 544 2А). Выход преобразователя 13 подключен ко входу аналого-цифрового преобразователя (АЦП) 14, (например, типа ЛА-8 или ЛА-3), см. рекламный проспект Приложение 2 к заявке. К выходу АЦП 14 может быть подключена ПЭВМ (например, типа IBM PC AT 286 (386,486), входы которой согласованы с выходными параметрами АЦП. К выходу преобразователя 13 подключен осциллограф 15 для визуального наблюдения преобразованных сигналов от частиц, через которые проходит пучок световых лучей. The block diagram of the device with which the integral differential curves of the intensity of optical absorption of radiation were recorded is shown in FIG. 8. The device includes a scanning microscope with a traditional block diagram (see Ivanitsky et al. Automatic analysis of microobjects. M-L. Energy, 1967, p.31-40). The microscope includes: a light source 9 (for example, a KGM 9x70 halogen lamp), an optical system 10 a light beam concentrator (for example, an OI-14 condenser), a microscope lens 11, a measuring slit diaphragm 7, and a scanning table 12 on which a glass slide is mounted 1 with a sample of the suspension applied to its surface. The device also includes an optoelectronic converter 13 in the form of a photodiode (type FD-263), to which an electronic amplifier is connected (for example, the UD 544 2A microcircuit). The output of the converter 13 is connected to the input of an analog-to-digital converter (ADC) 14, (for example, type LA-8 or LA-3), see the brochure Appendix 2 to the application. A PC (for example, type IBM PC AT 286 (386,486), the inputs of which are consistent with the output parameters of the ADC, can be connected to the output of the ADC 14. An oscilloscope 15 is connected to the output of the converter 13 to visually observe the converted signals from the particles through which the light beam passes.

Пример осуществления способа. An example implementation of the method.

На сканирующем столике 12 микроскопа был установлен препарат, подготовленный заранее и представляющий собой предметное стекло 1 с нанесенным на нем монослоем суспензии крови, частицы которой зафиксированы тонкой полимерной пленкой 2 на поверхности стекла 1 по способу, описанному в первой части заявки, пример 2. Пучок света от источника 9 пропущен через оптическую систему 10, предметное стекло 1, объектив 11 и диафрагму 7. Сканирующий столик 12 осуществлял непрерывное продольное и ступенчатое поперечное перемещение стекла 1 перпендикулярно оптической оси системы, обеспечивая последовательное просвечивание монослоя вдоль всей его линии. Продольная скорость перемещения составляла 5 см/с, шаг поперечного смещения при переходе на следующую строку был равен 25 мкм. Пучок света, проходивший через диафрагму, освещал фотодиод преобразователя 13, этот оптический сигнал был преобразован в аналоговый электрический сигнал, который можно было наблюдать на экране осциллографа 15. Электрический сигнал от преобразователя 13, прошедший через АЦП 14 и, преобразованный им в цифровую форму, подавался на вход ПЭВМ, в который производилась запись сигнала на носитель, а для визуального наблюдения сигнал выводился на дисплей. On the scanning stage 12 of the microscope, a preparation was prepared that was prepared in advance and consisting of a slide 1 with a monolayer of a blood suspension deposited on it, the particles of which were fixed with a thin polymer film 2 on the surface of the glass 1 according to the method described in the first part of the application, example 2. A beam of light from the source 9 passed through the optical system 10, the slide 1, the lens 11 and the diaphragm 7. The scanning table 12 carried out continuous longitudinal and stepwise transverse movement of the glass 1 perpendicular to the optical visual axis of the system, providing sequential transillumination of the monolayer along its entire line. The longitudinal displacement velocity was 5 cm / s, the step of the transverse displacement during the transition to the next line was 25 μm. A beam of light passing through the diaphragm illuminated the photodiode of converter 13, this optical signal was converted into an analog electric signal, which could be seen on the screen of the oscilloscope 15. The electrical signal from converter 13, which passed through the ADC 14 and was converted to digital form by it, was supplied to the PC input, into which the signal was recorded on the medium, and for visual observation, the signal was displayed.

Анализ записанных кривых основан на следующих предпосылках. В методе оптического сканирования с помощью щелевой измерительной диафрагмы основным определяющим признаком является длительность электрического сигнала на выходе оптоэлектронного преобразователя 13. Этот параметр пропорционален линейному размеру микрообъекта вдоль оси, перпендикулярной проекции измерительной щели на плоскость предметного стекла 1. Однако классификация типа клеток крови только по длительности сигнала не является достоверной из-за большого разброса их размеров, особенно при патологиях. Благодаря "линзовому эффекту" был получен еще один определяющий частицу признак, а именно форма электрического сигнала, записанного при прохождении света через частицу и область вокруг нее. На фиг. 9. 10, 11, 12 представлены характерные электрические сигналы для разных элементов крови: тромбоцита 6, эритроцита 4, лимфоцита 5 и нейтрофила 16. Как видно, сигналы резко отличаются друг от друга. Поэтому по форме сигнала можно идентифицировать типы элементов крови, имея набор типовых сигналов для всех форменных элементов крови. Analysis of the recorded curves is based on the following premises. In the method of optical scanning using a slit measuring diaphragm, the main determining feature is the duration of the electrical signal at the output of the optoelectronic converter 13. This parameter is proportional to the linear size of the micro-object along an axis perpendicular to the projection of the measuring gap on the plane of the glass 1. However, the classification of blood cell types only by signal duration not reliable due to the large scatter of their sizes, especially with pathologies. Thanks to the “lens effect”, another sign defining the particle was obtained, namely, the shape of the electrical signal recorded during the passage of light through the particle and the region around it. In FIG. 9. 10, 11, 12 show the characteristic electrical signals for different elements of the blood: platelet 6, red blood cell 4, lymphocyte 5 and neutrophil 16. As can be seen, the signals are very different from each other. Therefore, according to the waveform, types of blood elements can be identified, having a set of typical signals for all blood cells.

"Линзовый эффект" позволил выявить еще один информационный признак записанных сигналов при сканировании монослоя: по мере приближения диафрагмы к краю частицы (вхождение в линзу) резко увеличивалась амплитуда выходного сигнала по отношению к уровню сигнала фона. Такая же картина наблюдалась при выходе из линзы (см. фиг. 8-13). Предположение, что амплитуда приращения сигнала ΔU зависит от вертикального размера (толщины) частицы, полностью подтвердилось при контрольных измерениях частиц (пыльцы растений) с заранее известным диаметром: была обнаружена линейная зависимость приращения сигнала ΔU от диаметра частиц, а именно от ее толщины. Кроме того, оценка толщины частиц по амплитуде выбросов сигнала на входе в линзу и на выходе из линзы дала значения, совпадающие с данными, известными из медицинских источников (например, эритроциты диаметром 6,8 7,2 мкм имеют толщину 1,5 2 мкм, см. Лабораторные исследования в клинике. Справочник под ред. Мельникова В.В. М. Медицина, 1987, с.80-89). The "lens effect" made it possible to identify yet another information sign of the recorded signals when scanning the monolayer: as the diaphragm approaches the edge of the particle (entering the lens), the amplitude of the output signal sharply increases with respect to the background signal level. The same picture was observed when leaving the lens (see Fig. 8-13). The assumption that the amplitude of the signal increment ΔU depends on the vertical particle size (thickness) was fully confirmed by control measurements of particles (plant pollen) with a known diameter: a linear dependence of the signal increment ΔU on the particle diameter, namely, its thickness, was found. In addition, an estimate of the particle thickness by the amplitude of the ejections of the signal at the entrance to the lens and at the exit from the lens gave values that coincide with data known from medical sources (for example, red blood cells with a diameter of 6.8 7.2 microns have a thickness of 1.5 2 microns, see Laboratory research in the clinic. Handbook edited by V. V. Melnikov, Medicine, 1987, pp. 80-89).

По снятым кривым (фиг. 8-12) были определены размеры частиц. Пример определения размеров частицы. Для эритроцита записан сигнал V(t) на фиг. 10. V_o= 10 B уровень фона. Скорость сканирования V=5 см/с. Диаметр частицы (см) d= τ •V, где t длительность импульса (между точками прохождения его через ноль относительно уровня V₀).According to the taken curves (Fig. 8-12), the particle sizes were determined. An example of determining the particle size. For the red blood cell, the signal V (t) in FIG. 10. V _o = 10 B background level. Scanning speed V = 5 cm / s. Particle diameter (cm) d = τ • V, where t is the pulse duration (between the points where it passes through zero relative to the level V ₀ ).

Длительность импульса: 135 ≅ τ_эр ≅ 150 мкс.
Диаметр эритроцита: 6,65 ≅ d_эр ≅ 7,5 мкм.Pulse duration: 135 ≅ τ _er ≅ 150 μs.
The diameter of the red blood cell: 6.65 ≅ d _er ≅ 7.5 microns.

Приращение сигнала ΔU на входе и выходе из линзы составило 76-84 мВ. По калибровочной характеристике, снятой для частиц с известными размерами, определено, что приращение ΔU 40 мВ соответствует толщине 1 мкм. Отсюда определены толщины эритроцитов:
1,8 ≅ h_эр ≅ 2,1 мкм.The signal increment ΔU at the input and output of the lens was 76-84 mV. According to the calibration characteristic taken for particles with known sizes, it was determined that the increment ΔU of 40 mV corresponds to a thickness of 1 μm. From here, the thickness of red blood cells was determined:
1.8 ≅ h _er ≅ 2.1 μm.

Для частиц крови, имеющих одно или несколько ядер (лейкоциты), по записанному сигналу можно определить размеры ядер, так как при прохождении лучей света через ядро клетки электрический сигнал имеет импульс, превышающий уровень V_o, а его длительность τ_я соответствует диаметру ядра d_я. Для лимфоцита 5, имеющего одно ядро, приведена кривая на фиг. 11. Для нейтрофила 16, содержащего несколько ядер, сигнал имеет несколько максимумов (фиг. 12).For blood particles having one or more nuclei (leukocytes), the size of the nuclei can be determined from the recorded signal, since when light rays pass through the cell nucleus, the electric signal has a pulse exceeding the level V _o , and its duration τ _i corresponds to the core diameter d _i . For a lymphocyte 5 having one nucleus, the curve in FIG. 11. For neutrophil 16 containing several nuclei, the signal has several maxima (Fig. 12).

Еще одна особенность способа, имеющая безусловное значение при медицинских исследованиях, состоит в том, что форма сигнала позволит оценить качественное состояние клетки крови. На фиг. 13 приведены кривые для эритроцитов, имеющие разную форму. На фиг. 13,а представлен сигнал для нормального эритроцита 4. Если форма эритроцита приближается к сферической (сферуляция эритроцита), как на фиг. 13,б, кривая практически имеет один минимум и амплитуда сигнала увеличена по сравнению с нормальной клеткой. Для уплощенного эритроцита (фиг. 13, в) экстремум двугорбой кривой приближается к уровню фона, а амплитуда выброса сигнала значительно меньше, чем для нормальной клетки. Другими словами, по форме сигнала и амплитуде выброса сигнала можно определить патологию клеток. Это позволяет производить диагностику заболевания по анализу изменений формы записанных сигналов. Another feature of the method, which is of absolute importance in medical research, is that the waveform will allow you to evaluate the quality of the blood cell. In FIG. 13 shows curves for red blood cells having a different shape. In FIG. 13a shows the signal for a normal red blood cell 4. If the shape of the red blood cell approaches the spherical (erythrocyte spherulation), as in FIG. 13b, the curve practically has one minimum and the signal amplitude is increased in comparison with a normal cell. For a flattened red blood cell (Fig. 13, c), the extremum of the two-humped curve approaches the background level, and the signal emission amplitude is much smaller than for a normal cell. In other words, the pathology of the cells can be determined by the shape of the signal and the amplitude of the ejection of the signal. This allows you to diagnose the disease by analyzing changes in the shape of the recorded signals.

Таким образом, кривые интенсивности оптического поглощения излучения, прошедшего через покрытые полимерной пленкой частицы и области вокруг них, позволяют определить горизонтальный размер частиц по длительности сигнала, толщину частиц по амплитуде выброса сигнала при входе или выходе частицы из проекции измерительной диафрагмы, тип частицы по форме сигнала, число однотипных частиц по количеству однотипных сигналов. Thus, the intensity curves of the optical absorption of radiation transmitted through particles coated with a polymer film and the areas around them make it possible to determine the horizontal particle size from the signal duration, the particle thickness from the amplitude of the signal ejected upon entry or exit of the particle from the projection of the measuring diaphragm, the type of particle according to the waveform , the number of particles of the same type by the number of signals of the same type.

По сравнению с известным способом-прототипом предлагаемый способ обеспечивает повышение точности измерений размеров и числа частиц, достоверное распределение частиц по типам, а также измерение толщины частиц. Кроме того, дополнительное преимущество заявляемого способа состоит в том, что благодаря "линзовому эффекту" увеличивается контрастность прозрачных частиц по отношению к фону, что улучшает возможность их визуального наблюдения и повышает разрешающую способность аппаратуры при записи кривых поглощения излучения. Compared with the known prototype method, the proposed method improves the accuracy of measuring the size and number of particles, a reliable distribution of particles by type, as well as measuring the thickness of the particles. In addition, an additional advantage of the proposed method is that due to the "lens effect" the contrast of the transparent particles with respect to the background increases, which improves the possibility of their visual observation and increases the resolution of the equipment when recording radiation absorption curves.

Claims

1. The method of applying a sample of a suspension for particle research, which consists in preparing the sample and forming from it a monolayer in the form of a strip of constant width on the wetted surface by moving each other at a predetermined volume of the sample volume and surface, characterized in that it is diluted in the sample preparation process preservative liquid with a polymer dissolved in it, the concentration of which in the sample volume is 4-10% and during the formation process a monolayer is obtained, fixed with a thin polymer film.

2. A method for determining the size and number of particles in a suspension, which consists in applying a predetermined sample volume to a wettable surface, illuminating the surface with particles with a light beam while moving it uniformly perpendicular to the optical axis of the system, and then analyzing the obtained data by optoelectronic methods, characterized in that when applied to the surface of the sample volume of the particles is fixed with a polymer film, the film-coated surface with particles is illuminated by transmitted light through the measuring diaphragm of the optical system while the surface is moving in a given direction, we take integral-differential intensity curves of the optical absorption of radiation passing through the particle coated with the film and the region around it, then the obtained curves are analyzed, and the horizontal particle size is determined by the duration of the output signal, the particle thickness by the maximum the positive amplitude of the signal at the entrance or exit of the particle from the projection of the measuring diaphragm, simultaneously determines the change in the waveform in time particle type, and the number of particles of the same type is determined by the number of signals of the same type.