RU2089557C1

RU2089557C1 - Method of chondroitin sulfate a preparing

Info

Publication number: RU2089557C1
Application number: RU93041847A
Authority: RU
Inventors: Л.И. Стекольников; А.А. Корнилова
Original assignee: Научно-производственная фирма "Нарт"
Priority date: 1993-08-23
Filing date: 1993-08-23
Publication date: 1997-09-10

Abstract

FIELD: biotechnology, biochemistry. SUBSTANCE: method involves enzymatic hydrolysis of bovine tracheas with 2-3 volumes of 0.5-1% pepsin solution at 38-40 C and pH = 1.5-2, pepsin inactivation, separation of precipitate formed and the following its dissolving in water. Before precipitation hydrolyzate is subjected for chromatography on column with diethylaminoethylcellulose using 1-2% HCl solution as an eluent. The dialyzed end product aqueous solution is used for drying. EFFECT: improved method of preparing.

Description

Изобретение относится к химии полисахаридов, конкретно, к способу получения хондроитинсульфата А, который используется для профилактики послеоперационных глубоких венозных тромбозов, атеросклероза и инфаркта миокарда. The invention relates to the chemistry of polysaccharides, in particular, to a method for producing chondroitin sulfate A, which is used for the prevention of postoperative deep venous thrombosis, atherosclerosis and myocardial infarction.

Известны способы получения хондроитинсульфата из морских иглокожих, например, голотурий (заявка Японии 63-10601, 1988 г. МКИ: С 08 В 37/08) или хрящей животных ("Scand. Arch. Physrol." 1989. V.I, p.210-215), однако при этом получают неочищенные препараты, содержащие значительное количество примесей других полисахаридов и белков. Known methods for producing chondroitin sulfate from marine echinoderms, for example, holothurium (Japanese application 63-10601, 1988 MKI: C 08 B 37/08) or cartilage of animals ("Scand. Arch. Physrol." 1989. VI, p.210- 215), however, in this case, crude preparations are obtained containing a significant amount of impurities of other polysaccharides and proteins.

Согласно наиболее близкому, принятому за прототип техническому решению, описанному в заявке Франции 2491475 (1982 г. МКИ: С 08 В 37/08; А 61 К 31/725), при получении хондроитинсульфата А измельченные бычьи трахеи гидролизуют 1,25%-ным водным раствором пепсина при рH 4,5 и температуре 50^oC в течение 12 ч, фермент инактивируют при 80-90^oC, осадок отделяют центрифугированием, промывают горячей водой, промывные воды и надосадочную жидкость объединяют и последовательно обрабатывают сначала при рH 9-10, а затем при рH 6,5, нагревают до кипения, охлаждают, осадок отделяют, надосачную жидкость обрабатывают 5% -ным раствором цетилпиридинийхлорида, осадок отделяют, промывают метанолом, растворяют в воде, центрифугируют и осадок высушивают.According to the closest technical solution adopted for the prototype, described in French application 2491475 (1982 MKI: C 08 B 37/08; A 61 K 31/725), upon receipt of chondroitin sulfate A, the crushed bovine trachea is hydrolyzed by 1.25% an aqueous solution of pepsin at pH 4.5 and a temperature of 50 ^o C for 12 h, the enzyme is inactivated at 80-90 ^o C, the precipitate is separated by centrifugation, washed with hot water, the wash water and the supernatant are combined and treated first with pH 9-10 and then at pH 6.5, it is heated to a boil, cooled, the precipitate is separated, on osachnuyu fluid is treated with 5% solution of cetylpyridinium chloride, the precipitate is separated off, washed with methanol, dissolved in water, centrifuged and the pellet dried.

Недостаток известного способа заключается в низком выходе хондроитинсульфата А, составляющем 47-56 мг/кг сырья, в многостадийности, а также в необходимости использовать высотоксичный метанол. The disadvantage of this method is the low yield of chondroitin sulfate A, comprising 47-56 mg / kg of raw material, in multiple stages, as well as the need to use highly toxic methanol.

Изобретение решает задачу повышения выхода хондроитинсульфата А при уменьшении числа стадий и исключении метанола. The invention solves the problem of increasing the yield of chondroitin sulfate A while reducing the number of stages and eliminating methanol.

Цель достигается благодаря тому, что в способе получения хондроитинсульфата А, включающем ферментативный гидролиз бычьих трахей пепсином, инактивацию фермента при 80-90% отделение гидролизата центрифугированием, осаждение цетилпиридинийхлоридом, растворение осадка в воде и его сушку, гидролиз проводят 2-3 объемами 0,5-1%-ного раствора пепсина при 38-40^oС и рH 1,5-2,0 в течение 4-6 ч, цетилпиридинийхлорид используют в количестве 2-4 г/л раствора, при этом перед осаждением гидролизат хроматографируют на колонке с диэтиламиноэтилцеллюлозой при использовании 1-2%-ной HCl в качестве элюента, а после растворения осадка в воде продукт высаливают хлоридом натрия из расчета 20-30 г/л при 2-4^oС и целевой продукт получают обессоливанием диализом против воды при течение 12-16 ч.The goal is achieved due to the fact that in the method of producing chondroitin sulfate A, which includes enzymatic hydrolysis of bovine trachea with pepsin, inactivation of the enzyme at 80-90% separation of the hydrolyzate by centrifugation, precipitation of cetylpyridinium chloride, dissolution of the precipitate in water and its drying, hydrolysis is carried out in 2-3 volumes of 0.5 A 1% solution of pepsin at 38-40 ^o C and pH 1.5-2.0 for 4-6 hours, cetylpyridinium chloride is used in an amount of 2-4 g / l of solution, while the hydrolyzate is chromatographed on a column prior to precipitation diethylaminoethyl cellulose using Vania 1-2% strength HCl as eluent, and after dissolving the precipitate in water the product is salted out with sodium chloride at the rate of 20-30 g / L at 2-4 ^o C and the desired product was prepared by desalting by dialysis against water for 12-16 hours at .

Способ позволяет получать очищенный хондроитинсульфат А, выход которого примерно в 3 раза выше, чем по известному способу. The method allows to obtain purified chondroitin sulfate A, the yield of which is about 3 times higher than by the known method.

Пример 1. 100 г бычьих трахей измельчают на мясорубке, заливают 200 мл (2 объема) 0,5%-ного водного раствора пепсина (активность 15 ЕД/мг) и гидролизуют при рH 1,5 и 38^oС в течение 4 ч, фермент инактивируют нагреванием до 80^oС, смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин, надосадочную жидкость (150 мл) пропускают через колонку размером 2 х 35 см с диэтиламиноэтилцеллюлозой, элюцию ведут со скоростью 10 мл/мин 300 мл I%-ного раствора HCl, к 280 мл элюата добавляют 0,56 г цетилпиринийхлорида (2 г/л), осадок отфильтровывают, растворяют в 50 мл воды, добавляют I г NaCl (20 г/л), охлаждают до 2^oС, осадок отделяют фильтрованием, растворяют в 50 мл воды, диализируют против воды при 4^oC в течение 12 ч, диализат сушат сублимацией и получают 15 мг хондроитинсульфата А (выход 150 мг/кг сырья).Example 1. 100 g of bovine trachea is minced in a meat grinder, 200 ml (2 volumes) of a 0.5% aqueous pepsin solution (activity 15 U / mg) are poured and hydrolyzed at pH 1.5 and 38 ^° C for 4 hours, the enzyme is inactivated by heating to 80 ^o C, the mixture is centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes, the supernatant (150 ml) is passed through a 2 x 35 cm column with diethylaminoethyl cellulose, the elution is carried out at a rate of 10 ml / min 300 ml I% - HCl solution, to 280 ml of the eluate add 0.56 g of cetylpyridinium chloride (2 g / l), the precipitate is filtered off, dissolved in 50 ml of water, add I g NaCl (20 g / l) , cooled to 2 ^{° C.} , the precipitate was separated by filtration, dissolved in 50 ml of water, dialyzed against water at 4 ^° C. for 12 hours, the dialysate was freeze-dried and 15 mg of chondroitin sulfate A was obtained (yield 150 mg / kg of feed).

Пример 2. 100 г измельченных бычьих трахей заливают 250 мл (2,5 объема) 0,75%-ного водного раствора пепсина (активность 15 ЕД/мг ) и гидролизуют при рH 1,75 и 39^oС в течение 5 ч, фермент инактивируют нагреванием до 85^oС, смесь центрифугируют, надосадочную жидкость в объеме 200 мл пропускают через колонку размером 2 х 35 см, заполненную диэтиламиноэтилцеллюлозой, элюируют 300 мл 1,5%-ного раствора HCl со скоростью 10 мл/мин, к 280 мл элюата прибавляют 0,84 г цетилпиридинийхлорида (3 г/л), осадок отфильтровывают, растворяют в 50 мл воды, прибавляют 1,25 г NaCl (25 г/л), охлаждают до 3^oС, образовавшийся осадок отделяют на фильтре, растворяют в 50 мл воды, диализируют против воды при 5^oС в течение 14 ч, диализат сушат сублимацией и получают 16 мг хондроитинсульфата А (выход 160 мг/кг сырья).Example 2. 100 g of ground bovine trachea is poured into 250 ml (2.5 volumes) of a 0.75% aqueous solution of pepsin (activity 15 U / mg) and hydrolyzed at pH 1.75 and 39 ^o C for 5 hours, the enzyme inactivate by heating to 85 ^o C, the mixture is centrifuged, the supernatant in a volume of 200 ml is passed through a 2 x 35 cm column filled with diethylaminoethyl cellulose, elute with 300 ml of a 1.5% HCl solution at a rate of 10 ml / min to 280 ml of eluate 0.84 g of cetylpyridinium chloride (3 g / l) is added, the precipitate is filtered off, dissolved in 50 ml of water, 1.25 g of NaCl (25 g / l) are added, cooled to 3 ^o C, the precipitate formed is separated on the filter, dissolved in 50 ml of water, dialyzed against water at 5 ^o C for 14 hours, the dialysate is freeze-dried and 16 mg of chondroitin sulfate A is obtained (yield 160 mg / kg of feed).

Пример 3. 100 г измельченных бычьих трахей заливают 300 мл (3 объема) 1% -ного водного раствора пепсина (активность 15 ЕД/мг), гидролизуют при рH 2,0 и 40^oС в течение 6 ч, фермент инактивируют нагреванием до 90^oС, смесь центрифугируют, надосадочную жидкость в объеме 250 мл пропускают через колонку размером 2 х 35 см, заполненную диэтиламиноэтилцеллюлозой, элюируют 300 мл 2%-ного раствора HCl со скоростью 10 мл/мин, к 280 мл элюата прибавляют 1,12 г цетилпиридинийхлорида (4 г/л), осадок отделяют на фильтре, растворяют в 50 мл воды, добавляют 1,5 г NaCl (30 г/л), охлаждают до 4^oС, образующийся осадок отделяют на фильтре, растворяют в 50 мл воды, диализируют против воды при 6^oС в течение 16 ч, диализат сушат сублимацией и получают 17 мг хондроитинсульфата А (выход 170 мг/кл сырья).Example 3. 100 g of crushed bovine trachea is poured into 300 ml (3 volumes) of a 1% aqueous solution of pepsin (activity 15 U / mg), hydrolyzed at pH 2.0 and 40 ^o C for 6 hours, the enzyme is inactivated by heating to 90 ^o C, the mixture is centrifuged, the supernatant in a volume of 250 ml is passed through a 2 x 35 cm column filled with diethylaminoethyl cellulose, 300 ml of a 2% HCl solution is eluted at a rate of 10 ml / min, 1.12 g of cetylpyridinium chloride are added to 280 ml of the eluate (4 g / l), the precipitate is separated on the filter, dissolved in 50 ml of water, add 1.5 g of NaCl (30 g / l), cooled to 4 ^o C, the precipitate formed is separated on a filter, dissolved in 50 ml of water, dialyzed against water at 6 ^° C for 16 hours, the dialysate is freeze-dried and 17 mg of chondroitin sulfate A is obtained (yield 170 mg / cell of raw material).

Таким образом, выход хондроитинсульфата в заявленном способе составляет 150-170 мг/кг против 47-56 мг/кг в известном, при этом по физико-химическим характеристикам (удельному оптическому вращению, элементному анализу, поведению при хроматографировании на бумаге в системе пропиловый спирт 0,2 М борная кислота) образцы хондроитинсульфата А практически не различались. Thus, the yield of chondroitin sulfate in the claimed method is 150-170 mg / kg versus 47-56 mg / kg in the known, while physico-chemical characteristics (specific optical rotation, elemental analysis, behavior when chromatographed on paper in the system propyl alcohol 0 , 2 M boric acid) samples of chondroitin sulfate A practically did not differ.

Claims

A method of producing chondroitin sulfate A, including enzymatic hydrolysis of bovine trachea with pepsin, inactivation of pepsin at 80 ^° -90 ^° C, separating the precipitate formed, followed by dissolving the separated precipitate in water and drying the aqueous solution, characterized in that the enzymatic hydrolysis of bovine trachea with pepsin is carried out in 2 3 volumes of 0, 5 1.0% solution of pepsin at 38 40 ^o C and a pH of 1.5 to 2.0 for 4 to 6 hours, before processing the supernatant with cetylpyridinium chloride, the supernatant is additionally chromatographed on a column of diethyl minoethyl cellulose when using 1 2% HCl as an eluting solution, chromatographically purified supernatant is treated with cetylpyridinium chloride in an amount of 2 4 g / l, after separation of the precipitate formed and dissolution of the separated precipitate in water, the resulting solution is salted out with sodium chloride in an amount of 20 30 g / l solution at February 4 ^o C, the resulting precipitate was separated and dissolved in water, and again the resultant solution was desalted by dialysis against water at 4 June ^o C for 12 16 hours for drying the dialyzed using water first title product solution.