RU2086652C1

RU2086652C1 - Method of l-proline quantitative determination

Info

Publication number: RU2086652C1
Application number: RU93046535A
Authority: RU
Inventors: Александр Людвигович Симонян; Евгения Исааковна Райнина; Ирина Эмильевна Бадалян; Татьяна Абрамовна Махлис; Степан Шагенович Татикян; Гарник Эдуардович Хачатрян
Original assignee: Александр Людвигович Симонян; Евгения Исааковна Райнина; Ирина Эмильевна Бадалян; Татьяна Абрамовна Махлис; Степан Шагенович Татикян; Гарник Эдуардович Хачатрян
Priority date: 1993-10-01
Filing date: 1993-10-01
Publication date: 1997-08-10

Abstract

FIELD: biotechnology, microbiological industry, analytical biochemistry. SUBSTANCE: rate of L-proline oxidation with free or immobilized cells Pseudomonas species-22 (VKPM B-4877) depends linearly on concentration of L-proline at the range 0.01-0.1 mM. The used strain Pseudomonas species-22 (VKPM B-4877) does not show pathogenicity for human and does not form spores. Time for one analysis is 5 min. Method does not require periodic biomass growing, immobilized cells can be used repeatedly. Invention can be used in microbiological industry, wine-making industry, clinical and laboratory investigations. EFFECT: high selectivity, simplified method of analysis. 2 dwg, 3 tbl

Description

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способам количественного определения концентрации L-пролина с помощью штамма Pseudomonas species Ш-22 ВКПМ В-4877, специфически окисляющего L-пролин. The invention relates to the microbiological industry, in particular to methods for quantitatively determining the concentration of L-proline using a strain of Pseudomonas species Ш-22 VKPM B-4877, specifically oxidizing L-proline.

Изобретение наиболее эффективно может быть использовано в микробиологической и пищевой промышленности, клинических и лабораторных исследованиях. The invention can most effectively be used in the microbiological and food industries, clinical and laboratory research.

Основными требованиями, предъявляемыми к современным методам количественного определения аминокислот, являются высокие чувствительность, селективность, простота, минимальное количество стадий; отсутствие необходимости применения токсичных соединений в процессе анализа; в случае методов, основанных на использовании микроорганизмов, последние не должны быть патогенными и спорообразующими. The main requirements for modern methods for the quantitative determination of amino acids are high sensitivity, selectivity, simplicity, a minimum number of stages; no need to use toxic compounds in the analysis process; in the case of methods based on the use of microorganisms, the latter should not be pathogenic and spore-forming.

Этим определяется широта областей применения метода. This determines the breadth of areas of application of the method.

Известные методы определения L-пролина, такие как хроматографические, электрофоретические [1] колориметрический [2] не в полной мере удовлетворяют современным требованиям. Эти методы достаточно трудоемки и длительны. Их реализация предусматривает использование токсичных соединений. Known methods for determining L-proline, such as chromatographic, electrophoretic [1] colorimetric [2], do not fully satisfy modern requirements. These methods are quite laborious and time consuming. Their implementation involves the use of toxic compounds.

Описанный микробиологический метод определения L-пролина основан на применении тест-культур, способных расти только на средах, содержащих L-пролин. The described microbiological method for determining L-proline is based on the use of test cultures that can grow only on media containing L-proline.

В частности, в работе [3] в качестве тест-культуры используют штамм спорообразующих бактерий Neurospora crassa. In particular, a strain of spore-forming bacteria Neurospora crassa was used as a test culture in [3].

Основными недостатками этого способа являются длительность анализа (ввиду низкой скорости роста время анализа достигает 200 ч); низкая специфичность анализа, обусловленная тем, что данные клетки способны расти на средах, содержащих пептиды и белки, что делает невозможным определение пролина в многокомпонентных средах; Neurospora crassa относится к спорообразующим микроорганизмам, вследствие чего она является источником загрязнения лабораторных и производственных помещений. The main disadvantages of this method are the duration of the analysis (due to the low growth rate, the analysis time reaches 200 hours); low specificity of the analysis, due to the fact that these cells are able to grow on media containing peptides and proteins, which makes it impossible to determine proline in multicomponent media; Neurospora crassa belongs to spore-forming microorganisms, as a result of which it is a source of contamination of laboratory and industrial premises.

Наиболее близким к предлагаемому является способ количественного определения L-пролина с помощью мутантного штамма E. coli P-69 [4] Метод основан на том, что интенсивность роста клеток E. coli P-69 линейно зависит от содержания L-пролина в среде роста. Для проведения анализа клетки E. coli P-69, ауксотрофные по L-пролину, выращивают в 2 мл питательного бульона, переносят в синтетическую среду M-9, содержащую 10 мкг/мл L-пролина, и инкубируют 16 ч при 37^oC. До начала определения культуру центрифугируют и ресуспендируют в стерильной минеральной среде M-9. Исследуемые образцы стерилизуют в автоклаве при 1 атмосфере 30 мин и центрифугируют (4000 об/мин, 20 мин). Супернатант инкубируют на кипящей водяной бане, повторно центрифугируют, разводят в соответствующее число раз, после чего вносят штамм E. coli P-69 и выращивают в течение 20 22 ч при 37^oC. Затем фотометрически оценивают интенсивность роста клеток в анализируемых образцах и по стандартной кривой определяют концентрацию в них L-пролина. Основными недостатками данного способа, существенно снижающими эффективность анализа, являются низкая скорость роста клеток (20 22 ч), многостадийность и трудоемкость предобработки исследуемых образцов, обуславливающие длительность анализа.Closest to the proposed method is the quantitative determination of L-proline using a mutant strain of E. coli P-69 [4] The method is based on the fact that the growth rate of E. coli P-69 cells linearly depends on the content of L-proline in the growth medium. For analysis, E. coli P-69 cells auxotrophic for L-proline are grown in 2 ml of nutrient broth, transferred to M-9 synthetic medium containing 10 μg / ml L-proline, and incubated for 16 hours at 37 ^° C. Prior to the determination, the culture is centrifuged and resuspended in a sterile mineral medium M-9. The test samples are autoclaved at 1 atmosphere for 30 minutes and centrifuged (4000 rpm, 20 minutes). The supernatant is incubated in a boiling water bath, centrifuged again, diluted an appropriate number of times, after which the E. coli P-69 strain is introduced and grown for 20 22 h at 37 ^° C. Then, the cell growth rate in the analyzed samples is photometrically evaluated using standard the curve determines the concentration of L-proline in them. The main disadvantages of this method, significantly reducing the efficiency of the analysis, are the low cell growth rate (20 22 h), the multi-stage and laboriousness of the pre-treatment of the test samples, which determine the duration of the analysis.

Цель изобретения разработка быстрого, простого и селективного способа количественного определения L-пролина с помощью свободных и иммобилизованных клеток Pseudomonas species Ш-22, которые окисляют L-пролин и не окисляют другие аминокислоты и сахара. The purpose of the invention is the development of a quick, simple and selective method for the quantitative determination of L-proline using free and immobilized cells of Pseudomonas species Ш-22, which oxidize L-proline and do not oxidize other amino acids and sugars.

Ожидаемыми эффектами от изобретения является увеличение скорости анализа за счет упрощения процесса определения и улучшение экологического аспекта анализа за счет исключения стадий использования токсических агентов и регулярного наращивания бактериальной биомассы. The expected effects of the invention are to increase the speed of analysis by simplifying the process of determining and improving the environmental aspect of the analysis by eliminating the stages of use of toxic agents and the regular growth of bacterial biomass.

Предлагаемый способ количественного определения L-пролина основан на свойстве клеток Pseudomonas Sp. s Ш-22 (ВКПМ В-4877) окислять L-пролин, причем скорость окисления L-пролина свободными или иммобилизованными клетками (скорость потребления кислорода клетками в присутствии L-пролина в реакционной среде) линейно зависит от концентрации L-пролина в диапазоне концентраций последнего от 0,01 до 0,1 мМ. Сущность способа состоит в том, что проводят окисление L-пролина свободными или иммобилизованными клетками и регистрируют скорость потребления кислорода. По скорости потребления кислорода определяют концентрацию L-пролина в среде. Скорость потребления кислорода определяют амперометрически с помощью мембранного кислородного электрода Кларка [5] и выражают как количество кислорода (ммоль), потребленное 1 мг клеток (влажный вес) в одну минуту. The proposed method for the quantitative determination of L-proline is based on the property of Pseudomonas Sp. s Ш-22 (VKPM B-4877) oxidize L-proline, and the rate of L-proline oxidation by free or immobilized cells (the rate of oxygen consumption by cells in the presence of L-proline in the reaction medium) linearly depends on the concentration of L-proline in the concentration range of the latter from 0.01 to 0.1 mm. The essence of the method consists in the fact that L-proline is oxidized by free or immobilized cells and the oxygen consumption rate is recorded. The oxygen consumption rate determines the concentration of L-proline in the medium. The oxygen consumption rate is determined amperometrically using a Clark membrane oxygen electrode [5] and is expressed as the amount of oxygen (mmol) consumed by 1 mg of cells (wet weight) per minute.

Используемый штамм Pseudomonas species Ш-22 ВКПМ В-4877 непатогенен для человека и не является спорообразующим. The used strain Pseudomonas species Ш-22 VKPM B-4877 is non-pathogenic for humans and is not spore-forming.

Штамм Pseudomonas species Ш-22 хранится во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов института "ВНИИГенетика" (Москва), N В-4877. The strain Pseudomonas species Ш-22 is stored in the All-Union Collection of Industrial Microorganisms of the Institute "VNIIGenetika" (Moscow), N В-4877.

Пример 1. Клетки Pseudomonas species Ш-22 (ВКПМ В-4877) выращивают на синтетической среде, содержащей 0,15: L-пролина, 0,02: K₂HPO₄•3H₂O, 0,05: KH₂PO₄, 0,02: MgSO₄•7H₂O, pH 7,2 7,5, при 30^oC в 750 мл конических колбах (объем ферментационной среды 200 мл) на круговой качалке (180 об/мин) в течение 16 часов. Биомассу отделяют центрифугированием (10000 об/мин. 15 мин), суспендируют в 50 мМ калий-фосфатном буфере pH 7,2 в соотношении 0,2 г клеток (влажный вес) в 1 мл буфера. Скорость окисления L-пролина определяют амперометрически по изменению содержания кислорода в реакционной среде. Для этого измерительную ячейку (объем 5 мл), снабженную перемешивающим устройством, наполняют 50 мМ калий-фосфатный буфер pH 8,0, добавляют 0,05 мл клеточной суспензии и вводят 0,05 мл раствора L-пролина известной концентрации (0,01; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9; 1,0 мМ). С помощью самописца регистрируют скорость потребления кислорода клетками в присутствии L-пролина. Каждое измерение повторяют не менее трех раз и определяют среднее значение. На основании полученных результатов строят калибровочную кривую (фиг. 1). Наиболее удобным для проведения анализа является диапазон от 0,01 до 0,1 мМ L-пролина.Example 1. Cells of Pseudomonas species Ш-22 (VKPM B-4877) are grown on synthetic medium containing 0.15: L-proline, 0.02: K ₂ HPO ₄ • 3H ₂ O, 0.05: KH ₂ PO ₄ , 0.02: MgSO ₄ • 7H ₂ O, pH 7.2 7.5, at 30 ^° C in 750 ml conical flasks (fermentation medium volume 200 ml) on a circular shaker (180 rpm) for 16 hours. The biomass is separated by centrifugation (10,000 rpm. 15 min), suspended in 50 mm potassium phosphate buffer pH 7.2 in the ratio of 0.2 g of cells (wet weight) in 1 ml of buffer. The oxidation rate of L-proline is determined amperometrically from the change in the oxygen content in the reaction medium. To do this, a measuring cell (volume 5 ml) equipped with a stirrer is filled with 50 mM potassium phosphate buffer pH 8.0, 0.05 ml of cell suspension is added and 0.05 ml of a known concentration of L-proline solution (0.01; 0.02; 0.04; 0.06; 0.08; 0.1; 0.3; 0.5; 0.7; 0.9; 1.0 mM). Using a recorder, the rate of oxygen uptake by cells in the presence of L-proline is recorded. Each measurement is repeated at least three times and the average value is determined. Based on the results obtained, a calibration curve is constructed (Fig. 1). The most convenient for analysis is the range from 0.01 to 0.1 mm L-Proline.

Пример 2. Условия культивирования клеток и определения такие же, как в примере 1, только для анализа используют клеточную суспензию, которую хранят при 4^oC на протяжении 14 дней. Скорость окисления L-пролина остается постоянной при хранении биомассы в течение 10 дней (табл.1).Example 2. The cell culture conditions and definitions are the same as in example 1, only for analysis using a cell suspension, which is stored at 4 ^o C for 14 days. The oxidation rate of L-proline remains constant during storage of biomass for 10 days (table 1).

Пример 3. Культивирование клеток и определение скорости окисления L-пролина проводят как в примере 1, только вместо свободных используют иммобилизованные клетки. Для этого выращенную биомассу включают в Ca-альгинатный, или каррагинановый гели [6] либо в криогель поливинилового спирта. Содержание клеток в гелях составляет 10% Для проведения анализа в измерительную ячейку помещают 10 мг иммобилизованных клеток. Для каждого измерения используют новую порцию иммобилизованных клеток. При работе с клетками, иммобилизованными в Ca-альгинатный гель, измерения проводят в 50 мМ Трис-HCl буфере pH 8,0. При работе с клетками, иммобилизованными в каррагинановый гель или поливиниловый спирт используют, как и в примере 1, 50 мМ калийфосфатный буфер pH 8,0. Диапазон определяемых с помощью иммобилизованных клеток концентраций L-пролина такой же, как для свободных (фиг.2). На фиг.2 имеются следующие обозначения: 1-Ca-альгинатный гель, 2-криогель поливинилового спирта, 3-каррагинановый гель. Example 3. Cell cultivation and determination of the oxidation rate of L-proline are carried out as in example 1, only immobilized cells are used instead of free ones. For this, the grown biomass is included in Ca-alginate, or carrageenan gels [6] or in polyvinyl alcohol cryogel. The cell content in the gels is 10%. For analysis, 10 mg of immobilized cells are placed in the measuring cell. For each measurement, a new portion of immobilized cells is used. When working with cells immobilized in a Ca-alginate gel, measurements are carried out in 50 mM Tris-HCl buffer pH 8.0. When working with cells immobilized in a carrageenan gel or polyvinyl alcohol, as in Example 1, 50 mM potassium phosphate buffer pH 8.0 is used. The range determined using immobilized cells of the concentrations of L-proline is the same as for free (figure 2). Figure 2 has the following notation: 1-Ca-alginate gel, 2-cryogel of polyvinyl alcohol, 3-carrageenan gel.

Пример 4. Условия определения такие же, как в примере 2, только для определения используют иммобилизованные клетки, которые хранят при 4^oC в соответствующем буфере. На шестидесятый день хранения скорость окисления L-пролина иммобилизованными клетками составляет 80% от начальной. (табл.2).Example 4. The conditions for the determination are the same as in example 2, only for determination using immobilized cells, which are stored at 4 ^o C in the appropriate buffer. On the sixtieth day of storage, the rate of L-proline oxidation by immobilized cells is 80% of the initial. (table 2).

Пример 5. Условия определения такие же, как в примере 3, только все измерения проводили на одной и той же порции иммобилизованных клеток. После каждого измерения иммобилизованные клетки трижды промывали рабочим буфером и использовали для повторного измерения. При проведении 10 анализов на одной и той же порции иммобилизованных клеток скорость окисления L-пролина оставалась неизменной (табл.3). Example 5. The determination conditions are the same as in example 3, only all measurements were carried out on the same portion of immobilized cells. After each measurement, the immobilized cells were washed three times with working buffer and used for re-measurement. When 10 analyzes were performed on the same portion of immobilized cells, the oxidation rate of L-proline remained unchanged (Table 3).

Пример 6. Определение L-пролина проводят как в примерах 1, 2, 3, 4, 5. Для определения L-пролина в сложных биоорганических жидкостях; ферментационных средах, гидролизатах БВК, мелассе и вине анализируемые пробы центрифугируют (10000 об/мин, 15 мин), при необходимости, разводят в нужное число раз 50 мМ калий-фосфатным буфером pH 8,0 таким образом, чтобы содержание аминокислоты укладывалось в стандартную калибровочную кривую и проводят определение, как описано в примере 1 (или в примере 2, если определение проводят иммобилизованными клетками). Каждое измерение повторяют три раза (время одного измерения составляет 5 минут). Вычисляют среднюю величину скорости окисления L-пролина и по калибровочной кривой определяют содержание L-пролина в пробе. Example 6. The definition of L-proline is carried out as in examples 1, 2, 3, 4, 5. To determine L-proline in complex bioorganic fluids; in fermentation media, BVK hydrolysates, molasses and wine, the analyzed samples are centrifuged (10,000 rpm, 15 min), if necessary, diluted 50 mm with the necessary amount of potassium phosphate buffer pH 8.0 so that the amino acid content fits into the standard calibration curve and carry out the determination, as described in example 1 (or in example 2, if the determination is carried out by immobilized cells). Each measurement is repeated three times (the time of one measurement is 5 minutes). The average oxidation rate of L-proline is calculated and the L-proline content in the sample is determined from the calibration curve.

Минимальная концентрация L-пролина, определяемая с помощью клеток Pseudomonas species Ш-22 (ВКПМ В-4877), составляет 0,01 мМ. В диапазоне концентраций L-пролина от 0,01 до 0,1 мМ скорость окисления L-пролина линейно зависит от концентрации этой аминокислоты в реакционной среде. The minimum concentration of L-proline, determined using cells of Pseudomonas species Ш-22 (VKPM B-4877), is 0.01 mm. In the range of L-proline concentrations from 0.01 to 0.1 mM, the oxidation rate of L-proline linearly depends on the concentration of this amino acid in the reaction medium.

Предложенный способ количественного определения L-пролина, основанный на применении штамма Pseudomonas sp. Ш-22 (ВКПМ В-4877), обладающих свойством окислять L-пролин, отличается селективностью, высокой скоростью анализа, простотой, исключает необходимость регулярного наращивания биомассы, при использовании иммобилизованных клеток позволяет многократно использовать одну и ту же порцию биокатализатора. С помощью данного способа можно проводить определения L-пролина в сложных биоорганических растворах. The proposed method for the quantitative determination of L-proline, based on the use of a strain of Pseudomonas sp. Sh-22 (VKPM V-4877), which have the property of oxidizing L-proline, is distinguished by selectivity, high analysis speed, simplicity, eliminates the need for regular biomass growth, and when using immobilized cells it allows multiple use of the same portion of the biocatalyst. Using this method, it is possible to determine L-proline in complex bioorganic solutions.

Claims

A method for the quantitative determination of L-proline, based on the use of microbial cells capable of growing on media containing L-proline as the sole source of carbon and nitrogen, characterized in that the concentration of L-proline is determined by its oxidation rate by free or immobilized bacterial cells of Pseudomonas species Sh-22 (VKPM V-4877).