RU2083223C1

RU2083223C1 - Method of preparing the mixed vaccine for immunotherapy of diseases caused by opportunistic microorganisms

Info

Publication number: RU2083223C1
Application number: RU94019810/13A
Authority: RU
Inventors: Н.Б. Егорова; В.Н. Ефремова; Е.А. Курбатова; Л.А. Кузьмина; К.Г. Каверина
Original assignee: Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им.Мечникова РАМН
Priority date: 1994-05-27
Filing date: 1994-05-27
Publication date: 1997-07-10
Also published as: RU94019810A

Abstract

FIELD: medicine, vaccines. SUBSTANCE: mixed vaccine consists of antigens raised to pneumonia, Proteus, Staphylococcus and Escherichia coli. Vaccine can be used subcutaneously and by the combined methods - intranasal-subcutaneous and intranasal-oral ones. Mixed vaccine shows good effect in 70-80% patients with chronic bronchitis and infection-dependent form of bronchial asthma. EFFECT: decrease of incidence and severity of relapses, decreased doses of drugs (antibiotics, hormones etc). 8 tbl

Description

Изобретение относится к области медицины, а именно к вакцинным препаратам. The invention relates to medicine, namely to vaccine preparations.

Цель изобретения создание поликомпонентной вакцины для разных методов введения, в единой форме для повышения эффективности лечения и профилактики обострений хронических воспалительных заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами. The purpose of the invention is the creation of a multicomponent vaccine for different methods of administration, in a single form to increase the effectiveness of the treatment and prevention of exacerbations of chronic inflammatory diseases caused by opportunistic microorganisms.

Проблема хронических воспалительных заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, является чрезвычайно актуальной для здравоохранения всего мира. Противовоспалительная, антибактериальная и симптоматическая терапия не обеспечивает положительный эффект, что ведет к хронизации процесса. Возникает необходимость в использовании препаратов, воздействующих на иммунологический статус организма. The problem of chronic inflammatory diseases caused by opportunistic microorganisms is extremely urgent for public health around the world. Anti-inflammatory, antibacterial and symptomatic therapy does not provide a positive effect, which leads to a chronic process. There is a need for the use of drugs that affect the immunological status of the body.

Для ускорения лечения больных абсцессом легкого известен препарат, состоящий из смеси антигенных компонентов клебсиеллы пневмонии, протея, стафилококка, кишечной палочки К-100, взятых в равных соотношениях. To accelerate the treatment of patients with lung abscess, a drug is known consisting of a mixture of antigenic components of Klebsiella pneumonia, Proteus, staphylococcus, E. coli K-100, taken in equal proportions.

Недостатком этого способа является слабая эффективность в составе комплекса стафилококкового компонента, введение препарата только подкожным методом, что ограничивает возможность использования его при других широко распространенных воспалительных заболеваниях легких, часто сопровождающихся аллергическим компонентом (хронический обструктивный бронхит, инфекционно-зависимая бронхиальная астма и др.). The disadvantage of this method is the low efficiency in the complex of the staphylococcal component, the administration of the drug only by the subcutaneous method, which limits its use in other widespread inflammatory diseases of the lungs, often accompanied by an allergic component (chronic obstructive bronchitis, infection-dependent bronchial asthma, etc.).

Цель изобретения достигается получением поликомпонентной вакцины, состоящей из антигенов стафилококка, протея, кишечной палочки и клебсиеллы пневмонии, обладающей высокой протективной активностью всех входящих в ее состав антигенных комплексов, выпускаемой в единой форме для разных методов введения (подкожный, оральный, комбинированный). Цель достигнута путем прибавления 3 высокоиммуногенных штаммов S. aureus, проведения водной экстракции из смеси микробной массы всех штаммов стафилококка, соединения экстракта с другими антигенами сразу после экстракции, увеличения количества стафилококковых антигенов в вакцине, повышения иммуногенности клебсиеллезного компонента за счет использования среды Ворфель-Фернюссона, экстракции антигенов кишечной палочки воздействием гидроксиламина. The purpose of the invention is achieved by obtaining a multicomponent vaccine consisting of staphylococcus antigens, protea, E. coli and Klebsiella pneumoniae, which has high protective activity of all its antigenic complexes, produced in a single form for different methods of administration (subcutaneous, oral, combined). The goal was achieved by adding 3 highly immunogenic strains of S. aureus, conducting aqueous extraction from the mixture of microbial mass of all staphylococcus strains, combining the extract with other antigens immediately after extraction, increasing the number of staphylococcal antigens in the vaccine, increasing the immunogenicity of the Klebsiellosis component through the use of Worfel-Fernyusson medium, extraction of Escherichia coli antigens by exposure to hydroxylamine.

Пример осуществления способа. An example implementation of the method.

Для приготовления поликомпонентной вакцины обобраны следующие штаммы:
1. K. pneumoniae N 204, депонирован в ГНИИСК им. Л.А. Тарасевича.The following strains were selected to prepare a multicomponent vaccine:
1. K. pneumoniae N 204, deposited in GNIISK them. L.A. Tarasevich.

2. P. vulgaris N 177, депонирован в ГНИИСК им. Л.А. Тарасевича. 2. P. vulgaris N 177, deposited in GNIISK them. L.A. Tarasevich.

3. E. coli К-100 N 147 (датская коллекция, Копенгаген). 3. E. coli K-100 N 147 (Danish collection, Copenhagen).

4. S. aureus N 1991, 1986, депонированы в ГНИИСК им. Л.А. Тарасевича и N 5 и N 9 (производственные штаммы). 4. S. aureus N 1991, 1986, deposited in GNIISK them. L.A. Tarasevich and N 5 and N 9 (production strains).

Предварительно получают белково-липополисахаридные комплексы из 3 первых видов микроорганизмов. Для этого производят посев клебсиеллы на 25 матрацев со средой Ворфель-Фергюссона следующего состава:
Натрий хлористый 2±0,1 г
Калий сернокислый 1±0,01 г
Магний сернокислый 0,25±0,01 г
Сахароза 20±0,01 г
Экстракт дрожжей 60±1,0 мл
Агар 30±0,01 г
Вода дистиллированная 940±1 мл
Через 18-24 ч выросшую культуру смывают, стандартизуют до 20 млрд./мл и прибавляют солянокислый гидроксиламин из расчета 0,05 мг на 1 млрд. микробных клеток. Инкубируют 48 ч при 37^oC. Центрифугируют при 6-10 тыс. об/мин, диализуют в течение 2 суток против водопроводной воды и затем высушивают во флаконах. Аналогично поступают со штаммами протея и кишечной палочки, но их выращивают в матрацах на среде из кислотного гидролизата казеина. Лиофильно высушенные антигенные препараты хранят до 2 лет, и они могут быть использованы для нескольких серий поликомпонентной вакцины.Preliminarily, protein-lipopolysaccharide complexes are prepared from the first 3 types of microorganisms. For this, Klebsiella is sown on 25 mattresses with the Worfel-Ferguson medium of the following composition:
Sodium chloride 2 ± 0.1 g
Potassium sulfate 1 ± 0.01 g
Magnesium sulfate 0.25 ± 0.01 g
Sucrose 20 ± 0.01 g
Yeast extract 60 ± 1.0 ml
Agar 30 ± 0.01 g
Distilled water 940 ± 1 ml
After 18-24 hours, the grown culture is washed off, standardized to 20 billion / ml and hydroxylamine hydrochloride is added at the rate of 0.05 mg per 1 billion microbial cells. Incubated for 48 hours at 37 ^o C. Centrifuged at 6-10 thousand rpm, dialyzed for 2 days against tap water and then dried in vials. Similarly treated with strains of Proteus and Escherichia coli, but they are grown in mattresses on a medium from an acid hydrolyzate of casein. Lyophilized dried antigenic preparations are stored for up to 2 years, and they can be used for several series of multicomponent vaccines.

Стафилококковый компонент вакцины готовят непосредственно перед ее компоновкой и высушиванием. Штаммы S. aureus растят в матрацах на среде из гидролизата казеина. Сеют по 7-8 матрацев каждого штамма, инкубируют 16-24 ч при 37^oC. Культуру смывают дистиллированной водой. Густую микробную взвесь стандартизуют до 100-200 млрд./мл и смешивают в равных количествах от всех 4 штаммов стафилококка.The staphylococcal component of the vaccine is prepared immediately before its composition and drying. Strains of S. aureus are grown in mattresses on a casein hydrolyzate medium. Sow 7-8 mattresses of each strain, incubated for 16-24 hours at 37 ^o C. The culture is washed off with distilled water. Thick microbial suspension is standardized to 100-200 billion / ml and mixed in equal amounts from all 4 strains of staphylococcus.

Полученную микробную массу обрабатывают трижды ацетоном. Сухую инактивированную ацетоном микробную массу подвергают трехкратной водной экстракции при соотношении 100 мл воды на 1 г сухих клеток. Центрифугируют, центрифугат используют как водный экстракт, содержащий водорастворимые антигены клеточной стенки стафилококка. Определяют сухой остаток в 1 мл экстракта. The resulting microbial mass is treated three times with acetone. Dry acetone inactivated microbial mass is subjected to three times aqueous extraction at a ratio of 100 ml of water per 1 g of dry cells. It is centrifuged, the centrifugate is used as an aqueous extract containing water-soluble antigens of the staphylococcus cell wall. Determine the dry residue in 1 ml of extract.

Сухие антигенные комплексы клебсиеллы пневмонии, протея, кишечной палочки смешивают с водным экстрактом стафилококка с таким расчетом, чтобы приготовить смесь, содержащую по 0,6 мг антигенов протея, кишечной палочки, клебсиеллы и 0,8 мг антигенов стафилококка в 1 мл вакцины. Чтобы приготовить 100,0 мл вакцины, следует взять навески сухих антигенов по 60,0 мг. Количество водного экстракта стафилококка определяют по его сухому остатку. Если сухой остаток 2 мг/мл, то следует взять 40,0 мл водного экстракта. Объем смеси доводят до 100,0 мл дистиллированной водой. После этого проводят стерилизующую фильтрацию, разлив по 4 мл в ампулы, лиофильно высушивают и запаивают ампулы под вакуумом. В каждой ампуле содержится (4,5±0,3) мг смеси антигенов. В 1 ампуле содержится 0,9±0,3 мг белка и 0,8±0,3 мг углеводов. Действующими антигенами комплекса являются белково-липополисахаридные комплексы протея, клебсиеллы и кишечной палочки, а также белок, тейхоевая кислота, полисахарид, гликопептид стафилококка. The dry antigenic complexes of Klebsiella pneumoniae, Proteus, Escherichia coli are mixed with an aqueous extract of staphylococcus in such a way as to prepare a mixture containing 0.6 mg of Proteus, Escherichia coli, Klebsiella antigens and 0.8 mg of Staphylococcus antigens in 1 ml of vaccine. To prepare 100.0 ml of the vaccine, 60.0 mg of dry antigens should be taken. The amount of staphylococcus aqueous extract is determined by its dry residue. If the dry residue is 2 mg / ml, then 40.0 ml of the aqueous extract should be taken. The volume of the mixture was adjusted to 100.0 ml with distilled water. After that, sterilizing filtration is carried out, pouring 4 ml into ampoules, freeze-dried and ampoules are sealed under vacuum. Each ampoule contains (4.5 ± 0.3) mg of a mixture of antigens. 1 ampoule contains 0.9 ± 0.3 mg of protein and 0.8 ± 0.3 mg of carbohydrates. The active antigens of the complex are protein-lipopolysaccharide complexes of Proteus, Klebsiella and Escherichia coli, as well as protein, teichoic acid, polysaccharide, staphylococcus glycopeptide.

Полученный указанным способом препарат был подвергнут доклиническому и клиническому изучению. Из представленных в таблицах данных видно, что прибавление штаммов стафилококка и увеличение количества стафилококковых антигенов позволило усилить протективную активность этого компонента вакцины (табл. 1, 2, 3). Obtained in this way, the drug was subjected to preclinical and clinical studies. From the data presented in the tables it can be seen that the addition of staphylococcus strains and an increase in the number of staphylococcal antigens made it possible to enhance the protective activity of this component of the vaccine (Tables 1, 2, 3).

Использование среды Ворфель-Фергюссона для культивирования клебсиеллы пневмонии значительно усилило иммуногенность клебсиеллезного компонента (табл. 4). Повышение иммуногенности компонентов вакцины позволило использовать ее для непарентеральных методов введения в сравнительно небольших дозах (табл. 5). The use of the Worfel-Ferguson medium for the cultivation of Klebsiella pneumonia significantly increased the immunogenicity of the Klebsiella component (Table 4). The increase in the immunogenicity of the components of the vaccine made it possible to use it for non-parenteral methods of administration in relatively small doses (Table 5).

После доклинического изучения переносимость и клиническая эффективность поликомпонентной вакцины были изучены на 26 больных бронхиальной астмой. Полученные результаты свидетельствовали, что вакцина при комбинированной интраназально-подкожной схеме введения хорошо переносится этой категорией больных и обеспечивает значительную эффективность. Эти данные послужили основанием для государственных испытаний препарата, которые проводились в Москве на базе аллергологического центра под руководством академика А.Г. Чучалина и в Санкт-Петербурге во ВНИИ пульмонологии. Суммарные результаты представлены в табл. 6, 7, 8. After a preclinical study, the tolerability and clinical efficacy of a multicomponent vaccine were studied in 26 patients with bronchial asthma. The results obtained showed that the vaccine with the combined intranasal-subcutaneous administration scheme is well tolerated by this category of patients and provides significant efficacy. These data served as the basis for state trials of the drug, which were conducted in Moscow on the basis of an allergological center under the guidance of Academician A.G. Chuchalina and in St. Petersburg at the Institute of Pulmonology. The total results are presented in table. 6, 7, 8.

Как видно из таблиц, поликомпонентная вакцина, разработанная в единой форме, оказалась эффективной при лечении воспалительных обструктивных заболеваний органов дыхания как при подкожном, так и при комбинированных интраназально-подкожном и интраназально-оральном методах введения. Комитет по медицинским иммунобиологическим препаратам рассмотрел результаты и рекомендовал вакцину для внедрения в практику. Министерство здравоохранения РФ приказом N 270 от 17.11.93 г. разрешило применение поликомпонентной вакцины в практике здравоохранения. As can be seen from the tables, the multicomponent vaccine, developed in a single form, was effective in the treatment of inflammatory obstructive diseases of the respiratory system both with subcutaneous and combined intranasal-subcutaneous and intranasal-oral methods of administration. The Committee on Medical Immunobiological Preparations reviewed the results and recommended a vaccine for implementation. The Ministry of Health of the Russian Federation by order N 270 of November 17, 1993 authorized the use of a multicomponent vaccine in healthcare practice.

Claims

A method for producing a multicomponent vaccine for immunotherapy of diseases caused by opportunistic microorganisms, including separate cultivation of the strains Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris GISK N 177, Escherichia coli K-100 N 147 and Staphylococcus aureus GISK N 1991 followed by extraction of protective antigens and the fact that Klebsiella pneumoniae strain GISK N 204 is used from Klebsiella and cultured in Worfel-Ferguson medium, Staphylococcus aureus strain GISK N 1981 and production strains Staphylococcus aureus are additionally used from staphylococci N 5, Staphylococcus aureus N 9, while the extraction of antigens from Klebsiella protel cells and Escherichia coli is carried out with hydroxylamine, and from staphylococcus cells by aqueous extraction and the resulting antigens are mixed in a ratio of 0.6, 0.6, 0.6 and 0.8 mg respectively 1 ml of distilled water.