RU2080059C1

RU2080059C1 - Method of plant preparing - raspberry regenerants in vitro

Info

Publication number: RU2080059C1
Application number: RU94005485A
Authority: RU
Inventors: В.А. Высоцкий; Ф.Н. Соломонова
Original assignee: Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства
Priority date: 1994-02-17
Filing date: 1994-02-17
Publication date: 1997-05-27

Abstract

FIELD: agriculture, biotechnology. SUBSTANCE: raspberry regenerants were prepared by leaf explants culturing on nutrient medium. Explants are leaf plates of tube plants at size above 4 mm, age is 3-5 months. Incisions were made on adaxial surface of leaf plates, placed their on nutrient medium and cultured at light intensity 80-150 mc for 5-8 days; then intensity of illumination is increased by 20-fold and cultured up to sprouts preparing length of that is necessary for rooting. EFFECT: improved method of plant preparing. 4 tbl

Description

Изобретение относится к биотехнологии в частности к культуре тканей и органов, и может быть использовано в питомниководстве для микроклонального размножения новых перспективных сортов, а также в генной инженерии для генетической трансформации растений малины посредством бактериальных векторов. The invention relates to biotechnology, in particular to a culture of tissues and organs, and can be used in nursery for microclonal propagation of promising new varieties, as well as in genetic engineering for the genetic transformation of raspberry plants through bacterial vectors.

В культуре тканей и органов все шире используются в качестве эксплантатов листья полевых, тепличных или культуральных растений. Разработана эффективная методика культивирования кусочков листьев тепличных растений земляники [1] при котором 94% листовых эксплантатов образуют придаточные побеги. Недостатком этого метода является трудоемкость процесса стерилизации листьев. Поэтому более предпочтительным считается использование в качестве эксплантатов листьев пробирочных растений, при котором отпадает необходимость стерилизации исходного эксплантата. In tissue and organ culture, leaves of field, greenhouse or cultivated plants are increasingly being used as explants. An effective technique has been developed for cultivating pieces of leaves of greenhouse plants of strawberries [1] in which 94% of leaf explants form subordinate shoots. The disadvantage of this method is the complexity of the leaf sterilization process. Therefore, it is considered more preferable to use test tube leaves as explants, in which there is no need to sterilize the original explant.

Наиболее близким техническим решением из известных является способ размножения малины методом культивирования изолированных листьев культуральных побегов [2] предлагающий инкубировать кусочки листьев диаметром 6 мм, т.е. листовые диски, на агаризованной питательной среде Мурасиге и Скуга /1962/ при фотопериоде 16/8 ч и постоянном освещении. В среду добавляются регуляторы роста БАП (2,0 мг/л) и ИМК (0,1 мг/л), сахароза (30 г/л). Рекомендуется брать в качестве эксплантатов листья только 4-6 недельных побегов. The closest technical solution known is the method of propagation of raspberries by the method of cultivation of isolated leaves of cultural shoots [2], offering to incubate pieces of leaves with a diameter of 6 mm, i.e. leaf disks, on an agarized nutrient medium Murasige and Skoog / 1962 / with a photoperiod of 16/8 h and constant lighting. Growth regulators of BAP (2.0 mg / l) and IMA (0.1 mg / l), sucrose (30 g / l) are added on Wednesday. It is recommended to take only 4-6 week old shoots as explants.

Однако этот способ имеет следующие недостатки. Процесс вырезания дисков из листьев пробирочных растений является трудоемкой операцией, занимает много времени и требует большого объема исходного материала, так как листьев, из которых можно вырезать диски необходимого размера, имеется достаточно ограниченное количество. Вместе с тем длительное пребывание листьев в боксе в сильном потоке воздуха вызывает ухудшение качества эксплантов вследствие потери воды тканями листа. Ограничение возраста доноров эксплантов снижает эффективность методики из-за увеличения объемов работ на предыдущем этапе (микроклональное размножение), в то же время у малины возраст культуральных побегов не оказывает влияния на количество регенерирующих побеги изолированных листьев. К тому же наблюдается сложность в использовании листьев и молодых пробирочных растений, так как часто такие листья имеют очень нежные ткани и быстро повреждаются в боксе под током воздуха. Намного удобнее манипулировать более зрелыми листьями, которые хорошо переносят пересадку и вместе с тем обладают высокой регенерационной способностью. However, this method has the following disadvantages. The process of cutting discs from the leaves of test plants is a time-consuming operation, it takes a lot of time and requires a large amount of source material, since there are a fairly limited number of leaves from which to cut the discs of the required size. At the same time, a long stay of leaves in the box in a strong stream of air causes deterioration in the quality of explants due to the loss of water by leaf tissues. Limiting the age of explant donors reduces the effectiveness of the technique due to an increase in the volume of work at the previous stage (microclonal propagation), while raspberries do not affect the age of cultivated shoots on the number of regenerating shoots of isolated leaves. In addition, there is a difficulty in using leaves and young test tubes, as often such leaves have very delicate tissues and are quickly damaged in the box under the flow of air. It is much more convenient to manipulate more mature leaves that tolerate transplanting and at the same time have high regenerative ability.

Задачей изобретения является повышение эффективности процесса регенерации побегов из листьев малины путем уменьшения лимитирующих факторов при отборе эксплантов и исключения наиболее трудоемких этапов их подготовки. The objective of the invention is to increase the efficiency of the process of regeneration of shoots from raspberry leaves by reducing the limiting factors in the selection of explants and eliminating the most time-consuming stages of their preparation.

Поставленная задача достигается тем, что в известном способе получения растений-регенерантов малины, включающем культивирование листовых эксплантов на искусственной питательной среде, содержащей регуляторы роста, в качестве эксплантов используют листовые пластинки пробирочных растений размеров более 4 мм в возрасте 3-5 мес, на адаксиальной поверхности которых наносят надрезы перед помещением их на питательную среду, после чего осуществляется культивирование при интенсивности света 80-150 люкс в течение 5-8 дн, затем освещенность повышают в 20 раз и продолжают культивирование до получения побегов необходимой для укоренения длины. This object is achieved by the fact that in the known method for producing raspberry regenerant plants, including cultivating leaf explants on an artificial nutrient medium containing growth regulators, leaf plates of test plants larger than 4 mm at the age of 3-5 months are used as explants on an adaxial surface which are cut before putting them on a nutrient medium, after which cultivation is carried out at a light intensity of 80-150 lux for 5-8 days, then the illumination is increased 20 times and continue cultivation to obtain shoots necessary for rooting length.

Вследствие меньшей чувствительности тканей зрелых листьев к сухости воздуха по сравнению с 4-6 недельными листьями, значительно облегчается проведение срезания листовой пластинки, поранение ее адаксиальной поверхности и высадка готового экспланта на питательную среду. Кроме того, отпадает необходимость в субкультивировании побегов в системах микроразмножения каждые 4-6 нед, что приводит к значительной экономии рабочего времени и ингредиентов культуральных сред. В качестве эксплантов используются целые листовые пластинки размером более 4 мм, вместо дисков диаметром 6 мм. Необходимость в наличии поврежденных тканей компенсируются легкими надрезами пластинки листа скальпелем. Так как место поранения не имеет принципиального значения, процесс подготовки эксплантов занимает меньше времени. Это приводит к уменьшению потери воды листьями и получению эксплантов высокого качества. Кроме того, увеличивается количество листьев на побеге, которые можно использовать в качестве эксплантов, соответственно, уменьшается объем исходного материала и сокращаются затраты на его производство. Due to the lower sensitivity of mature leaf tissues to air dryness compared to 4-6 week old leaves, cutting of the leaf blade, wounding of its adaxial surface and landing of the finished explant on a nutrient medium is greatly facilitated. In addition, there is no need to subculture shoots in micropropagation systems every 4-6 weeks, which leads to significant savings in working time and ingredients of culture media. Entire leaf blades larger than 4 mm are used as explants, instead of disks with a diameter of 6 mm. The need for damaged tissue is compensated by light incisions of the leaf plate with a scalpel. Since the location of the wound is not critical, the process of preparing explants takes less time. This leads to a decrease in water loss by leaves and to obtain high quality explants. In addition, the number of leaves on the shoot that can be used as explants increases, respectively, the volume of the source material is reduced and the cost of its production is reduced.

Предлагаемое техническое решение отличается от прототипа тем, что в качестве эксплантов используются листовые пластинки пробирочных растений в возрасте 3-5 мес, на адаксиальной поверхности которых перед высадкой на питательную среду наносят надрезы, а процесс культивирования осуществляется в течение первых 5-8 дн. при освещении 80-150 люкс, а затем освещенность увеличивают в 20 раз и продолжают культивирование до получения побегов необходимой для укоренения длины. The proposed technical solution differs from the prototype in that leaf plates of test plants aged 3-5 months are used as explants, on the adaxial surface of which cuts are made on the nutrient medium before planting, and the cultivation process is carried out during the first 5-8 days. with illumination of 80-150 lux, and then the illumination is increased by 20 times and continue cultivation until the shoots are obtained for the necessary rooting length.

Способ осуществляется следующим образом. The method is as follows.

Листовые пластинки малины размером более 4 мм 2-4-месячных пробирочных растений срезают с побегов. На адаксиальной поверхности делают несколько надрезов скальпелем. Подготовленные таким образом экспланты высаживают на питательную агаризованную среду. Питательную среду обогащают витаминами B5, сахарозой (30 г/л), регуляторами роста БАП (2,0 мл/г), и ИМК (2,0 мг/л), агаром (8 г/л), мионозитом (100 мг/л). рН среды перед автоклавированием доводят до 5,8-5,9. Raspberry leaf blades larger than 4 mm in size of 2-4-month-old test-tube plants are cut from shoots. Several incisions are made with a scalpel on the adaxial surface. Thus prepared explants are planted on a nutrient agar medium. The nutrient medium is enriched with vitamins B5, sucrose (30 g / l), BAP growth regulators (2.0 ml / g), and IMA (2.0 mg / l), agar (8 g / l), myonositis (100 mg / l). The pH of the medium before autoclaving is adjusted to 5.8-5.9.

В течение первой недели экспланты инкубируют в условиях пониженного освещения (80-150 люкс), для чего свет пропускают через картон. Уменьшение интенсивности света увеличивает существенно частоту регенерации. Через неделю картон снимают и интенсивность света повышают в 20 раз. Хорошее освещение в дальнейшем способствует быстрому росту регенератов. Инкубирование осуществляют до получения побегов необходимой для укоренения длины. During the first week, the explants are incubated in low light conditions (80-150 lux), for which the light is passed through cardboard. A decrease in light intensity significantly increases the frequency of regeneration. After a week, the cardboard is removed and the light intensity is increased by 20 times. Good lighting further contributes to the rapid growth of regenerates. Incubation is carried out until the shoots necessary for rooting the shoots are obtained.

Использование предлагаемого способа регенерации побегов на листовых эксплантах малины обеспечивает по сравнению с существующими методами следующие преимущества:
повышается до 100% количество листовых эксплантов, регенерирующих побеги;
упрощается процесс подготовки эксплантов;
уменьшается объем работ в системах микроклонального размножения малины для получения необходимого количества доноров эксплантов;
достигается экономия питательных сред и физиологически активных веществ.Using the proposed method of regeneration of shoots on raspberry leaf explants provides the following advantages compared to existing methods:
the number of leaf explants regenerating shoots increases to 100%;
the process of preparing explants is simplified;
the amount of work in raspberry microclonal propagation systems is reduced to obtain the required number of explant donors;
achieved savings in nutrient media and physiologically active substances.

Claims

A method of producing raspberry regenerated plants in vitro, comprising cultivating leaf explants on an artificial nutrient medium containing growth regulators, characterized in that leaf blades of test plants larger than 4 mm in size at the age of 3-5 months are used as explants, on which an incision is made before placing them on a nutrient medium, after which cultivation is carried out at a light intensity of 80 150 lux for 5 8 days, then the cultivation is carried out under illumination, 20 times greater than the initial, until the shoots are necessary for rooting the length.