RU2079554C1

RU2079554C1 - Device and method of biological material incorporation

Info

Publication number: RU2079554C1
Application number: SU904830380A
Authority: RU
Inventors: Е.Миллер Теодор (младший); С.Шухарт Брэдли; Р.Гоулд Алан (AU/GB); А.Скокут Томас
Original assignee: Дау Эланко
Priority date: 1989-06-30
Filing date: 1990-06-29
Publication date: 1997-05-20
Also published as: ZA905110B; UA26312A

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: invention relates to methods of molecules incorporation in cells. Device has the source of gas, reservoir for material to be incorporated, agent for feeding material, chamber for material incorporation in cells. Material is fixed on carrier particles in the gaseous flow under increased pressure and contacted with cells to be treated. EFFECT: improved method of incorporation. 10 cl, 12 dwg , 1 tbl

Description

Изобретение касается устройства для введения биологического материала в живые клетки, содержащее резервуар для внедрения в клетку материала с входным и выходным отверстиями и источник газа под давлением с выходным отверстием для газа, сообщенным с резервуаром. The invention relates to a device for introducing biological material into living cells, comprising a reservoir for introducing into the cell material with inlet and outlet openings and a gas source under pressure with an outlet for gas in communication with the reservoir.

Изобретение также касается соответствующего способа введения биологического материала в растительные клетки, предусматривающего предварительное культивирование клеток и внедрение биологического материала, связанного с частицами носителя, в клетку. The invention also relates to an appropriate method for introducing biological material into plant cells, which involves pre-culturing the cells and introducing biological material associated with carrier particles into the cell.

Поскольку значительное количество современных исследований направлено на генетическую трансформацию клеток, биологам требуется вводить в живые клетки самые разнообразные материалы. Известные технологии введения биологических материалов в живые клетки используют электропорацию, прямое поглощение ДНК, механизмы слияния, использование инфицирующих агентов, а также микроинъекции. Все эти технологии однако очень сложны, недостаточно эффективны и их трудно контролировать. Кроме того, не все эти технологии пригодны для введения биологических материалов в растительные клетки, которые обычно имеют значительно более прочную оболочку. Since a significant amount of modern research is aimed at the genetic transformation of cells, biologists need to introduce a wide variety of materials into living cells. Known technologies for introducing biological materials into living cells use electroporation, direct DNA uptake, fusion mechanisms, the use of infectious agents, and microinjections. All of these technologies, however, are very complex, insufficiently effective and difficult to control. In addition, not all of these technologies are suitable for introducing biological materials into plant cells, which usually have a significantly stronger membrane.

Поэтому сравнительно недавно Сэнфорд и др. предложили способ доставки биологического материала в живые клетки с использованием газа под давлением [см. Klein et al. (1987), Nature, 337, а также Sanford et al. (1988), Particular Sci. and Technol, (5:27-37)] По технологии Сэнфорда, небольшие частицы высокой плотности (вольфрам) ускоряют до высокой скорости с помощью стреляющей частицами "пушки". Это позволяло обеспечить проникновение биологического материла на частицах в растительные клетки. Применялось несколько вариантов выполнения "пушки": 1) со стрельбой пластиковыми микроснарядами в мишенную пластину; 2) с использованием механического импульса; 3) с использованием центростремительного ускорения и 4) с использованием газового (воздушного) разряда. Последний вариант, в котором стрельба ведется нагруженными суспензиями биологического материала вольфрамовыми частицами посредством газового разряда, представляет наибольший интерес. При этом используют описанное во вступительном абзаце устройство, включающее резервуар для внедрения в клетку материала с входным и выходным отверстиями для газа, сообщенным с резервуаром. Therefore, relatively recently, Sanford et al. Have proposed a method for delivering biological material to living cells using gas under pressure [see Klein et al. (1987), Nature, 337, as well as Sanford et al. (1988), Particular Sci. and Technol, (5: 27-37)] According to Sanford technology, small particles of high density (tungsten) are accelerated to high speed with the help of a firing particle gun. This made it possible to ensure the penetration of biological material on particles into plant cells. Several versions of the "gun" were used: 1) with firing of plastic microprojectiles at the target plate; 2) using a mechanical impulse; 3) using centripetal acceleration; and 4) using gas (air) discharge. The latter option, in which firing is carried out by loaded suspensions of biological material with tungsten particles by means of a gas discharge, is of most interest. In this case, the device described in the introductory paragraph is used, including a reservoir for introducing material into the cell with gas inlet and outlet openings in communication with the reservoir.

Однако, несмотря на то, что эта технология представляет собой значительный шаг вперед в данной области, она также не лишена некоторых недостатков. Так, трудно регулировать количество суспензии, которой нагружаются вольфрамовые частицы, чем затрудняется воспроизведение результатов эксперимента и повторная прививка культур является весьма трудоемкой процедурой. Кроме того, скорость должна варьироваться для изменения, при необходимости, характеристик стрельбы, но при этом скорость суспензии не может быть измерена непосредственно. However, despite the fact that this technology represents a significant step forward in this area, it is also not without some drawbacks. So, it is difficult to control the amount of suspension, which is loaded with tungsten particles, which makes it difficult to reproduce the results of the experiment and re-grafting of cultures is a very time-consuming procedure. In addition, the speed should vary to change, if necessary, the characteristics of the shooting, but the speed of the suspension cannot be measured directly.

Изобретение предлагает усовершенствованную технологию введения в живые клетки, а именно в первом своем аспекте предлагает устройство указанного типа, отличающееся тем, что оно содержит три контейнера, первый служащий источником газа, второй служащий средством подачи внедряемого материала и третий служащий резервуаром для внедряемого материала, трубку для макроприцеливания с входным и выходным отверстиями, первое из которых сообщено с выходным отверстием третьего контейнера, двойной трехходовой клапан с двумя вспомогательными клапанами, первый из которых служит для селективной пневматической связи между выходным отверстием первого контейнера или выходным отверстием из второго контейнера с входным отверстием третьего контейнера и для обеспечения селективного сообщения между входным отверстием трубки макроприцеливания и выходным отверстием третьего контейнера. The invention offers an improved technology for introducing into living cells, namely, in its first aspect, it offers a device of the indicated type, characterized in that it contains three containers, a first serving as a source of gas, a second serving as a means of supplying introduced material and a third serving as a reservoir for the introduced material, a tube for macro targeting with inlet and outlet, the first of which is communicated with the outlet of the third container, a double three-way valve with two auxiliary valves s, the first of which serves for the selective pneumatic communication between the outlet of the first container and an outlet from the second container to the inlet of the third container and for providing selective communication between the inlet tube and the outlet makropritselivaniya third container.

Во втором аспекте, изобретение предлагает способ введения биологического материала в растительные клетки, предусматривающий предварительное культивирование клеток и внедрение биологического материала, связанного с частицами носителя, в клетки, усовершенствованный тем, что связывание биологического материала осуществляют посредством фиксирования его в объеме от 0,5 до 1000 микролитров на частицах носителя диаметром от 0,1 до 100 микрон и плотностью от 1 до 25 г/кв. см, а внедрение проводят посредством подачи связанного материала к клеткам с потоком газа объемом от 1 до 100 мл и молекулярным весом от 2 до 40 атомных единиц под давлением 15 150 атм, обеспечивающим ускорение со скоростью, достаточной для проникновения внедряемого материала внутрь клетки. In a second aspect, the invention provides a method for introducing biological material into plant cells, comprising pre-culturing the cells and introducing biological material bound to carrier particles into cells, improved in that the binding of the biological material is carried out by fixing it in a volume of from 0.5 to 1000 microliters on carrier particles with a diameter of 0.1 to 100 microns and a density of 1 to 25 g / sq. cm, and the introduction is carried out by supplying bound material to cells with a gas flow of 1 to 100 ml and a molecular weight of 2 to 40 atomic units under a pressure of 15 150 atm, providing acceleration at a speed sufficient for penetration of the introduced material into the cell.

Следует учитывать, что изобретение может использоваться для ускорения самых разнообразных материалов, хотя создано оно конкретно для ускорения суспензии биологического материала. It should be borne in mind that the invention can be used to accelerate a wide variety of materials, although it was specifically designed to accelerate the suspension of biological material.

Используемый биологический материал может быть как клеточным, так и неклеточным. Частицы (клетки) этого материала могут быть сравнительно небольшого размера, предпочтительно, менее одного микрона, еще более предпочтительно менее 0,1 микрона. В общем случае количество используемого биологического материала будет составлять до 5 микрограмм, хотя конкретные количества могут варьироваться в зависимости от типа используемого клеточного материала. The biological material used can be either cellular or non-cellular. The particles (cells) of this material may be of relatively small size, preferably less than one micron, even more preferably less than 0.1 micron. In general, the amount of biological material used will be up to 5 micrograms, although the specific amounts may vary depending on the type of cellular material used.

Под термином "неклеточный биологический материал" подразумевается такой материал, как вирусы (вирус табачной мозаики (ТМВ), вирус мозаики цветной капусты (ВМЦК), вирус полосатости маиса (ВПМ) и т.д.), органеллы (например, митохондрии, ядра, хлоропласты или плазмиды), генетический материал (например, либо РНК, либо ДНК или в форме плазмид, или однонитевой, или двухнитевой), протеины (антитела или ферменты) или красители. The term "non-cellular biological material" means such materials as viruses (tobacco mosaic virus (TMB), cauliflower mosaic virus (MCC), maize streak virus (VPM), etc.), organelles (for example, mitochondria, nuclei, chloroplasts or plasmids), genetic material (for example, either RNA, or DNA, either in the form of plasmids, or single-stranded, or double-stranded), proteins (antibodies or enzymes) or dyes.

Когда в качестве неклеточного биологического материала используют ДНК, то ДНК может встраиваться в вектор, приспособленный для экспрессии экзогенного гена в клетках. Соответствующие векторы трансформации включают векторы экспрессии. When DNA is used as a non-cellular biological material, DNA can be inserted into a vector adapted to express an exogenous gene in cells. Suitable transformation vectors include expression vectors.

Векторы, пригодные для экспрессии, в общем случае должны включать, помимо кодирующей последовательности необходимого экзогенного гена, соответствующие боковые регулирующие последовательности. Такие боковые последовательности включают соответствующий промотор, способный промотировать транскрипцию и экспрессию "ин-виво" в клетках, а также терминатор трансляции, способный сообщать о конце транскрипции или обеспечивать соответствующую обработку РНК таким образом, чтобы осуществлялась соответствующая трансляция информационной РНК для синтеза протеина. Vectors suitable for expression should generally include, in addition to the coding sequence of the desired exogenous gene, appropriate side regulatory sequences. Such side sequences include an appropriate promoter capable of promoting transcription and in vivo expression in cells, as well as a translation terminator capable of reporting the end of transcription or providing appropriate RNA processing so that appropriate translation of messenger RNA for protein synthesis is performed.

Когда ДНК- инсерт вставляют в живую клетку, в предпочтительном варианте на отдельной стадии просеивают потомство, чтобы отобрать трансформированные клетки, так как не все клетки будут иметь инсерты, и не все клетки или потомство будут принимать ДНК-инсерт в свой геном. Наличие целевого ДНК-инсерта в клетках может быть затем установлено при помощи самых разнообразных приемов, в зависимости от природы ДНК. When a DNA insert is inserted into a living cell, it is preferred that the offspring is sieved in a separate step to select the transformed cells, since not all cells will have inserts, and not all cells or offspring will accept the DNA insert into their genome. The presence of the target DNA insert in the cells can then be established using a variety of techniques, depending on the nature of the DNA.

Вектор трансформации может содержать маркер, позволяющий проводить отбор трансформированных клеток. Селекционный маркер может содержать либо признак, который можно определить биохимически, либо фенотипный признак, который устанавливается визуально. The transformation vector may contain a marker that allows selection of transformed cells. A selection marker may contain either a trait that can be determined biochemically, or a phenotypic trait that is established visually.

Альтернативой использованию таких маркеров могут быть соответствующие морфологические или биохимические испытания для выявления трансформированного потомства. Морфологическое просеивающее испытание может быть проведено для основного фенотипного признака в потомстве. Соответствующим биохимическим методом селекции является блоттинг по Саузерну с зондом, гибридизирующимся с самой трансформирующей ДНК в геноме микроорганизма, растительных или животных клетках. An alternative to the use of such markers may be appropriate morphological or biochemical tests to identify transformed offspring. A morphological screening test can be performed for the main phenotypic trait in the offspring. The corresponding biochemical selection method is Southern blotting with a probe hybridizing with the transforming DNA itself in the genome of a microorganism, plant or animal cells.

Присутствие гена, который продуцирует экзогенный продукт, может также обнаруживаться путем выделения и лизиса клетки и анализа их цитоплазмы на экзогенный продукт, или анализа их ядер на экзогенный ген. Экзогенный продукт может быть обнаружен при помощи электрофореза, хроматографии, иммуноанализа, блоттингом по Саузерну и т.п. The presence of a gene that produces an exogenous product can also be detected by isolating and lysing cells and analyzing their cytoplasm for an exogenous product, or analyzing their nuclei for an exogenous gene. An exogenous product can be detected by electrophoresis, chromatography, immunoassay, Southern blotting, etc.

Под термином "клеточный биологический материал" подразумеваются отдельные или многоклеточные массы клеточных микроорганизмов, растительных или животных клеток. By the term "cellular biological material" is meant single or multicellular masses of cellular microorganisms, plant or animal cells.

В настоящем описании выражение "клеточные микроорганизмы" включает бактерии и простейшие. As used herein, the expression “cell microorganisms” includes bacteria and protozoa.

В настоящем описании выражение "растительные клетки" включает клетки, которые являются интактными в растении, или части растения, такие как, например, цветы, зерна, колосья, орехи, листья, шелуха, стебли, растительные клеточные или тканевые культуры, которые содержат или не содержат клеточные оболочки или другие естественные защитные покрытия, например, протопласты, растительные наплывы, растительные ткани побегов или стволов, субклеточные структуры, зерна пыльцы, растительные меристемы, яйцеклетки, зиготы, семена, способные к проращиванию. As used herein, the expression “plant cells” includes cells that are intact in a plant, or parts of a plant, such as, for example, flowers, grains, ears, nuts, leaves, husks, stems, plant cell or tissue cultures that contain or not contain cell membranes or other natural protective coatings, for example, protoplasts, plant bursts, plant tissues of shoots or trunks, subcellular structures, pollen grains, plant meristems, egg cells, zygotes, germinating seeds .

Растительные клетки могут быть получены из любых растительных видов. Термин "растительный вид" включает однодольные растения (например, травы и злаковые сельскохозяйственные культуры, такие как маис, рожь, ячмень, пшеница, сорго, овес, просо и рис), и двудольные растения (например, широколиственные растения, такие как табак, картофель и люцерна). Plant cells can be obtained from any plant species. The term “plant species” includes monocotyledonous plants (eg, herbs and cereal crops such as maize, rye, barley, wheat, sorghum, oats, millet and rice), and dicotyledonous plants (eg broad-leaved plants such as tobacco, potatoes and alfalfa).

Как используется здесь, термин "животные клетки" включает ткани млекопитающих, рыбы, птицы, рептилий и амфибий. As used here, the term "animal cells" includes the tissues of mammals, fish, birds, reptiles and amphibians.

Биологический материал может быть адсорбирован на поверхности несущей частицы при помощи самых разнообразных приемов. Например, биологический материал может быть получен при помощи простой сушки на соответствующих несущих частицах, как описано ниже. Biological material can be adsorbed on the surface of a carrier particle using a variety of techniques. For example, biological material can be obtained by simple drying on appropriate carrier particles, as described below.

Несущие частицы должны иметь размеры, форму и плотность, достаточные для проникновения через клеточную мембрану и/или клеточную оболочку, не нанося существенного физического ущерба самой клетке. Несущие частицы, которые являются слишком малыми или недостаточно плотными, могут оказаться неспособными к проникновению в некоторые клетки, в то время как несущие частицы, которые являются слишком большими или слишком плотными, могут оказаться гибельными для других. Факторы, отличные от размера частиц, такие как присутствие клеточной оболочки или избыток внутриклеточных ядер, могут также влиять на зависимость эффективности трансформации от выбранных размеров или плотности "снарядов". The carrier particles must be of size, shape and density sufficient for penetration through the cell membrane and / or cell membrane without causing substantial physical damage to the cell itself. Carrier particles that are too small or not sufficiently dense may be unable to penetrate some cells, while carrier particles that are too large or too dense may be fatal to others. Factors other than particle size, such as the presence of a cell membrane or an excess of intracellular nuclei, can also influence the dependence of transformation efficiency on the selected size or density of "shells".

В общем случае, несущие частицы имеют диаметр в пределах от 0,1 микрона до 100 микрон, в предпочтительном варианте от 0,5 микрона до 5 микрон. В общем случае, несущие частицы имеют плотность в области от 1 грамма/сантиметр³ (г/см³) до 25 г/см³, в предпочтительном варианте от 10 г/см³ до 25 г/см³.In general, the carrier particles have a diameter in the range of 0.1 microns to 100 microns, preferably 0.5 microns to 5 microns. In general, the carrier particles have a density in the region of 1 gram / centimeter ³ (g / cm ³ ) to 25 g / cm ³ , preferably 10 g / cm ³ to 25 g / cm ³ .

Несущие частицы могут быть изготовлены из биологически инертного плотного материала. Такие примеры материалов включают некоторые металлы, например вольфрам, золото, платину, палладий, серебро и никель, латекс, стекло, керамику, хирургические сплавы и кристаллы феррита. The carrier particles can be made of a biologically inert dense material. Such examples of materials include certain metals, for example tungsten, gold, platinum, palladium, silver and nickel, latex, glass, ceramics, surgical alloys, and ferrite crystals.

В соответствии с другим вариантом выполнения, несущие материалы могут быть биологическими материалами, заключенными в инертные материалы. Примерами образующих капсулу агентов является полилизин (молекулярный вес 200000). Агент, образующий капсулу, наносят на частицы при помощи увлажнения частиц раствором такого агента, а затем сушки воздухом или нагревания таким образом покрытых частиц. После того как несущие частицы покрыты агентом, образующим капсулу, и соответствующим образом высушены, затем частицы носителя могу быть нагружены биологическим материалом. В качестве альтернативы, заключение в капсулу биологического материала может быть осуществлено вместе с осаждением материала на частицы. According to another embodiment, the carrier materials may be biological materials enclosed in inert materials. Examples of capsule forming agents are polylysine (molecular weight 200,000). The capsule forming agent is applied to the particles by wetting the particles with a solution of such an agent, and then drying with air or heating the coated particles in this way. After the carrier particles are coated with a capsule forming agent and suitably dried, then the carrier particles can be loaded with biological material. Alternatively, encapsulation of the biological material can be carried out along with the deposition of the material on the particles.

Кроме того, клеточный биологический материал (прокариотный или эукариотный) может быть заморожен, суспендирован в несущей среде и использован в качестве снарядов для ускорения непосредственно в субстанцию-мишень. In addition, cellular biological material (prokaryotic or eukaryotic) can be frozen, suspended in a carrier medium and used as shells to accelerate directly into the target substance.

Любая среда, которая не представляет опасности для внедряемого биологического материала, пригодна для использования в качестве носителя. Any environment that is not harmful to the introduced biological material is suitable for use as a carrier.

Биологический материал может быть культивирован в любой среде, пригодной поддерживать метаболизм и рост субстанций и/или клеток. Примеры культур приведены у Мурашиге и Скуга (1962), Physiol. Plantarum, т.15, стр. 473 496, и Шенка и Хилдебрандта (1972), Canadian Journal of Botany, т.50,стр. 199 - 204. Biological material can be cultured in any medium suitable for supporting the metabolism and growth of substances and / or cells. Examples of cultures are given by Murashige and Skoog (1962), Physiol. Plantarum, vol. 15, p. 473,496, and Schenck and Hildebrandt (1972), Canadian Journal of Botany, vol. 50, p. 199 - 204.

Несущую среду необходимо выбирать так, чтобы она имела достаточную текучесть для переноса несущих частиц внутри ее. Текучесть несущей среды зависит от плотности, поверхностного натяжения, эффективного объема и вязкости внедряемого материала. В предпочтительном варианте несущая среда должна быть способной суспендировать клеточный или неклеточный биологический материал и, необязательно, несущие частицы. The carrier medium must be selected so that it has sufficient fluidity to transfer the carrier particles within it. The fluidity of the carrier medium depends on the density, surface tension, effective volume and viscosity of the introduced material. In a preferred embodiment, the carrier medium should be capable of suspending cellular or non-cellular biological material and, optionally, carrier particles.

В общем случае, несущая среда должна иметь плотность, которая эффективна с точки зрения поддержания частиц внутри себя, когда она движется. В предпочтительном варианте, плотность несущей среды должна содержаться в области от 0,5 грамм на кубический сантиметр (г/см³) до 2,0 г/см³.In general, a carrier medium must have a density that is effective in maintaining particles within itself as it moves. In a preferred embodiment, the density of the carrier medium should be contained in the region from 0.5 grams per cubic centimeter (g / cm ³ ) to 2.0 g / cm ³ .

В общем случае, несущая среда должна иметь поверхностное натяжение, которое эффективно с точки зрения поддержания своего когезионного внедряемого объема. В предпочтительном варианте поверхностное натяжение несущей среды должно изменяться в области от 20 до 80 дин/см. In general, a carrier medium should have a surface tension that is effective in maintaining its cohesive implant volume. In a preferred embodiment, the surface tension of the carrier medium should vary from 20 to 80 dyne / cm.

В общем случае, несущая среда должна иметь объем, который эффективен с точки зрения суспендирования необходимого количества несущих частиц. В предпочтительном варианте объем несущей среды должен изменяться от 0,5 микролитра до 1000 микролитров. In general, the carrier medium should have a volume that is effective in terms of suspending the required amount of carrier particles. In a preferred embodiment, the volume of the carrier medium should vary from 0.5 microliters to 1000 microliters.

В общем случае, несущая среда должна иметь вязкость, которая эффективна с точки зрения поддержания когезионного внедряемого объема и суспендирования частиц. В предпочтительном варианте вязкость несущей среды должна изменяться в области от 0,1 до 10 сантипуаз, в самом предпочтительном варианте от 0,5 до 2 сантипуаз. In general, a carrier medium should have a viscosity that is effective in maintaining a cohesive implant volume and particle suspension. In a preferred embodiment, the viscosity of the carrier medium should vary in the range from 0.1 to 10 centipoise, in the most preferred embodiment, from 0.5 to 2 centipoise.

Примеры несущих сред включают жидкости, такие как вода, этанол; буферные растворы, включая фосфатные, цитратные и ацетатные буферы; растворы солей, включая хлориды калия, натрия и кальция; гликоли, глицерины и фторированные углеводороды; и жидкий азот, когда клеточный или неклеточный биологический материал заморожен. Examples of carrier media include liquids such as water, ethanol; buffers, including phosphate, citrate, and acetate buffers; salt solutions, including potassium, sodium and calcium chlorides; glycols, glycerins and fluorinated hydrocarbons; and liquid nitrogen, when cellular or non-cellular biological material is frozen.

Соответствующая субстанция-мишень может быть клеточным биологическим материалом; или неклеточным биологическим материалом, каждый из которых описан выше. Биологический материал может быть культивирован/внесен в любую среду, способную поддерживать биологический материал во время удара микрочастиц. The corresponding target substance may be cellular biological material; or non-cellular biological material, each of which is described above. Biological material can be cultured / introduced into any medium capable of supporting biological material during the impact of microparticles.

На клетки может быть нанесен слой масла, чтобы регулировать гидравлическое давление среды и улучшить живучесть клеток, способствуя закрытию повреждения, возникающего во время проникновения. Например, живые клетки могут быть промыты в изотонном растворе с тем, чтобы поддержать в момент прокалывания мембраны баланс осмотического давления внутриклеточной субстанции внеклеточного раствора в зоне "прокола" мембраны клетки. Здесь могут присутствовать ионы кальция в качестве стабилизирующего мембрану агента так, что поврежденная часть мембраны может быть быстро восстановлена. Примеры изотонных растворов включают растворы, которые в общем случае используют в различных приемах микроинъекций в растительные клетки, раствор Рингера для клеток холоднокровных животных, простейших и микроорганизмов, растворы Рингера-Лока, Рингера-Тирода и другие растворы для клеток животных. A layer of oil can be applied to the cells to regulate the hydraulic pressure of the medium and improve cell viability by helping to close the damage that occurs during penetration. For example, living cells can be washed in an isotonic solution in order to maintain the balance of the osmotic pressure of the intracellular substance of the extracellular solution in the puncture zone of the cell membrane when the membrane is pierced. Calcium ions may be present as a membrane stabilizing agent so that the damaged portion of the membrane can be quickly restored. Examples of isotonic solutions include solutions that are generally used in various microinjection techniques in plant cells, Ringer's solution for cold-blooded animal cells, protozoa and microorganisms, Ringer-Lock, Ringer-Tyrode solutions and other solutions for animal cells.

Бомбардировки субстации-мишени может приводить к тому, что часть пробы теряется из-за рассеяния при соударении внедряемого материала и субстанции-мишени. Примеры удерживающих средств для удерживания субстанции-мишени на месте включает фильтрующую бумагу, среду агара, металлические сита и клетки из металлических сеток. Например, последующие инкубирование и окрашивание клеточного биологического материала может быть осуществлено непосредственно на фильтрующей бумаге. В соответствии с другим вариантом выполнения, как субстанция-мишень, так и внедряемый материал могут быть помещены в раствор, а затем их можно бомбардировать непокрытыми несущими частицами, которые суспендированы в несущей среде. Такие несущие частицы могут притягивать к себе заданный объем внешнего раствора, содержащего неклеточный биологический материал в клеточном биологическом материале. The bombardment of the target substance can lead to the fact that part of the sample is lost due to scattering during the collision of the introduced material and the target substance. Examples of retention aids for holding the target substance in place include filter paper, agar medium, metal sieves and metal mesh cells. For example, subsequent incubation and staining of cellular biological material can be carried out directly on filter paper. According to another embodiment, both the target substance and the introduced material can be placed in the solution, and then they can be bombarded with uncoated carrier particles that are suspended in the carrier medium. Such carrier particles can attract a predetermined volume of an external solution containing non-cellular biological material in cellular biological material.

Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения будет теперь описан со ссылкой на чертежи. Устройство, являющееся предметом настоящего изобретения, может иметь любую соответствующую конструкцию, позволяющую заранее определенному выбранному объему газа, имеющему выбранное давление газа, контактировать и ускорять заранее определенное количество внедряемого в клетку материала в направлении выбранной субстанции-мишени. A preferred embodiment of the present invention will now be described with reference to the drawings. The device of the present invention can be of any suitable design, allowing a predetermined selected volume of gas having a selected gas pressure to contact and accelerate a predetermined amount of material introduced into the cell in the direction of the selected target substance.

Признаки и преимущества настоящего изобретения более подробно рассматриваются ниже со ссылкой на сопровождающие чертежи, на которых изображено: фиг. 1 схема устройства по изобретению; фиг.2 схема клапана, используемого с устройством на фиг. 1; фиг.3 схема варианта выполнения источника газа под давлением для использования с устройством по изобретению; фиг.4 и 5 варианты выполнения резервуара для внедряемого материала, используемого с устройством на фиг.1 по изобретению; фиг.6 и 7 варианты выполнения средства подачи внедряемого материала с трубкой макроприцеливания; фиг.8 схематическое представление варианта выполнения средства измерения скорости для использования с устройством по изобретению; фиг.9 схема синхронизирующего средства для использования с устройство по изобретению; фиг.10 и 11 электрические схемы для средства измерения скорости на фиг. 6, и фиг.12 график необработанных данных, использованных для измерения времени полета внедряемого материала при помощи электрической схемы, описанной ниже в параграфе "Примеры". The features and advantages of the present invention are discussed in more detail below with reference to the accompanying drawings, in which: FIG. 1 diagram of a device according to the invention; 2 is a diagram of a valve used with the device of FIG. one; figure 3 diagram of an embodiment of a source of gas under pressure for use with the device according to the invention; 4 and 5 embodiments of the reservoir for the introduced material used with the device of figure 1 according to the invention; 6 and 7, embodiments of a means for supplying an introduced material with a macro targeting tube; Fig. 8 is a schematic representation of an embodiment of a speed measuring means for use with the device of the invention; Fig.9 diagram of the synchronizing means for use with the device according to the invention; 10 and 11 are electrical diagrams for the means for measuring speed in FIG. 6, and FIG. 12 is a graph of the raw data used to measure the flight time of the introduced material using the circuitry described below in the Examples section.

На фиг. 1 схематически изображено устройство 1, которое содержит многоцелевой клапан 2, источник газа под давлением 3, источник 4 подлежащего внедрению в клетку материала, резервуар 5 для внедряемого материала, имеющий входное и выходное отверстие, средство подачи 6 и средство для извлечения 7. In FIG. 1 schematically shows a device 1, which contains a multi-purpose valve 2, a gas source under pressure 3, a source 4 of material to be introduced into the cell, a reservoir 5 for introduced material having an inlet and an outlet, a supply means 6 and extraction means 7.

Многоцелевой клапан 2 выбирают таким образом, чтобы он имел конструкцию, допускающую возможность селективной связи между либо источником под давлением 3, либо, необязательно, источником 4 внедряемого материала и резервуаром 5 для внедряемого материала. Многоцелевой клапан 2 также выбирают так, чтобы он имел конструкцию, способную обеспечить селективную связь между резервуаром 5 для внедряемого в клетку материала, и либо средством подачи 6, либо необязательно, средством для извлечения 7. The multi-purpose valve 2 is selected so that it has a design that allows selective communication between either the source under pressure 3 or, optionally, the source 4 of the introduced material and the reservoir 5 for the introduced material. The multi-purpose valve 2 is also chosen so that it has a structure capable of providing selective coupling between the reservoir 5 for the material introduced into the cell, and either the supply means 6 or, optionally, the extraction means 7.

Как показано на фиг.2, одно из осуществлений многоцелевого клапана 2 может содержать первый подклапан 8 и второй подклапан 9. Первый подклапан 8 обеспечивает селективную связь между либо выходным отверстием источника газа под давлением 3, либо выходным отверстием источника 4 внедряемого в клетку материала, и входным отверстием резервуара 5 для внедряемого материала. Второй подклапан 9 обеспечивает селективную связь между выходным отверстием резервуара 5 для внедряемого в клетку материала и либо входным отверстием средства подачи 6, либо входным отверстием средства 7 для извлечения. As shown in FIG. 2, one embodiment of multipurpose valve 2 may include a first subvalve 8 and a second subvalve 9. The first subvalve 8 provides a selective connection between either the outlet of the gas source under pressure 3 or the outlet of the source 4 of material introduced into the cell, and the inlet of the reservoir 5 for the introduced material. The second subvalve 9 provides a selective connection between the outlet of the reservoir 5 for the material introduced into the cell and either the inlet of the supply means 6 or the inlet of the extraction means 7.

Примерами выполнения первого подклапана 8 и второго подклапана 9 могут быть отдельно один трехканальный клапан или два двухканальных клапана при условии, что двухканальные клапаны могут находиться в оперативной взаимосвязи через соответствующее средство. Примеры средств для поддержания двухканальных клапанов в оперативной связи включают общий привод 10 или раздельные приводы (не показаны). Examples of the first sub-valve 8 and the second sub-valve 9 can be separately one three-channel valve or two two-channel valves, provided that the two-channel valves can be in operative relationship through appropriate means. Examples of means for maintaining two-channel valves in operational communication include a common actuator 10 or separate actuators (not shown).

Приводы первого 8 и второго 9 подклапанов выбирают таким образом, чтобы обеспечить переключение подач под давлением на клапан. В общем случае, любой привод, способный осуществить линейное или вращательное движение, можно использовать. Примеры приводов включают пневматическое средство двойного действия, функционирующее при помощи зубчато-шестеренной передачи. Когда используют различные приводы, эти приводы могут быть синхронизированы при помощи средства типа таймера (не показан). Примеры таймерных средств включают многополюсные переключатели в комбинации с вспомогательными соленоидами или общими, приводящими в движение, валами. The actuators of the first 8 and second 9 sub-valves are selected so as to ensure switching of the pressure supply to the valve. In general, any drive capable of linear or rotational motion can be used. Examples of actuators include a double-acting pneumatic means that operates by means of a gear-gear transmission. When various drives are used, these drives can be synchronized by means of a timer type (not shown). Examples of timer means include multi-pole switches in combination with auxiliary solenoids or common shafts.

В предпочтительном варианте, приводы находятся в оперативной комбинации с ножной педалью (не показана), что упрощает функционирование и увеличивает производительность устройства. In a preferred embodiment, the actuators are in operative combination with a foot pedal (not shown), which simplifies operation and increases the productivity of the device.

В общем случае, резервуар 5 для внедряемого в клетку материала может быть выбран из любого количества контейнеров, таких как трубы. Резервуар 5 для внедряемого материала может в предпочтительном варианте иметь внутреннюю поверхность, выбранную с тем, чтобы установить внутреннее пространство с относительным удлинением, достаточным для того, чтобы обеспечить равномерное впрыскивание внедряемого в клетку материала и обеспечить минимальное замедление, т.е. такое, которое прилипает или смачивает внутренние стенки резервуара 5 для внедряемого в клетку материала. Примеры резервуара 5 для внедряемого материала способны удерживать от 0,005 мл до 100 мл внедряемого материала. In the General case, the tank 5 for introduced into the cell material can be selected from any number of containers, such as pipes. The reservoir 5 for the introduced material may preferably have an inner surface selected so as to establish an internal space with a relative elongation sufficient to ensure uniform injection of the material introduced into the cell and to ensure minimal retardation, i.e. one that adheres or wets the inner walls of the reservoir 5 for the material being introduced into the cell. Examples of the reservoir 5 for the introduced material are capable of holding from 0.005 ml to 100 ml of the introduced material.

В общем случае, резервуар 5 для внедряемого материала изготавливают из материала, физически достаточно прочного для загрузки внедряемого материала из источника 4 внедряемого материала и/или газа из источника газа под давлением 3 без физических деформаций. В предпочтительном варианте резервуар 5 для внедряемого в клетку материала может быть изготовлен из материала, способного выдержать давление по меньшей мере 1000 фт/кв.дм (70,3 кг/см²) при физиологических температурах. Примером материала, который используют при изготовлении резервуара 5, является нержавеющая сталь.In the General case, the reservoir 5 for the introduced material is made of material physically strong enough to load the introduced material from the source 4 of the introduced material and / or gas from a gas source under pressure 3 without physical deformation. In a preferred embodiment, the reservoir 5 for the material introduced into the cell may be made of a material capable of withstanding a pressure of at least 1000 ft / sq. Dm (70.3 kg / cm ² ) at physiological temperatures. An example of the material used in the manufacture of the tank 5 is stainless steel.

Как можно видеть на фиг. 2, температуру внутри резервуара 5 можно регулировать при помощи средства для регулирования температуры 11. Примеры средств для регулирования температуры включают термопары, установленные в нагревательном блоке, окружающем резервуар 5 для внедряемого материала. As can be seen in FIG. 2, the temperature inside the tank 5 can be controlled by means of a temperature control 11. Examples of temperature control means include thermocouples installed in a heating unit surrounding the material storage tank 5.

Хотя схемы, показанные на фиг. 1 и 2, демонстрируют использование только одного источника внедряемого материала, принципы, изложенные при описании работы устройства 1, могут быть легко применены к случаю использования двух или более типов внедряемого материала из нескольких источников внедряемого материала. Although the circuits shown in FIG. 1 and 2, demonstrate the use of only one source of embedded material, the principles set forth in the description of the operation of the device 1 can be easily applied to the case of using two or more types of embedded material from several sources of embedded material.

В общем случае объем внедряемого материала можно регулировать при помощи любого средства, которое обеспечивает измеримые, репродуцируемые пробы внедряемого материала. Если используют трубку или что-либо подобное, то трубка, способная удерживать один объем, может быть заменена на другую трубку, способную удерживать другой объем. Однако вышеупомянутое устройство не ограничивается таким образом. Например, датчик уровня (не показан) может быть установлен в любом месте, эффективном с точки зрения обеспечения точных репродуцируемых измерений объема внедряемого в клетки материала в резервуаре 5 для внедряемого материала. In the general case, the volume of introduced material can be controlled by any means that provides measurable, reproducible samples of the introduced material. If a tube or the like is used, a tube capable of holding one volume can be replaced by another tube capable of holding another volume. However, the above device is not limited in this way. For example, a level sensor (not shown) can be installed anywhere effective in providing accurate reproducible measurements of the volume of material introduced into the cells in the material reservoir 5.

Как можно видеть на фиг. 1, источник газа под давлением 3 может содержать средство 12 подачи газа и, необязательно, средство 13 регулирования потока газа. Источник газа под давлением 3 выбирают так, чтобы обеспечить заранее определенные объемы газа в резервуаре 5 для внедряемого в клетку материала. Давление газа зависит от типа используемого газа и объема газа. В общем случае, давление газа варьирует от 15 атмосфер (атм) до 150 атм. As can be seen in FIG. 1, the gas source under pressure 3 may include gas supply means 12 and, optionally, gas flow control means 13. The gas source under pressure 3 is selected so as to provide predetermined volumes of gas in the reservoir 5 for the material introduced into the cell. Gas pressure depends on the type of gas used and the volume of gas. In general, gas pressure varies from 15 atmospheres (atm) to 150 atm.

Источником газа под давлением 3 можно управлять при помощи любого средства, которое способно обеспечить подачу газа под необходимым давлением в резервуар 5 для внедряемого материала. Это средство для регулирования газа может функционировать автоматически или с клавиатуры. The gas source under pressure 3 can be controlled by any means that is capable of supplying gas under the necessary pressure to the reservoir 5 for the introduced material. This gas control means can function automatically or from the keyboard.

В предпочтительном варианте источник газа под давлением 3 должен быть способен непрерывно подавать объемы газа в резервуар 5 для внедряемого материала, чтобы позволить относительно быстро перезарядить устройство 1. In a preferred embodiment, the gas source under pressure 3 should be able to continuously supply volumes of gas to the reservoir 5 for the introduced material, in order to allow relatively quick recharging of the device 1.

Примером источника газа под давлением 3, кроме того, является источник, приведенный на фиг. 3. Как показано на фиг. 3, источник газа под давлением 3 содержит средство 12 подачи газа, выполненное в виде емкости для подачи газа, имеющей выходное отверстие; трубопровод 14 для подачи газа, имеющий входное отверстие и выходное отверстие; и средство 13 для регулирования потока газа в форме газового клапана 15 и резервуара для газа 16, имеющего входное отверстие и выходное отверстие. An example of a gas source under pressure 3, in addition, is the source shown in FIG. 3. As shown in FIG. 3, the gas source under pressure 3 comprises a gas supply means 12 made in the form of a gas supply container having an outlet; a gas supply conduit 14 having an inlet and an outlet; and means 13 for regulating the gas flow in the form of a gas valve 15 and a gas reservoir 16 having an inlet and an outlet.

Выходное отверстие резервуара 12 для подачи газа находится в пневматической связи с входным отверстием трубопровода для подачи газа 14. Выходное отверстие трубопровода для подачи газа 14 находится в свою очередь в селективной пневматической связи через газовый клапан 15 с входным отверстием резервуара для газа 16. The outlet of the gas supply tank 12 is in pneumatic communication with the inlet of the gas supply pipe 14. The outlet of the gas supply pipe 14 is in turn in selective pneumatic communication through the gas valve 15 with the inlet of the gas tank 16.

Примеры средств 12 для подачи газа включают газовые цилиндры и емкости. Examples of gas supply means 12 include gas cylinders and containers.

Резервуар для газа 16 может быть выбран из произвольного числа контейнеров, таких как трубы. Примеры резервуаров для газа должны быть способны удерживать от 1 мл до 100 мл газа. The gas tank 16 may be selected from an arbitrary number of containers, such as pipes. Examples of gas tanks should be capable of holding between 1 ml and 100 ml of gas.

В общем случае, резервуар для газа 16 может быть изготовлен из физически прочного материала, чтобы иметь возможность загрузить газом из источника газа под давлением 3 без его физической деформации. В предпочтительном варианте, резервуар для газа 16 должен быть способным выдерживать давление газа до 150 атм. Примеры материалов для использования при изготовлении трубопровода для подачи газа включают нержавеющую сталь. In the General case, the gas tank 16 may be made of physically strong material to be able to load gas from a gas source under pressure 3 without physical deformation. In a preferred embodiment, the gas tank 16 should be capable of withstanding a gas pressure of up to 150 atm. Examples of materials for use in the manufacture of a gas supply pipe include stainless steel.

Газ необходимо выбрать таким образом, чтобы он имел достаточно низкий молекулярный вес, чтобы допустить достаточно быстрое расширение для достижения необходимых скоростей частиц. В общем случае, молекулярный вес газа должен изменяться в области от 2 до 40 единиц атомных масс (еам). Примеры таких газов включают гелий, водород и воздух. The gas must be selected so that it has a sufficiently low molecular weight to allow expansion sufficiently fast to achieve the required particle velocities. In the General case, the molecular weight of the gas should vary in the range from 2 to 40 units of atomic masses (eam). Examples of such gases include helium, hydrogen, and air.

Как утверждалось выше со ссылкой на фиг. 1 и 2, устройство в предпочтительном варианте содержит источник внедряемого в клетку материала в селективной жидкостной связи с резервуаром для внедряемого материала 5. Если источник 4 внедряемого материала отсутствует, то резервуар 5 для внедряемого материала может быть заполнен вручную и затем установлена жидкостная связь с устройством. As stated above with reference to FIG. 1 and 2, the device preferably comprises a source of material introduced into the cell in selective fluid communication with the reservoir for the introduced material 5. If the source 4 of the introduced material is absent, then the reservoir 5 for the introduced material can be manually filled and then fluid communication with the device is established.

Как показано на фиг. 1 и как, в частности, показано на фиг 4 и 5, источник 4 внедряемого материала выбирают таким образом, чтобы он был способен обеспечить заранее определенные объемы внедряемого материала в резервуаре 5 для внедряемого материала. As shown in FIG. 1 and as, in particular, shown in FIGS. 4 and 5, the source 4 of introduced material is selected so as to be able to provide predetermined volumes of introduced material in the introduced material tank 5.

В предпочтительном варианте источник 4 внедряемого материала должен быть способным непрерывно обеспечивать выбранные объемы внедряемого материала в резервуар 5 для внедряемого материала, чтобы иметь возможность относительно быстро повторно запускать устройство 1. Источник 4 внедряемого в клетку материала содержит средство 17 для подачи внедряемого материала. Примеры средств 17 для подачи внедряемого материала включают шприцы, емкости, трубо- или другие проводы. In a preferred embodiment, the source of introduced material 4 should be able to continuously provide selected volumes of introduced material in the reservoir 5 for introduced material in order to be able to relatively quickly restart the device 1. The source 4 of introduced into the cell material contains means 17 for feeding the introduced material. Examples of means 17 for feeding the injectable material include syringes, containers, tubing or other wires.

В общем случае, средство 17 для подачи внедряемого материала может быть изготовлено из материала, который способен к стерилизации. Примеры таких материалов включают нержавеющую сталь и политетрафторэтилен. In the General case, the means 17 for feeding the introduced material can be made of a material that is capable of sterilization. Examples of such materials include stainless steel and polytetrafluoroethylene.

В зависимости от наделенной регулирующей способности средства для подачи внедряемого материала, это устройство может содержать средство, способное регулировать поток внедряемого материала, т.е. средство 18 для регулирования внедряемого материала. Средство 18 для регулирования внедряемого материала может находиться в оперативной комбинации со средством для подачи внедряемого материала 17, чтобы иметь возможность обеспечить выбранный объем внедряемого материала в резервуаре 5 для внедряемого материала. Примеры средств 18 регулирования внедряемого материала включают клапаны и насосы. Depending on the endowed regulatory ability of the means for supplying the introduced material, this device may comprise means capable of regulating the flow of the introduced material, i.e. means 18 for regulating the introduced material. The means 18 for regulating the introduced material may be in operative combination with the means for feeding the introduced material 17 in order to be able to provide a selected volume of introduced material in the reservoir 5 for introduced material. Examples of material control means 18 include valves and pumps.

Как было указано ранее, примеры вариантов осуществления источника 4 внедряемого материала приведены на фиг. 4 и 5. Эти варианты показывают источники 4 внедряемого в клетки материала, способные выдавать заданный объем внедряемого материала. As previously indicated, examples of embodiments of the source 4 of injectable material are shown in FIG. 4 and 5. These options show the sources 4 of the material introduced into the cells, capable of delivering a predetermined volume of the introduced material.

В соответствии с одним из вариантов осуществления, как это показано на фиг. 4, источник 4 внедряемого материала содержит средство 17 подачи внедряемого материала в форме шприца 17а, имеющего выходное отверстие, и трубопровод 19 для подачи внедряемого материала, имеющий входное и выходное отверстие. Выходное отверстие шприца 17а находится в селективной жидкостной связи с входным отверстием трубопровода 19 для подачи внедряемого материала. Выходное отверстие трубопровода 19 для подачи внедряемого материала находится в свою очередь в жидкостной связи с входным отверстием многоцелевого клапана 2, ведущим к резервуару 5 для внедряемого материала. In accordance with one embodiment, as shown in FIG. 4, the source 4 of injectable material comprises means 17 for supplying the injectable material in the form of a syringe 17a having an outlet, and a pipe 19 for supplying the injectable material having an inlet and an outlet. The outlet of the syringe 17a is in selective fluid communication with the inlet of the conduit 19 for feeding the injectable material. The outlet of the pipe 19 for supplying the introduced material is in turn in fluid communication with the inlet of the multi-purpose valve 2 leading to the reservoir 5 for the introduced material.

В соответствии с еще одним вариантом выполнения, как это можно видеть на фиг. 5, источник внедряемого в клетку материала содержит средство 17 для подачи внедряемого материала в форме емкости 17б для подачи внедряемого материала, имеющей выходное отверстие, средство 18 для регулирования внедряемого материала в форме клапана для внедряемого материала 18а, и трубопровод 19 для подачи внедряемого материала, имеющий входное и выходное отверстие. Выходное отверстие из емкости 17б находится в селективной жидкостной связи через клапан 18 для внедряемого материала с входным отверстие трубопровода 19 для подачи внедряемого материала. Выходное отверстие трубопровода 19 для подачи внедряемого материала, в свою очередь, находится в связи с входным отверстием клапана 2, ведущим к резервуару 5 для внедряемого материала. According to another embodiment, as can be seen in FIG. 5, the source of material introduced into the cell contains means 17 for supplying the introduced material in the form of a container 17b for supplying the introduced material having an outlet, means 18 for regulating the introduced material in the form of a valve for the introduced material 18a, and a pipe 19 for supplying the introduced material having inlet and outlet. The outlet from the tank 17b is in selective fluid communication through the valve 18 for the introduced material with the inlet of the pipe 19 for supplying the introduced material. The outlet of the pipe 19 for supplying the introduced material, in turn, is in connection with the inlet of the valve 2 leading to the reservoir 5 for the introduced material.

В зависимости от времени, в течение которого внедряемый материал выдерживают в емкости 17б подачи внедряемого материала, емкость 17б для подачи внедряемого материала может находиться в оперативной комбинации со средством 11 для регулирования температуры, как это показано в альтернативном осуществлении на фиг.5, чтобы поддержать внедряемый материал при заданной температуре. Примеры средств регулирования температуры включают термопары 11, вставленные в блок нагревания, окружающий емкость 17б для подачи внедряемого материала. Depending on the time during which the introduced material is held in the introduced material supply tank 17b, the introduced material supply tank 17b may be in operative combination with a temperature control means 11, as shown in the alternative embodiment of FIG. 5, in order to support the introduced material at a given temperature. Examples of temperature control means include thermocouples 11 inserted into a heating unit surrounding a container 17b for introducing introduced material.

В зависимости от относительной вязкости несущей среды, емкость 17б для подачи внедряемого материала может находиться в оперативной комбинации со средством 20 для перемешивания, чтобы поддержать частицы в суспензии в несущей среде. Примеры средств 20 для перемешивания включают насосы типа шприца с возвратно-поступательным ходом поршня, пластину для магнитного перемешивания, клапанно-насосную конструкцию, создающую изменяющиеся направления потока внутри емкости 17б для подачи внедряемой жидкости. В предпочтительном варианте, средство 20 для перемешивания выбирают таким образом, чтобы обеспечить изменяющиеся направления потока внутри резервуара 5 для внедряемого материала, например, насос типа шприца с возвратно-поступательным ходом поршня. Depending on the relative viscosity of the carrier medium, the container 17b for introducing the introduced material may be in operative combination with the means 20 for mixing, in order to maintain the particles in suspension in the carrier medium. Examples of stirring means 20 include reciprocating syringe type pumps, a magnetic stirring plate, a valve-pump structure that creates varying flow directions within the introduced fluid supply tank 17b. In a preferred embodiment, the stirring means 20 is selected in such a way as to provide varying flow directions within the material injection tank 5, for example, a reciprocating syringe type pump.

Как можно видеть на фиг.1 и 2, выходное отверстие резервуара 5 для внедряемого материала может находиться в селективной связи через многоцелевой клапан 2 с входным отверстие средства 7 для извлечения. As can be seen in figures 1 and 2, the outlet of the reservoir 5 for the introduced material can be in selective communication through a multi-purpose valve 2 with the inlet of the means 7 for extraction.

Средство 7 для извлечения дает возможность сбить избыточный внедряемый материал из резервуара 5. Средство 7 включает любое средство для отбора внедряемого материала. Предпочтительное средство 7 представляет собой закрываемую трубку, из которой можно извлечь материал. Такая конструкция позволяет, кроме того, создать открытую систему, в которой средство 7 для перемешивания, например, шприц-насос с возвратно-поступательным ходом поршня может быть селективно подключен таким образом, чтобы обеспечить изменяющиеся направления потока внутри резервуара 5 для внедряемого материала. The extraction means 7 enables the removal of excess introduced material from the reservoir 5. The means 7 includes any means for selecting the introduced material. A preferred means 7 is a lockable tube from which material can be removed. This design allows, in addition, to create an open system in which the means 7 for mixing, for example, a syringe pump with a reciprocating stroke can be selectively connected so as to provide changing flow directions inside the tank 5 for the introduced material.

Средство 7 для извлечения может быть изготовлено из любого материала, который способен удерживать и не наносить какого-либо ущерба внедряемому материалу. В предпочтительном варианте, чтобы избежать значительного перелива соответствующего внедряемого материала из резервуара для внедряемого материала, средство 7 для извлечения может быть изготовлено из прозрачного материала, чтобы иметь возможность легко измерить содержание в нем материала. Примеры материалов, способных обеспечить визуальную проверку перелива, включают политетрафторэтилен (ПТФЭ). The extraction means 7 can be made of any material that is capable of holding and not causing any damage to the introduced material. In a preferred embodiment, in order to avoid significant overflow of the respective introduced material from the reservoir for the introduced material, the extraction means 7 may be made of a transparent material in order to be able to easily measure the material content therein. Examples of materials capable of providing a visual check of the overflow include polytetrafluoroethylene (PTFE).

Средства доставки
Как можно видать на фиг.1, 2 и 9, выходное отверстие резервуара 5 для внедряемого материала может находиться в селективной связи через многоцелевой клапан 2 с входным отверстие средства доставки 6.Delivery vehicles
As can be seen in figures 1, 2 and 9, the outlet of the reservoir 5 for the introduced material can be in selective communication through a multi-purpose valve 2 with the inlet of the delivery means 6.

Средство для доставки 6, в частности, показанное на фиг.6 и 7, обеспечивает относительно точное "наведение на цель" внедряемого в клетку материала. Средство 6 может содержать средство 21 для макроприцеливания и/или средство 22 для микроприцеливания. Ввиду сопротивления внедряемого материала, поступающего из резервуара 5 для внедряемого материала (показано на фиг.1 и 2), в предпочтительном варианте, если средство 6 для высвобождения содержит средство микроприцеливания 22, оно также содержит средство для макроприцеливания. The means for delivery 6, in particular, shown in Fig.6 and 7, provides a relatively accurate "targeting" embedded in the cell material. The tool 6 may comprise a macro-targeting means 21 and / or a micro-targeting means 22. In view of the resistance of the introduced material coming from the introduced material reservoir 5 (shown in FIGS. 1 and 2), in the preferred embodiment, if the release means 6 comprises micro-targeting means 22, it also contains macro-targeting means.

Как можно видеть на фиг.6, средство для макроприцеливания 21, в свою очередь, находится в жидкостной связи со средством для микроприцеливания 22. As can be seen in FIG. 6, the macro-targeting means 21, in turn, is in fluid communication with the micro-targeting means 22.

В общем случае, средство для макроприцеливания 21 выбирают таким образом, чтобы оно имело внутреннюю поверхность, которая определяет канал с длиной, геометрией и диаметром, достаточными для того, чтобы предотвратить существенное снижение ускорения внедряемого материала из-за газа, обходящего внедряемый материал. В предпочтительном варианте средством для макроприцеливания 21 является трубка, выбранная таким образом, чтобы она имела внутреннюю поверхность, определяющую в общем случае цилиндрический канал с внутренним диаметром в области от 500 микрон до 2 000 микрон, в предпочтительном варианте от 750 до примерно 1 250 микрон. In general, the macro targeting means 21 is selected so as to have an inner surface that defines a channel with a length, geometry, and diameter sufficient to prevent a substantial reduction in acceleration of the introduced material due to gas bypassing the introduced material. In a preferred embodiment, the macro-targeting means 21 is a tube selected so that it has an inner surface defining a generally cylindrical channel with an inner diameter in the range of 500 microns to 2,000 microns, preferably 750 to about 1,250 microns.

Средство для макроприцеливания 21 может быть изготовлено из любого материала, способного поддерживать свою форму при условиях доставки. Примеры материалов включают стекло, пластик и нержавеющую сталь. The macro-targeting means 21 may be made of any material capable of maintaining its shape under delivery conditions. Examples of materials include glass, plastic and stainless steel.

Если средство доставки состоит только из средства для макроприцеливания 21, оно может быть использовано для ускорения внедряемого материала в так называемом режиме стрельбы из "дробовика". Если средство для доставки содержит средство для микроприцеливания 22, то оно обеспечивает относительно более точное прицеливание для внедряемого материала. If the delivery vehicle consists only of macro targeting means 21, it can be used to accelerate the material being introduced in the so-called shotgun mode. If the delivery means comprises micro-aiming means 22, then it provides a relatively more accurate aiming for the implanted material.

В соответствии с первым вариантом осуществления, как это можно видеть на фиг. 6, средство для микроприцеливания 22 содержит пипетку 23, которая находится в жидкостной связи со средством для макроприцеливания 21, микроинструмент 24 расположен в захвате 25, жестко соединенном с подвижным средством 26 микроманипулятора 27 с тремя степенями свободы. Микроманипулятор 27 может содержать ручку управления (не показана), которая регулирует положение пипетки 23. According to a first embodiment, as can be seen in FIG. 6, the micro-targeting means 22 comprises a pipette 23, which is in fluid communication with the macro-targeting means 21, the micro-tool 24 is located in the gripper 25, which is rigidly connected to the movable means 26 of the micromanipulator 27 with three degrees of freedom. The micromanipulator 27 may include a control knob (not shown) that adjusts the position of the pipette 23.

Пипетку 23 необходимо выбирать таким образом, чтобы она имела внутренний диаметр с просветом достаточного размера для прохода внедряемого материала. Внутренний диаметр пипетки в общем случае изменяется от примерно 10 микрон до примерно 500 микрон, в предпочтительном варианте от примерно 100 до примерно 250 микрон. Пипетки получают известным способом из капиллярной трубки в соответствии с хорошо известными приемами (смотри, в общем случае, Graessman и др. (1980), Methods in Enzymology, 65: 816 825). The pipette 23 must be selected so that it has an inner diameter with a clearance of sufficient size for the passage of the introduced material. The inner diameter of the pipette generally ranges from about 10 microns to about 500 microns, preferably from about 100 to about 250 microns. Pipettes are prepared in a known manner from a capillary tube in accordance with well-known techniques (see, in general, Graessman et al. (1980), Methods in Enzymology 65: 816 825).

Примеры средств 22 для микроприцеливания предпочтительно сконструировать из известных устройств для микроинъекций, которые после изучения настоящего описания могут быть очень легко модифицированы, чтобы получить средство для микроприцеливания, необходимое специалисту. Examples of micro-targeting means 22 are preferably constructed from known microinjection devices, which, after studying the present description, can be very easily modified to obtain the micro-targeting tool needed by one skilled in the art.

Известные средства и приемы для микроинъекций изложены в следующих публикациях: Патент N 4743548; Jamamoto etal. (1982), Exp. Cell Res. 142: 79-84, Purres (1981), Methods for Intracellular Recording Jonopnoresis; Ocho et al. (1981), Acta Med, Okayama 35: 381-384, Lawrence and Davies (1985), Plant Cell Rep. 4:33-35, Steinbiss, et al. (1984), In: Proceedings of the 1984 Wye International Symposium, Experimental Manipulation of Ovule Tissue: Theur Micromanipulation, Tissue Culture and Physioljgy; Steinbiss and Stabel (1983), Protoplasma, 116: 223-227, Morikawa and Yamade (1981), Plant Cell Physiol, 26: 229-236, Grassman, et al. (1980) In: Methods in Enzymology, 65: 816-825, and Zin and Ruddle (1981), Exp. Cell Res. 134: 485-488. Known tools and techniques for microinjection are described in the following publications: Patent N 4743548; Jamamoto etal. (1982), Exp. Cell Res. 142: 79-84, Purres (1981), Methods for Intracellular Recording Jonopnoresis; Ocho et al. (1981), Acta Med, Okayama 35: 381-384, Lawrence and Davies (1985), Plant Cell Rep. 4: 33-35, Steinbiss, et al. (1984), In: Proceedings of the 1984 Wye International Symposium, Experimental Manipulation of Ovule Tissue: Theur Micromanipulation, Tissue Culture and Physioljgy; Steinbiss and Stabel (1983), Protoplasma, 116: 223-227, Morikawa and Yamade (1981), Plant Cell Physiol, 26: 229-236, Grassman, et al. (1980) In: Methods in Enzymology, 65: 816-825, and Zin and Ruddle (1981), Exp. Cell Res. 134: 485-488.

Кроме того, несмотря на возможность визуального наблюдения, средство доставки в предпочтительном варианте содержит средство для наблюдения 28. Средство для наблюдения должно обеспечивать увеличение, эффективное с точки зрения фокусировки на субстанцию-мишень, в предпочтительном варианте от 10X до 200X. Примеры средств наблюдений включает разборные микроскопы и бороскопы. In addition, despite the possibility of visual observation, the delivery means preferably comprises means for observing 28. The means for observing should provide an increase effective from the point of view of focusing on the target substance, in the preferred embodiment, from 10X to 200X. Examples of observation tools include collapsible microscopes and borescopes.

В соответствии со вторым вариантом осуществления, как это показано на фиг.7, средство для прицеливания 22 содержит пипетку 23 в оперативной комбинации со средством наблюдения 28. According to a second embodiment, as shown in FIG. 7, the aiming means 22 comprises a pipette 23 in operative combination with an observation means 28.

Как можно видеть на фиг.1, 6, 7, 9, выходное отверстие средства доставки открыто со стороны зоны выталкивания 29, в которую может быть помещена субстанция-мишень. As can be seen in FIGS. 1, 6, 7, 9, the outlet of the delivery means is open from the side of the ejection zone 29 into which the target substance can be placed.

Субстанция-мишень может быть помещена на соответствующую платформу. Например, можно использовать чашку Петри 30, которая содержит субстанцию-мишень. Чтобы способствовать прицеливанию средства доставки 21, субстанция-мишень может быть в предпочтительном варианте помещена на площадку 31, сдвигающуюся по плоскости X Y. The target substance can be placed on an appropriate platform. For example, you can use a Petri dish 30, which contains the target substance. In order to facilitate aiming of the delivery vehicle 21, the target substance may preferably be placed on a platform 31 moving along the X Y plane.

В предпочтительном варианте зону выталкивания 29 регулируют извне. В общем случае, зону выталкивания можно ограничить камерой. In a preferred embodiment, the expulsion zone 29 is controlled externally. In general, the ejection zone can be limited by a camera.

Например, в зоне выталкивания может быть создан вакуум. Степень вакуума должна быть достаточной для того, чтобы избежать снижения скорости частиц из-за торможения, вызванного сопротивлением воздуха, и предотвратить отскакивание внедряемого материала. В предпочтительном варианте степень вакуума в зоне выталкивания может изменяться от 0 до 0,5 атм. For example, a vacuum can be created in the expulsion zone. The degree of vacuum should be sufficient to avoid a decrease in particle velocity due to drag caused by air resistance and to prevent the implant from bouncing. In a preferred embodiment, the degree of vacuum in the ejection zone may vary from 0 to 0.5 atm.

Соответствующая, с регулируемыми условиями, камера раскрыта в каталоге "Fisher 88", Laboratory Experiment Catalog of Fisher Scientific Inc. Pittsburgh, PA. A suitable, controlled environment camera is disclosed in the Fisher 88 catalog, Laboratory Experiment Catalog of Fisher Scientific Inc. Pittsburgh, PA.

Средство для измерения скорости
В соответствии с еще одним вариантом выполнения, устройство 1 содержит средство для измерения скорости 32, как это можно видеть на фиг. 1, 8, 9. В качестве средства для измерения скорости внедряемого материала пригодно для использования любое средство, способное фиксировать скорость материала.Speed measuring tool
According to another embodiment, device 1 comprises means for measuring speed 32, as can be seen in FIG. 1, 8, 9. As a means for measuring the speed of the introduced material, any means capable of fixing the speed of the material is suitable for use.

В общем случае, средство для измерения скорости может быть размещено в любом месте, из которого можно воспроизводимо измерять скорость ускоряемого материала. В предпочтительном варианте средство для измерения скорости 32 может быть помещено на средстве доставки 6. In the General case, the means for measuring speed can be placed anywhere from which it is possible to reproducibly measure the speed of the accelerated material. In a preferred embodiment, the means for measuring speed 32 may be placed on the means of delivery 6.

Как можно видеть на фиг. 8, одно из средств для измерения скорости 32 содержит первый датчик скорости 33 и второй датчик скорости 34, вышеупомянутые датчики установлены в последовательных точках вдоль средства доставки 6. As can be seen in FIG. 8, one of the means for measuring speed 32 comprises a first speed sensor 33 and a second speed sensor 34, the aforementioned sensors are installed at successive points along the delivery means 6.

Первый датчик скорости 33 содержит излучающее средство 35 и чувствительный элемент 36. Второй датчик скорости 34 содержит излучающее средство 37 и чувствительный элемент 38. The first speed sensor 33 contains a radiating means 35 and a sensing element 36. The second speed sensor 34 contains a radiating means 37 and a sensing element 38.

Примеры средств излучения 35 и 37 включают инфракрасные эмиттеры, такие как диоды-эмиттеры инфракрасного света (ДЭС) или другие аналогичные источники света. Если схема включения излучателя содержит инфракрасные излучатели, средство доставки в предпочтительном варианте изготавливают из прозрачного материала, такого как стекло или прозрачный пластик. Examples of radiation means 35 and 37 include infrared emitters, such as infrared light emitting diodes (DELs) or other similar light sources. If the emitter switching circuit includes infrared emitters, the delivery means is preferably made of a transparent material, such as glass or transparent plastic.

Примеры чувствительных элементов 36 и 38 включают фотодиоды, фототранзисторы или фотоэлектрические ячейки. Examples of sensors 36 and 38 include photodiodes, phototransistors, or photovoltaic cells.

В общем случае, первый и второй чувствительные элементы могут находиться в оперативной связи с многоцелевым клапаном 2 через электрическую цепь. In the General case, the first and second sensing elements can be in operational communication with the multi-purpose valve 2 through an electric circuit.

В общем случае, цепь должна обеспечивать измерение времени полета (как можно видеть в разделе "Примеры, см. ниже, и фиг. 12 между первым и вторым излучателями). В предпочтительном варианте эта цепь может обеспечивать "последовательное измерение времени", чтобы гарантировать, что все части средства для измерения скорости 32 синхронизированы с ускорением внедряемого материала. После того как электрическая цепь уже обеспечивает установку времени, эта электрическая цепь должна обеспечивать оперативную связь между средством для измерения скорости 32 и многоцелевым клапаном 2, при этом предварительно выбранный временной интервал подачи электроэнергии на многоцелевой клапан 2 обеспечивает связь между источником газа под давлением и резервуаром 5 для внедряемого материала. In general, the circuit should provide a measurement of flight time (as can be seen in the section “Examples, see below, and Fig. 12 between the first and second emitters). In a preferred embodiment, this circuit can provide a“ sequential measurement of time ”to ensure that all parts of the means for measuring speed 32 are synchronized with the acceleration of the introduced material.After the electric circuit already provides the time setting, this electric circuit should provide prompt communication between the means for measuring tee 32 and multipurpose valve 2, wherein the preselected time interval of supplying electric power to the multipurpose valve 2 allows communication between the source of pressurized gas and the reservoir 5 to the introduced material.

Любой специалист в этой области техники может создать любое число электросхем, удовлетворяющих требованиям, перечисленным выше. Примеры электрических цепей для средств фиксации скорости, показанные на фиг. 10 и 11, обсуждаются ниже. Any person skilled in the art can create any number of electrical circuits that satisfy the requirements listed above. Examples of electrical circuits for speed locks shown in FIG. 10 and 11 are discussed below.

Синхронизирующие средства
В соответствии с еще одним вариантом выполнения, представленным на фиг. 9, устройство 1 может находиться в оперативной комбинации со средством, эффективным с точки зрения синхронизации по меньшей мере некоторых элементов для загрузки и ускорения внедряемого материала. Синхронизация по меньшей мере некоторых элементов устройства служит для того, чтобы уменьшить количество стадий, которое оператор должен выполнить, последовательно снижая время, необходимое между запусками, и увеличивая производительность.Synchronization Tools
In accordance with yet another embodiment of FIG. 9, the device 1 may be in operative combination with means effective in terms of synchronizing at least some elements for loading and accelerating the introduced material. Synchronization of at least some elements of the device serves to reduce the number of stages that the operator must perform, sequentially reducing the time required between starts, and increasing productivity.

Пример выполнения средства синхронизации приведен на фиг. 7. Синхронизирующее средство 39 содержит компьютер 40, находящийся в оперативной комбинации с устройством 1. An example of execution of the synchronization means is shown in FIG. 7. The synchronizing means 39 includes a computer 40, which is in operational combination with the device 1.

Компьютер 40 находится в связи через линию 41 с ящиком 42, содержащим серию датчиков и проводников (43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 и 51). Проводник 43 может быть связан со средством регулирования температуры 11, при этом осуществляют автоматическое регулирование температуры в емкости для подачи внедряемого материала 17б. The computer 40 is in communication through line 41 with a box 42 containing a series of sensors and conductors (43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, and 51). The conductor 43 may be associated with a means of controlling the temperature 11, while automatically regulating the temperature in the tank for supplying the introduced material 17b.

Второй проводник 44 может находиться в принимающей и выдающей команды связи со средством для перемешивания 20, при этом внедряемый материал перемешивают с необходимой скоростью. The second conductor 44 may be in the receiving and issuing communication commands with the means for mixing 20, while the introduced material is mixed with the necessary speed.

Третий проводник 45 находится в выдающей команды связи со средством для регулирования внедряемого материала 18. Этот проводник поддерживает источник внедряемого материала в открытом или замкнутом положении. The third conductor 45 is in an issuing communication command with the means for regulating the introduced material 18. This conductor maintains the source of introduced material in an open or closed position.

Четвертый проводник 46 находится в принимающей сигналы связи с третьим проводником 45 и в выдающей команды связи с многоцелевым подклапаном 8. Если источник внедряемого материала поддерживают в открытом состоянии, то многоцелевой клапан 2 обеспечивает селективную жидкостную связь между источником внедряемого материала 4 и резервуаром 5 для внедряемого материала, и селективную жидкостную связь между резервуаром 5 для внедряемого материала и средством извлечения 7. The fourth conductor 46 is in the receiving signal of communication with the third conductor 45 and in the issuing command of communication with the multi-purpose sub-valve 8. If the source of the introduced material is maintained open, then the multi-purpose valve 2 provides selective fluid communication between the source of the introduced material 4 and the reservoir 5 for the introduced material and selective fluid communication between the reservoir 5 for the introduced material and the extraction means 7.

Пятый проводник 47 находится в принимающей и выдающей команды связи со средством для регулирования температуры 52, с помощью которого регулируют температуру в резервуаре 5 для внедряемого материала. The fifth conductor 47 is in the receiving and issuing communication commands with the means for regulating the temperature 52, with which regulate the temperature in the tank 5 for the introduced material.

Шестой проводник 48 находится в принимающей сигналы связи с четвертым проводником 46 и выдающей команды связи со средством для измерения скорости 32. Если выбранный объем внедряемого в клетку материала содержится в резервуаре 5 для внедряемого материала, начинается временной цикл "стрельбы" из устройства 1. The sixth conductor 48 is in the receiving signal of communication with the fourth conductor 46 and issuing communication commands with means for measuring speed 32. If the selected volume of material introduced into the cell is contained in the reservoir 5 for introduced material, the time cycle of "firing" from the device 1 begins.

Седьмой проводник 49 находится в принимающей сигналы связи с шестым проводником 48 и газовым клапаном 15. Если гарантируется временной цикл для средства измерения скорости, средство для регулирования газа поддерживают в открытом состоянии. The seventh conductor 49 is in a signal receiving connection with the sixth conductor 48 and the gas valve 15. If a time cycle for the speed measuring means is guaranteed, the gas regulating means is kept open.

Восьмой проводник 50 находится в принимающей сигналы связи с седьмым проводником 49 и многоцелевым подклапаном 9. Если источник 12 газа под давлением находится в открытом положении, многоцелевой клапан 2 обеспечивает селективную пневматическую связь между источником газа под давлением 3 через резервуар 5 для внедряемого материала и средством подачи 6. The eighth conductor 50 is in a signal receiving connection with the seventh conductor 49 and the multi-purpose sub-valve 9. If the pressure source 12 is in the open position, the multi-purpose valve 2 provides selective pneumatic connection between the pressure source 3 through the introduced material reservoir 5 and the supply means 6.

Девятый проводник 51 находится в принимающей сигналы связи со средством для измерения скорости 32. После того, как выбранный объем газа под давлением "выпущен" в резервуар 5 для внедряемого материала и ускоренный объем внедряемого материала проходит устройство для измерения скорости 32, наблюдают скорость внедряемого в клетку материала. The ninth conductor 51 is in the receiving signal coupling with the means for measuring the speed 32. After the selected volume of gas under pressure is "released" into the reservoir 5 for the introduced material and the accelerated volume of the introduced material passes through the device for measuring the speed 32, the speed of the introduced into the cell is observed material.

В общем случае, синхронизирующим средством может быть любая система управления процессом, которая способна воспринимать данные, поступающие по различным проводникам от датчиков, и управлять устройством через различные управляющие проводники. Примеры синхронизирующих средств включают пульт микроконтроллера или систему сбора данных и управления процессом типа КАМИЛ^ТМ (Торговое наименование фирмы Доу Кемикэл Компани), производимую фирмой Доу Кемикэл Компани.In the General case, the synchronizing means can be any process control system, which is able to perceive data coming from different conductors from sensors, and to control the device through various control conductors. Examples of synchronization tools include a microcontroller console or a KAMIL ^TM type data acquisition and process control system (trade name of Dow Chemical Company) manufactured by Dow Chemical Company.

Работа устройства
Устройство, показанное на фиг. 1, работает следующим образом. Субстанцию-мишень селективно устанавливают в зоне выталкивания на заранее определенном расстоянии от средства доставки.Device operation
The device shown in FIG. 1, works as follows. The target substance is selectively set in the expulsion zone at a predetermined distance from the delivery vehicle.

Если внедряемый в клетку материал или субстанция-мишень включает клеточный биологический материал, то субстанция-мишень может быть селективно установлена на расстоянии, эффективном с точки зрения обеспечения контакта с внедряемым материалом, который не является гибельным для подавляющего числа клеточного биологического материала (хотя некоторые клетки могут погибать). If the target material or substance introduced into the cell includes cellular biological material, the target substance can be selectively installed at a distance effective from the point of view of contact with the introduced material, which is not fatal for the vast majority of cellular biological material (although some cells may die).

В общем случае, субстанция-мишень может быть помещена на расстоянии от 1 см до 100 см от выходного отверстия средства доставки. In general, the target substance can be placed at a distance of 1 cm to 100 cm from the outlet of the delivery vehicle.

Если средство доставки содержит только средство макроприцеливания, т.е. не содержит средства микроприцеливания, то субстанцию-мишень можно расположить на расстоянии от 5 см до 20 см от выходного отверстия средства доставки. Если средство доставки содержит средство микроприцеливания, то субстанция-мишень может быть помещена на расстоянии от 1 миллиметра (мм) до 100 см от выходного отверстия средства доставки. If the delivery vehicle contains only macro targeting means, i.e. does not contain means of micro-targeting, the target substance can be located at a distance of 5 cm to 20 cm from the outlet of the delivery vehicle. If the delivery device contains a micro-targeting agent, then the target substance can be placed at a distance of 1 millimeter (mm) to 100 cm from the outlet of the delivery device.

Устройство, как оно в общем случае представлено на фиг. 1 и в некоторых частных случаях изображено на некоторых других чертежах, может функционировать следующим образом. Как можно видеть на фиг. 1, 2 и 5, многоцелевой клапан 2 и средство 18 для регулирования внедряемого материала установлены так, чтобы обеспечить жидкостную связь между средствами 17 для подачи внедряемого материала и резервуаром 5 для внедряемого материала. Следовательно, у внедряемого в клетку материала имеется возможность проследовать из источника внедряемого материала в резервуар 5 для внедряемого материала. The device, as it is generally shown in FIG. 1 and in some special cases depicted in some other drawings, may function as follows. As can be seen in FIG. 1, 2 and 5, the multi-purpose valve 2 and the means 18 for regulating the introduced material are installed so as to provide fluid communication between the means 17 for supplying the introduced material and the reservoir 5 for the introduced material. Therefore, the material introduced into the cell has the opportunity to proceed from the source of the introduced material into the reservoir 5 for the introduced material.

Как можно видеть на фиг. 1 и 2, многоцелевой клапан 2 устанавливают, кроме того, с тем, чтобы обеспечить жидкостную связь между резервуаром 5 для внедряемого материала и средством извлечения 7. Любой объем внедряемого материала, избыточный относительно объема резервуара 5 для внедряемого материала, удаляют с помощью средства извлечения 7. As can be seen in FIG. 1 and 2, a multi-purpose valve 2 is installed, in addition, so as to provide fluid communication between the reservoir 5 for the introduced material and the extraction means 7. Any volume of introduced material that is excessive relative to the volume of the reservoir 5 for the introduced material is removed using the extraction means 7 .

Как можно видеть на фиг. 1, 2 и 3, многоцелевой клапан 2 и средство 15 для регулирования газа затем устанавливают таким образом, чтобы обеспечить пневматическую связь между средством 12 для подачи газа и резервуаром 5 для внедряемого материала. Следовательно, выбранный объем газа под давлением, достаточным для того, чтобы ускорить внедряемый материал до необходимой скорости, проходит из источника 3 газа под давлением в резервуар 5 для внедряемого в клетку материала. As can be seen in FIG. 1, 2 and 3, the multi-purpose valve 2 and the gas regulating means 15 are then installed so as to provide pneumatic communication between the gas supply means 12 and the reservoir 5 for the introduced material. Therefore, the selected volume of gas under pressure sufficient to accelerate the introduced material to the required speed passes from the gas source 3 under pressure into the reservoir 5 for the material introduced into the cell.

Многоцелевой клапан 2, кроме того, устанавливают таким образом, чтобы обеспечить пневматическую связь между резервуаром 5 для внедряемого материала и средством подачи 6. После того как газ загружается в резервуар 5 для внедряемого материала, он воздействует на внедряемый материал, который разгоняется в средстве подачи 6, если оно имеется. The multi-purpose valve 2 is also set so as to provide pneumatic communication between the reservoir 5 for the introduced material and the means of supply 6. After the gas is loaded into the reservoir 5 for the introduced material, it acts on the introduced material, which accelerates in the means of supply 6 if it is available.

Как можно видеть на фиг. 1 и 8, в средстве подачи 6 внедряемый материал будет проходить через первый датчик 33 и второй датчик 34. Первый и второй датчики 33 и 34 обеспечивают средство для измерения скорости внедряемого материала, давая возможность ускорить репродуцируемым образом внедряемый материал. As can be seen in FIG. 1 and 8, in the feeding means 6, the introduced material will pass through the first sensor 33 and the second sensor 34. The first and second sensors 33 and 34 provide a means for measuring the speed of the introduced material, making it possible to accelerate the introduced material in a reproducible manner.

В предпочтительном варианте внедряемый в клетку материал будет ускоряться до эффективной скорости. "Эффективная" скорость будет варьироваться в зависимости от поставленной цели. In a preferred embodiment, the material introduced into the cell will accelerate to an effective speed. The "effective" speed will vary depending on the goal.

В общем случае, для целей введения биологического материала в клеточный биологический материал скорость внедряемого материала должна быть эффективной, чтобы обеспечить проникновение биологического материала через клеточную мембрану и оболочку, если она присутствует. В предпочтительном варианте для таких систем внедряемый материал должен иметь скорость в точке выброса средства доставки от 200 миль/ч (322 км/ч) до 1200 миль/ч (1931 км/ч). In general, for the purpose of introducing biological material into cellular biological material, the rate of incorporation of the material must be effective to ensure that biological material penetrates through the cell membrane and membrane, if present. In a preferred embodiment, for such systems, the introduced material should have a speed at the point of ejection of the delivery vehicle from 200 mph (322 km / h) to 1200 mph (1931 km / h).

Как должно быть очевидным, скорость внедряемого материала зависит от многочисленных известных параметров. Такие параметры включают (но ими не исчерпывается полный список) длину и внутренний диаметр средства доставки, давление газа, свойства потока газа, свойства потока внедряемого материала, физические свойства внедряемого материала, расстояние между выходным отверстием средства доставки и субстанцией-мишенью, и объем и свойства потока среды, в которой культивируют субстанцию-мышень. As should be obvious, the speed of the introduced material depends on many known parameters. Such parameters include (but do not exhaust the full list) the length and inner diameter of the delivery vehicle, gas pressure, gas flow properties, flow properties of the introduced material, physical properties of the introduced material, the distance between the outlet of the delivery vehicle and the target substance, and the volume and properties the flow of the medium in which the muscle substance is cultured.

Характеристики потока внедряемого в клетку материала не являются особенно критичными. Так, внедряемый материал может быть ускорен поршневым потоком или турбулентным потоком. Под "поршневым потоком" подразумевается, что внедряемый материал течет как непрерывная масса, и зоны газа и внедряемого материала не могут существенно перемешиваться. Под "турбулентным потоком" подразумевается поток жидкости, в котором скорость в заданной точке изменяется беспорядочно как по величине, так и направлению, и, следовательно, имеет место некоторое перемешивание газа и внедряемого в клетку материала. Если имеет место турбулентный поток, внедряемый материал и газ будут взаимодействовать с образованием дисперсии и, следовательно, обеспечивать более широкий стебельчатый пучок внедряемого материала, когда он поступает из устройства. The flow characteristics of the material introduced into the cell are not particularly critical. So, the introduced material can be accelerated by the piston flow or turbulent flow. By "piston flow" is meant that the introduced material flows as a continuous mass, and the gas and introduced material zones cannot be substantially mixed. By "turbulent flow" is meant a fluid flow in which the velocity at a given point randomly changes both in magnitude and direction, and therefore there is some mixing of the gas and the material introduced into the cell. If there is a turbulent flow, the introduced material and gas will interact with the formation of dispersion and, therefore, provide a wider stalked bundle of the introduced material when it comes from the device.

Ввиду того, что газ под давлением контактирует непосредственно с внедряемым материалом и сам высвобождается в зону выталкивания, внедряемый материал, загруженный в резервуар, воспроизводимо поступает в зону выталкивания. Небольшая, но воспроизводимая доза внедряемого материала остается в средстве доставки. В основном, только внедряемый материал, который не попадает в зону выталкивания, является тем материалом, который прилипает или увлажняет внутренние стенки клапанов и средство для выпуска. Такой внедряемый материал именуется "висячим". Количество висячего материала будет зависеть и варьироваться от вязкости конкретного внедряемого материала. Due to the fact that gas under pressure is in direct contact with the introduced material and is released into the ejection zone itself, the introduced material loaded into the reservoir is reproduced in the ejection zone. A small but reproducible dose of implantable material remains in the delivery vehicle. Basically, only the implantable material that does not enter the ejection zone is that material that adheres or moistens the inner walls of the valves and the release means. Such embedded material is called “hanging.” The amount of hanging material will depend on and will vary with the viscosity of the particular material being introduced.

Скорость внедряемого в клетку материала измеряют, когда он проходит через средство для измерения скорости. Более конкретно, время полета между первым и вторым датчиками средства для измерения скорости, расположенного на средстве доставки, указывает на скорость внедряемого материала. The speed of the material introduced into the cell is measured when it passes through a means for measuring speed. More specifically, the flight time between the first and second sensors of the speed measuring means located on the delivery means indicates the speed of the introduced material.

Зная воспроизводимые измерения времени полета внедряемого материала, специалист в этой области техники может отрегулировать различные параметры, которые влияют на скорость внедряемого материала. Регулируя эти параметры, специалист в этой области техники может выбрать оптимальную скорость внедряемого материала. Knowing the reproducible measurements of the flight time of the introduced material, a specialist in this field of technology can adjust various parameters that affect the speed of the introduced material. By adjusting these parameters, a person skilled in the art can choose the optimal speed of the introduced material.

Необходимый объем внедряемого материала поступает из средства подачи 6 в зону выталкивания 29. The required amount of introduced material comes from the supply means 6 to the ejection zone 29.

Работа завершается при помощи селективной установки многоцелевого клапана 2 с тем, чтобы блокировать поток газа из резервуара 12 для газа в резервуар 5 для внедряемого материала. The work is completed by the selective installation of a multi-purpose valve 2 in order to block the gas flow from the gas tank 12 to the reservoir 5 for the introduced material.

Предыдущее обсуждение предназначено для того, чтобы представить общую идею критерия, который имеется в виду при функционировании устройства, являющегося предметом настоящего изобретения. После того, как выше приведено подробное описание, выбор условий функционирования для каждой используемой системы будет очевидным любому специалисту в этой области техники. The preceding discussion is intended to present a general idea of the criterion that is implicit in the operation of the device of the present invention. After the detailed description is given above, the selection of operating conditions for each system used will be apparent to any person skilled in the art.

Настоящее изобретение может быть использовано в различных областях биологических исследований, включая трансформацию растительных клеток, животных клеток и микроорганизмов. The present invention can be used in various fields of biological research, including the transformation of plant cells, animal cells and microorganisms.

Важным отличительным свойством настоящего изобретения является то, что оно позволяет осуществить обработку растительных клеток, оболочки которых являются интактными. Так как при этом может быть преодолено препятствие к регенерации полного растения из протопластов, упрощаются приемы генной инженерии для важных злаковых видов. An important distinguishing feature of the present invention is that it allows the processing of plant cells whose membranes are intact. Since this can overcome the obstacle to the regeneration of a complete plant from protoplasts, genetic engineering techniques for important cereal species are simplified.

Двумя важными мишенями в трансформации растительных зерновых линий являются пыльца или яйцеклетки, и куполы меристемы или клетки культуры ткани (из интактных растений и зародышей или из культуры ткани). Трансформации пыльцы, яйцеклетки или куполов меристемы представляют собой возможные приемы для сельскохозяйственных культур, которые размножаются половым методом, в то время как трансформации клеток культуры ткани или куполов меристемы являются возможными приемами для сельскохозяйственных культур, размножающихся неполовым путем. Каждый из этих подходов способен продуцировать трансформированные полные растения. Two important targets in the transformation of plant grain lines are pollen or egg cells, and domes of the meristem or tissue culture cells (from intact plants and embryos or from tissue culture). Transformations of pollen, egg, or meristem domes are possible techniques for sexually propagated crops, while transformations of tissue culture cells or meristem domes are possible receptors for non-sexually propagated crops. Each of these approaches is capable of producing transformed complete plants.

Клетки культуры ткани могут быть трансформированы, а затем культивированы с тем, чтобы получить соматические зародыши или куполы меристемы, которые, в свою очередь, регенерируются в трансформированные растения. Tissue culture cells can be transformed and then cultured in order to obtain somatic embryos or domes of the meristem, which, in turn, are regenerated into transformed plants.

Трансформация меристемы, например, может быть осуществлена при помощи "хирургического" вскрытия купола меристемы и бомбардировки ее несущими ДНК частицами, что позволяет трансформировать большое число клеток меристемы. Трансформированные меристемы способны вырасти в химерные побеги, из которых выбирают стабильно трансформированные секторы. The transformation of the meristem, for example, can be carried out by “surgical” opening the dome of the meristem and bombarding it with DNA-bearing particles, which allows the transformation of a large number of meristem cells. Transformed meristems can grow into chimeric shoots, from which stably transformed sectors are selected.

По поводу общего обсуждения процедуры, в соответствии с которой гены вставляют в сечения незрелого зародыша, которые затем используют для регенерации растений, смотри МакГабе и др. (1988), Bio/Technology, т. 6, стр. 923-926. For a general discussion of the procedure whereby genes are inserted into sections of an immature embryo, which are then used to regenerate plants, see McGabe et al. (1988), Bio / Technology, v. 6, pp. 923-926.

Наконец, трансформация хлоропласта в Chlamydomonas, одноклеточной водоросли, с использованием бомбардировки микроснарядами описана также Бойнтоном и др. (1986), Science, т. 240, стр. 1543-1547. Три мутанта гена atpb хлоропласта культуры Chlamydomonas reinhardtii были трансформированы ДНК хлоропласта, содержащей ген дикого типа. В трансформированных клетках восстанавливали фотосинтетическую способность. Finally, the transformation of the chloroplast into Chlamydomonas, a single-celled algae using micro-projectile bombardment, has also been described by Boynton et al. (1986), Science, Vol. 240, pp. 1543-1547. Three mutants of the chloroplast atpb gene of the Chlamydomonas reinhardtii culture were transformed with chloroplast DNA containing the wild-type gene. In transformed cells, photosynthetic ability was restored.

Генетическая трансформация небольших групп клеток в животной ткани возможна теперь с использованием способа и устройства настоящего изобретения. Такая терапия обеспечивает неинфекционный, но высокоэффективный механизм трансформации животных тканей на месте. По поводу общего обсуждения смотри Сэнфорд и др. см. выше. The genetic transformation of small groups of cells in animal tissue is now possible using the method and device of the present invention. Such therapy provides a non-infectious, but highly effective mechanism for the transformation of animal tissues in place. For a general discussion, see Sanford et al. See above.

Трансформация митохондрий у дрожжей при помощи бомбардировки "снарядами" описана Джонстоном и др. (1988), Science, т. 240, стр. 1538-1541. В этой работе описана трансформация невозвратного штамма дрожжей, у которых отсутствует дыхание ввиду того, что отсутствует митохондриальный ген 3 oxi. При помощи ДНК-последовательностей, которые могут восстановить пробел oxi 3, были получены трансформанты, компетентные с точки зрения дыхания, которые содержали гомологическую замену дефектного гена 3 oxi. The transformation of mitochondria in yeast using bombardment "shells" described Johnston and others (1988), Science, t. 240, pp. 1538-1541. This work describes the transformation of an irreversible strain of yeast that lacks respiration due to the absence of the mitochondrial 3 oxi gene. Using DNA sequences that can reconstruct the oxi 3 gap, transformants competent in terms of respiration were obtained that contained a homologous replacement for the defective 3 oxi gene.

Метаболический путь чужеродных биополимеров, таких как РНК, протеин, липиды и органические и неорганические химические агенты, может быть проанализирован при помощи бомбардировки частицами, покрытыми этими молекулами или комбинациями молекул. The metabolic pathway of foreign biopolymers, such as RNA, protein, lipids, and organic and inorganic chemical agents, can be analyzed by bombardment with particles coated with these molecules or combinations of molecules.

Кроме того, могут быть трансформированы изолированные субклеточные органеллы, такие как митохондрии или хлоропласты, а затем трансформированные органеллы могут быть снова вставлены в растительные клетки или протопласты. In addition, isolated subcellular organelles such as mitochondria or chloroplasts can be transformed, and then the transformed organelles can be reinserted into plant cells or protoplasts.

Примеры
Приводимые ниже примеры представлены для дальнейшей иллюстрации, и они не являются ограничивающими настоящее изобретение. Все части и проценты являются весовыми, если не указано противное.Examples
The following examples are presented for further illustration, and they are not limiting of the present invention. All parts and percentages are by weight unless otherwise indicated.

Внедряемый материал получали следующим образом. The introduced material was prepared as follows.

Несущие частицы, покрытые ДНК-содержащими плазмидами, суспендировали в несущей среде. Более конкретно, плазмиды адсорбировали на поверхность золотых частиц. Плазмида содержала ген, который кодирует фермент бета-глюкуронидазы (IVC-ген) и который контролируется промотором Вируса Калифорнийской Мозаики 35_s (СаМУ) (ген, промотор и регулирующие последовательности получали от фирмы Клонтек Лэбораториз, Инк. Пало Альто, Калифорния, США). Золотые частицы представляли собой сферический порошок с размерами от 1,5 до 3,0 микрон в диаметре (производится фирмой Альфа Продактс, Дэнверс, МА).Carrier particles coated with DNA-containing plasmids were suspended in a carrier medium. More specifically, plasmids were adsorbed onto the surface of gold particles. The plasmid contained a gene that encodes a beta-glucuronidase enzyme (IVC gene) and which is controlled by the promoter of the California Mosaic Virus 35 _s (CaMU) (the gene, promoter, and regulatory sequences were obtained from Clontec Laboratories, Inc. Palo Alto, California, USA). The gold particles were a spherical powder with sizes from 1.5 to 3.0 microns in diameter (manufactured by Alpha Products, Danvers, MA).

Чтобы осуществить адсорбцию, 50 μл раствора плазмиды (1,8 микрограмм (μл) ДНК на микролитр (μл) 0,01 молярного (М) Трис-буфера, pH 8,0 с 0,001 М этилен диамин тетрауксусной кислоты (ЭДТК) добавляли в 400 μл суспензии золотых несущих частиц (300 миллиграмм (мг) золотых несущих частиц на миллилитр (мл) дистиллированной воды). ДНК осаждали добавлением 74 μл 2,5 М раствора хлорида кальция и 30 μл 0,1 М раствора спермидина. Покрытым несущим частицам давали возможность отстояться и выпасть на дно пробирки Эппендорфа, а полученную после этого прозрачную жидкость полностью сбрасывали. Несущие частицы снова суспендировали в 500 μл этанола (100%) (несущую среду). Одну несущую частицу покрывали приблизительно 10 копиями плазмиды. To carry out adsorption, 50 μl of a plasmid solution (1.8 micrograms (μl) of DNA per microliter (μl) of 0.01 molar (M) Tris buffer, pH 8.0 with 0.001 M ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) was added to 400 μl of a suspension of gold carrier particles (300 milligrams (mg) of gold carrier particles per milliliter (ml) of distilled water). DNA was precipitated by the addition of 74 μl of a 2.5 M solution of calcium chloride and 30 μl of a 0.1 M solution of spermidine. settle and fall to the bottom of the Eppendorf tube, and the clear liquid obtained after that is completely The new particles were dropped. The carrier particles were resuspended in 500 μl of ethanol (100%) (carrier medium). One carrier particle was coated with approximately 10 copies of the plasmid.

Субстанцию-мишень получали следующим образом. Брали суспензионные культуры клеток гороха (черный Мексиканский сладкий, (ЧМС)), полученные от профессора Вирджини Уолбот (Стэнфордский фордский университет). ЧМС описан Шериданом (1975), J. Cell Biol. т. 67, стр. 3969. Эти культуры известным образом поддерживали в жидкой среде Мурашига и Скуга (МС) (Pnysiol. Plantarum, 1962, т 15, стр. 473 496), дополненной 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой (2 мг/литр). The target substance was obtained as follows. Pea cell suspension cultures (black Mexican sweet, (ChMS)) obtained from Professor Virginie Walbot (Stanford Ford University) were taken. ChMS is described by Sheridan (1975), J. Cell Biol. t. 67, p. 3969. These cultures were knownly maintained in the liquid medium of Murashig and Skoog (MS) (Pnysiol. Plantarum, 1962, t 15, p. 473 496), supplemented with 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2 mg / liter )

При подготовке бомбардировки несущими частицами собирали пробы в 100 мг клеток из суспензии на 7 см фильтровальной бумаге типа Ватман N 1 при помощи вакуумной фильтрации на воронке Бухнера. Фильтровальную бумагу с клетками помещали в 9 см чашку Петри 59a, которая содержит МС-среду, описанную выше, в твердой форме. When preparing the bombardment with support particles, samples of 100 mg of cells were collected from a suspension of 7 cm Whatman No. 1 filter paper using vacuum filtration on a Buchner funnel. The filter paper with cells was placed in a 9 cm Petri dish 59a, which contains the MS medium described above in solid form.

Устройство, используемое для ускорения покрытых золотых частиц в клетки ЧМС-гороха, состояло из следующих элементов, которые ранее были описаны на фиг. 1, 2, 3, 4:
1. Газовый цилиндр размером 1A (т.е. средство для подачи газа 12), заполненный газообразным гелием, находился в жидкостной связи с капиллярной трубкой из нержавеющей стали, имеющий размеры 7' х 0,02'' внутренний диаметр (т. е. линия подачи газа 14). Эта линия подачи газа находилась в оперативной комбинации со стандартным двухстадийным клапаном для регулирования давления, производимым фирмой Виктор Эквипмент Ко (т.е. клапаном 15, регулирующим подачу газа). Линия подачи газа, в свою очередь, находилась в связи с газовой камерой из нержавеющей стали высокого давления, имеющей размеры 1/8" (внешний диаметр) х 3'' длина (т.к. емкостью 16 для газа).The device used to accelerate the coated gold particles into the cells of the CMC pea consisted of the following elements, which were previously described in FIG. 1, 2, 3, 4:
1. A 1A gas cylinder (ie, gas supply means 12) filled with gaseous helium was in fluid communication with a stainless steel capillary tube having dimensions 7 'x 0.02''inner diameter (i.e. gas supply line 14). This gas supply line was in operational combination with a standard two-stage pressure regulating valve manufactured by Victor Equipment Co. (i.e., gas regulating valve 15). The gas supply line, in turn, was in connection with the gas chamber of high pressure stainless steel, measuring 1/8 "(outer diameter) x 3 '' length (as 16 with a gas capacity).

2. Стерильный шприц Луер Лок емкостью 3 кубических сантиметра (см³ (средство 17a для подачи внедряемого материала) находился в жидкостной связи с ФЕП трубкой из Тефлона 1/10'' (торговое наименование фирмы Е.И.Дюпон де Немюрз Ко. Уилмингтон, ДЕ) (т.е. трубопровод для подачи внедряемого материла). Эта трубка находилась в оперативной комбинации с 3-позиционным клапаном Реодайн Модели 7030 (т.е. многоцелевым клапаном 2).2. A sterile syringe Luer Lock with a capacity of 3 cubic centimeters (cm ³ (means 17a for feeding the injected material) was in fluid communication with a 1/10 '' Teflon FEP tube (trade name of the company E. I. Dupont de Nemurz Co. Wilmington, DE) (i.e., the pipeline for feeding the embedded material): This pipe was in operational combination with the Reodine Model 7030 3-position valve (i.e., multipurpose valve 2).

3. Прозрачная трубка ФЕП, 1/10'' внешний диаметр (т.е. средство извлечения 7). 3. FEP transparent tube, 1/10 '' outer diameter (ie, extraction tool 7).

4. Трубка из стекла пирекс, имеющая размеры 10 см х 1,2 мм внешний диаметр х 0,8 мм внутренний диаметр (т.е. средство доставки 6). 4. Pyrex glass tube measuring 10 cm x 1.2 mm outer diameter x 0.8 mm inner diameter (ie, delivery vehicle 6).

5. Средство для измерения скорости, состоящее из двух датчиков, последовательно расположенных относительно друг друга на средстве доставки 6. Каждый датчик (т.е. первый датчик 33 и второй датчик 34) содержал фотодиод и инфракрасный эмиттер. Фотодиоды производятся фирмой Моторола Семикондактор Продактс, Инк. (Фоеникс, АЗ, США) под торговым наименованием МРД500, а инфракрасные эмиттеры производятся фирмой Дженерал Электрик под торговым наименованием ЛЕД55с. 5. A means for measuring speed, consisting of two sensors sequentially located relative to each other on the delivery means 6. Each sensor (ie, the first sensor 33 and the second sensor 34) contained a photodiode and an infrared emitter. Photodiodes are manufactured by Motorola Semicondactor Products, Inc. (Phoenix, AZ, USA) under the trade name MRD500, and infrared emitters are manufactured by General Electric under the trade name LED55s.

Первый и второй датчики 33 и 34 находились в оперативной комбинации через электрическую цепь, имеющую схему, приведенную на фиг. 10 и 11. The first and second sensors 33 and 34 were in operative combination through an electric circuit having the circuit shown in FIG. 10 and 11.

Ниже приведено подробное объяснение фиг. 10 и 11, на которых представлена оперативная комбинация между средством для измерения скорости 32 и многоцелевым клапаном 2. The following is a detailed explanation of FIG. 10 and 11, which shows the operational combination between the means for measuring speed 32 and the multi-purpose valve 2.

Блок 53 обеспечивает последовательный отсчет времени, чтобы гарантировать, что после нажатия средства приведения в действие (т.е. "гашетки" 54), все другие части цепи уже подготовлены для начала временного цикла. Блок 53 посылает сигнал 55 одновременно в обход через блок 56 (получаемый, как сигнал 57), и далее в виде сигнала 58, необходимого блоку 59, чтобы остановился таймер, и сигнал 55, поступая непосредственно к блоку 60 (в виде сигнала 57), чтобы возвратить в исходное положение узел 61, чтобы он принимал только один стартовый сигнал 62 и очищал блок отсчета времени 63 до нуля. "Обходной" сигнал обеспечивается для того, чтобы гарантировать остановку таймера в случае, если оптика второго датчика 34 (изображенного как средство излучения 37 и чувствительный элемент 38) не зарегистрировала прохождение внедряемого в клетку материала. Далее, блок 53 подает сигнал 64, чтобы инициировать запуск таймера (т.е. 65 на фиг. 10 в блоке 66). Block 53 provides a sequential countdown to ensure that after pressing the actuating means (ie, “trigger” 54), all other parts of the circuit are already prepared to start the time cycle. Block 53 sends a signal 55 simultaneously bypassing through block 56 (received as signal 57), and then in the form of signal 58, which is necessary for block 59 to stop the timer, and signal 55, which goes directly to block 60 (as signal 57), in order to return to the initial position the node 61, so that it receives only one start signal 62 and clears the time reference block 63 to zero. A "bypass" signal is provided in order to guarantee a timer stop if the optics of the second sensor 34 (depicted as a radiation means 37 and a sensing element 38) have not detected the passage of material introduced into the cell. Next, block 53 provides a signal 64 to initiate a timer (i.e., 65 in FIG. 10 in block 66).

Блок 66 принимает сигнал 64 от блока 53 и затем обеспечивает заранее выбранный временной интервал через реле твердого состояния (т.е. на фиг. 10), приводя в действие 4-позиционный клапан (т.е. 68 на фиг. 10), который посылает выбранный объем воздуха под давлением в пневматический привод (не показан) на многоцелевом клапане 2. Этот задействованный клапан 2 предназначен для того, чтобы обеспечить связь между источником газа под давлением и резервуаром 5 для внедряемого материала. Block 66 receives a signal 64 from block 53 and then provides a pre-selected time interval through a solid state relay (i.e., in FIG. 10), actuating a 4-position valve (i.e., 68 in FIG. 10), which sends the selected volume of pressurized air to a pneumatic actuator (not shown) on the multi-purpose valve 2. This actuated valve 2 is designed to provide a connection between the gas source under pressure and the reservoir 5 for the introduced material.

Блок 69 принимает сигнал 70, выработанный внедряемым материалом, проходящим между средством излучения и чувствительным элементом первого датчика скорости 33 (как это изображено в виде средства излучения 35 и чувствительного элемента 36), обрабатывает этот сигнал и продуцирует сигнал на резкий подъем напряжения, соответствующий по времени снижению напряжения сигнала 70, т. е. сигнала "старт" 62, способного запустить таймер (блок 63 на фиг. 11). Block 69 receives the signal 70 generated by the embedded material passing between the radiation means and the sensing element of the first speed sensor 33 (as shown in the form of radiation means 35 and the sensing element 36), processes this signal and produces a signal for a sharp rise in voltage, corresponding in time reducing the voltage of the signal 70, that is, the start signal 62, capable of starting the timer (block 63 in Fig. 11).

Блок 56 принимает сигнал 71, выработанный внедряемым материалом, проходящим между комбинацией средства излучения и чувствительного элемента второго датчика скорости 34, и продуцирует сигнал резкого подъема напряжения, соответствующий по времени снижению напряжения сигнала 71 (т.е. сигнала "стоп" 58, способного остановить таймер (блок 63 на фиг. 11). Block 56 receives the signal 71 generated by the embedded material passing between the combination of the radiation means and the sensing element of the second speed sensor 34, and produces a signal of a sharp increase in voltage, corresponding in time to the decrease in voltage of the signal 71 (ie, the stop signal 58, which can stop a timer (block 63 in FIG. 11).

Блок 59 принимает сигнал "старт" 62 от блока 69, сигнал "стоп" 58 от блока 56, а блок 60 принимает сигнал 57 "очистка таймера" от последовательного блока 53, и поддерживает статус таймера, т.е. допускает только один временной цикл на один цикл доставки внедряемого материала. Блок 59 вырабатывает сигнал 72, который поступает в блок 63. Block 59 receives a start signal 62 from block 69, a stop signal 58 from block 56, and block 60 receives a clear timer signal 57 from serial block 53, and maintains a timer status, i.e. allows only one time cycle per one cycle of delivery of embedded material. Block 59 generates a signal 72, which enters block 63.

Блок 63 содержит стабилизированный кварцевым кристаллом таймер, содержащий цепь 73, обеспечивающую часы, и цифровой счетчик 74. Блок 75 содержит мультиплексный декодер десятичных чисел в двоичным коде (ДДК) в семь сегментов на дисплее (т.е. 76 на фиг. 11) и дисплей ЛЭД (77 на фиг. 11). Блок 75 таким образом указывает время полета самого последнего внедряемого в клетку материала. Block 63 comprises a quartz-crystal-stabilized timer comprising a clock circuit 73 and a digital counter 74. Block 75 contains a binary decimal digit multiplexer (DEC) in seven segments on the display (i.e., 76 in FIG. 11) and LED display (77 in FIG. 11). Block 75 thus indicates the flight time of the most recent material introduced into the cell.

Цифровой счетчик 74 принимает сигналы состояния таймера 57 и 72 от блока 61. Такими сигналами таймера являются "таймер запущен" (т.е. 72) и "таймер очищен" (т.е. 57). Если сигналом запуска таймера был 0 вольт, то блок таймера отсчитывает микросекунды от нуля. Если сигналом запуска таймера было 12 вольт, то таймер останавливается и сохраняет последний отсчет. Если сигналом очистки таймера было 0 вольт, то таймер запускается. Если сигналом очистки таймера было 12 вольт, то таймер очищается в нуль. Дисплейный блок 77 принимает ДДК-числовые сигналы от блока 63 и, таким образом, показывает самое последнее время пролета внедряемого материала в микросекундах на передней панели дисплея. The digital counter 74 receives the status signals of the timer 57 and 72 from block 61. Such timer signals are “timer started” (ie 72) and “timer cleared” (ie 57). If the start signal of the timer was 0 volts, then the timer block counts microseconds from zero. If the start signal of the timer was 12 volts, then the timer stops and saves the last count. If the timer clear signal was 0 volts, then the timer starts. If the timer clear signal was 12 volts, then the timer is cleared to zero. The display unit 77 receives the DDC digital signals from block 63 and thus shows the most recent flight time of the introduced material in microseconds on the front panel of the display.

Хотя была приведена вполне конкретная цепь, самые разнообразные цепи могут обеспечивать тот же результат. Although a very specific chain has been given, a wide variety of chains can provide the same result.

6. Двойственный трехпозиционный клапан (многоцелевой клапан 2), содержащий два подклапана (подклапаны 8 и 9), производится фирмой Реодайн, Инк. Котати, КА под торговым наименованием модель 7030 ARY. Подклапаны двойственного трехпозиционного клапана 2 находятся в оперативной комбинации с пневматическим приводом, набор инструментов41687, производимым фирмой Анспек Ко. Анн Арбор, МИ. Пневматический привод приводится в движение воздухом, подаваемым из четырехпозиционного соленоидного клапана, производимого фирмой Отоматик Свитч Компани (АСКО), Флорэм Парк, Нью Джерси. 6. A dual three-position valve (multipurpose valve 2) containing two sub-valves (sub-valves 8 and 9) is manufactured by Reodine, Inc. Kotati, KA under the trade name Model 7030 ARY. The sub-valves of the dual three-position valve 2 are in operational combination with a pneumatic actuator, tool kit 41677, manufactured by Anspeck Co. Ann Arbor, MI. The pneumatic actuator is driven by air supplied from a four-position solenoid valve manufactured by the Automatic Switch Company (ASCO), Florham Park, New Jersey.

7. Внешняя петля 5, изготовленная из нержавеющей стали, 1/16" внешний диаметр (резервуар для внедряемого материала), находится в оперативной комбинации с первым и вторым трехканальными клапанами. 7. Outer loop 5, made of stainless steel, 1/16 "outside diameter (reservoir for implantable material), is in operational combination with the first and second three-channel valves.

Первый трехканальный клапан обеспечивает селективную жидкостную связь между средством для подачи внедряемого материала или резервуаром для газа и резервуаром для внедряемого материала. The first three-way valve provides selective fluid communication between the means for supplying the introduced material or the reservoir for gas and the reservoir for the introduced material.

Второй трехканальный клапан обеспечивает селективную жидкостную связь между резервуаром для внедряемого материала и средством извлечения или средством доставки. The second three-way valve provides selective fluid communication between the reservoir for the introduced material and the means of extraction or means of delivery.

Многоцелевой клапан первоначально устанавливали с тем, чтобы обеспечить жидкостную связь между шприцем и внедряемым материалом и блокировать пневматическую связь между резервуаром для газа и резервуаром для внедряемого материала. A multipurpose valve was initially installed in order to provide fluid communication between the syringe and the injected material and to block the pneumatic connection between the gas tank and the reservoir for the injected material.

Шприц, который способен доставлять 1 мл внедряемого материала (суспензии несущей среды и покрытых частиц), помещали в жидкостную связь с трубопроводом для подачи внедряемого материала. Трубопровод для подачи внедряемого материала находился в жидкостной связи с резервуаром для внедряемого материала. A syringe that is capable of delivering 1 ml of injectable material (suspension of a carrier medium and coated particles) was placed in fluid communication with a pipeline for feeding the injected material. The pipeline for supplying the introduced material was in fluid communication with the reservoir for the introduced material.

Клапан 18 для регулирования внедряемого материала открывали с тем, чтобы обеспечить жидкостную связь между средством для подачи внедряемого материала и резервуаром для внедряемого материала. После того, как выбранный объем внедряемого материала выпущен в резервуар для внедряемого материала, клапан для внедряемого материала закрывали. The valve 18 for regulating the introduced material was opened so as to provide fluid communication between the means for supplying the introduced material and the reservoir for the introduced material. After the selected volume of introduced material was discharged into the reservoir for introduced material, the valve for introduced material was closed.

Любой объем внедряемого материала, избыточный относительно объема резервуара для внедряемого материала, удаляли через средство извлечения. Any volume of introduced material that is excessive relative to the volume of the reservoir for introduced material was removed through an extraction means.

Клапан 15 для регулирования газа открывали для того, чтобы обеспечить пневматическую связь между средством для подачи газа и резервуаром для газа. В резервуаре для газа получали давление в примерно 1000 фунтов на кв. дюйм (70,3 кг/см²). Затем клапан, регулирующий подачу газа, закрывали.The gas control valve 15 was opened in order to provide pneumatic communication between the gas supply means and the gas reservoir. A pressure of about 1000 psi was obtained in the gas tank. inch (70.3 kg / cm ² ). Then, the gas control valve was closed.

Остальную часть работы регулировали через цепь, изображенную на фиг. 10 и 11. Цепь работает следующим образом. The rest of the work was regulated through the circuit shown in FIG. 10 and 11. The circuit operates as follows.

После того, как нажимали на "гашетку" 54, блок 53 вырабатывал временную последовательность в 0,05 секунды, чтобы остановить цифровой таймер блока 63. Блок 61 сохраняет состояние блока 63, т.е. если в результате ошибки цифровой таймер по-прежнему отсчитывает время после предыдущего запуска устройства, то цифровой таймер очищается в нуль при подготовке следующего временного цикла. После того, как цифровой таймер останавливался, положение таймера блока 61 устанавливалось так, чтобы он принимал только один стартовый сигнал от блока 69. After clicking on the "trigger" 54, block 53 generated a time sequence of 0.05 seconds to stop the digital timer of block 63. Block 61 stores the state of block 63, i.e. if, as a result of an error, the digital timer still counts the time after the previous start of the device, the digital timer is cleared to zero when preparing the next time cycle. After the digital timer stopped, the timer position of block 61 was set so that it received only one start signal from block 69.

Далее, запускали блок 66 таймера интервалов. Блок 66 таймера интервалом подавал текущий временной интервал в 0,8 секунды в 120 вольт переменного тока, чтобы задействовать клапан 68, подающий воздух под давлением от 65 до 75 фунтов на кв. дюйм (от 4,57 до 5,27 кг/см²), чтобы привести в движение пневматический привод (не показан) на многоцелевом клапане 2, чтобы установить многоцелевой клапан в положение, обеспечивающее селективную связь между источником газа и резервуаром для внедряемого материала, что приводило к ускорению газа под давлением и внедряемого материала после первого и второго датчиков.Next, the interval timer block 66 was started. Block 66 timer interval served the current time interval of 0.8 seconds in 120 volts of alternating current to activate the valve 68, which supplies air under pressure from 65 to 75 psi. inch (from 4.57 to 5.27 kg / cm ² ) to drive a pneumatic actuator (not shown) on the multi-purpose valve 2, to set the multi-purpose valve in a position that provides selective communication between the gas source and the reservoir for the introduced material, which led to acceleration of gas under pressure and introduced material after the first and second sensors.

Когда передний фронт внедряемого материала проходил через первый датчик средства для измерения скорости, подавался электрический сигнал (70). После переработки блоком 69 электрический сигнал представлял собой сигнал, используемый блоком 61 для запуска блока цифрового таймера 63. When the leading edge of the introduced material passed through the first sensor of the velocity measuring means, an electrical signal was supplied (70). After processing by block 69, the electrical signal was the signal used by block 61 to start the digital timer block 63.

Точно так же, когда передний фронт внедряемой жидкости проходил через второй датчик средства для измерения скорости, то вырабатывался электрический сигнал 71. После обработки блоком 61 электрический сигнал представлял собой сигнал, используемый блоком 61 для остановки блока цифрового таймера 63. Время полета переднего фронта внедряемого в клетку материала между первым датчиком и вторым датчиком высвечивали на (3 цифры, 7 сегментов) дисплее ЛЭД (т.е. 77 ) блока 75, многосегментного ЛЭД-индикатора. Similarly, when the leading edge of the introduced liquid passed through the second sensor of the speed measuring device, an electrical signal 71 was generated. After processing by block 61, the electrical signal was the signal used by block 61 to stop the digital timer block 63. The flight time of the leading edge of the introduced the cell of material between the first sensor and the second sensor was highlighted on the (3 digits, 7 segments) LED display (i.e. 77) of block 75, a multi-segment LED indicator.

Фиг. 12 представляет необработанные данные, полученные при функционировании устройства. Электрический сигнал 70 получали от датчика 33, а электрический сигнал 71 получали от датчика 34. Датчики расположены на расстоянии 2,8 сантиметров друг от друга. Когда внедряемый материал проходил между тем или другим датчиком, электрический сигнал сдвигался от линии отсчета. Для электрического сигнала 70 такой сдвиг приведен в точке кривой А, а для электрического сигнала 71 этот сдвиг показан в точке кривой Б. Время прохождения между первым и вторым датчиками, что показано в виде расстояния между точками А и Б кривых 70 и 71, которое составило 60 микросекунд. Это указывает на то, что внедряемый материал пролетал со скоростью примерно 1044 миль в час (1680 км/ч). FIG. 12 represents the raw data obtained during operation of the device. An electrical signal 70 was received from the sensor 33, and an electrical signal 71 was received from the sensor 34. The sensors are located at a distance of 2.8 centimeters from each other. When the introduced material passed between one or another sensor, the electric signal shifted from the reference line. For the electric signal 70, such a shift is shown at the point of curve A, and for the electric signal 71 this shift is shown at the point of curve B. The transit time between the first and second sensors, which is shown as the distance between points A and B of curves 70 and 71, which amounted to 60 microseconds. This indicates that the introduced material flew at a speed of approximately 1,044 miles per hour (1,680 km / h).

Внедряемый материал выпускали из средства доставки в направлении ЧМС-клеток в зону выталкивания. Зону выталкивания ограничивали вакуумной камерой, конструкция которой описана в упомянутом выше каталоге "Фишер 88" (стр. 114). Давление в зоне выталкивания составило примерно 0,1 атмосферы (абс). The introduced material was discharged from the delivery vehicle in the direction of the ChMS cells into the ejection zone. The ejection zone was limited by a vacuum chamber, the construction of which is described in the Fisher 88 catalog mentioned above (p. 114). The pressure in the expulsion zone was about 0.1 atmosphere (abs).

Работу завершали при помощи селективной установки клапана так, чтобы блокировать поступление газа из резервуара для газа через этот клапан в средство доставки и чтобы обеспечить жидкостную связь между шприцем и резервуаром слива внедряемого материала. The work was completed using a selective valve installation so as to block the flow of gas from the gas reservoir through this valve to the delivery means and to provide fluid communication between the syringe and the discharge tank of the injected material.

Монослои ЧМС-клеток на чашках Петри (т.е. чашке Петри 30) с МС-средой бомбардировали одновременно. Содержалось 100 мг ЧМС-клеток на каждой чашке Петри. Несущие частицы, покрытые ГУС-содержащей плазмидой, доставлялись в ЧМС-клетки. Monolayers of ChMS cells on Petri dishes (i.e., Petri dish 30) with MS medium were bombarded simultaneously. Contained 100 mg of ChMS cells on each Petri dish. Carrier particles coated with a HUS-containing plasmid were delivered to HMS cells.

После бомбардировки ЧМС-клеток культуру инкубировали в темноте в течение 2 дней при температуре 27^oC. Спустя два дня клетки анализировали на ГУС-активность.After bombardment of the ChMS cells, the culture was incubated in the dark for 2 days at a temperature of 27 ^o C. After two days, the cells were analyzed for HUS activity.

Экспрессию ГУС-гена в ЧМС-клетках наблюдали с использованием ГУС-гистохимического анализа (субстрат 5-Br-4-Cl-3 индолил-бета-D-глюкуроновой кислоты [X-глюк] и процедура получены от фирмы Клонтек Лэбораториз, Инк. Пало Альто, КА). ЧМС-клетки и клеточные ростки инкубировали при 37^oC в течение от 24 до 48 часов в растворе 1 миллимоля (мМ) X-глюка, содержащем 0,5 мМ феррицианида калия, 0,5 мМ ферроцианида калия и 10 мМ ЭДТК. Клетки и клеточные ростки, которые становились голубыми во время анализа, рассматривались как положительные на ГУС-активность.HUS gene expression in HMS cells was observed using HUS histochemical analysis (5-Br-4-Cl-3 indolyl-beta-D-glucuronic acid substrate [X-glucose] and the procedure was obtained from Clontec Laboratories, Inc. Palo Alto, KA). HMS cells and cell sprouts were incubated at 37 ^° C. for 24 to 48 hours in a solution of 1 millimole (mM) X-glucose containing 0.5 mM potassium ferricyanide, 0.5 mM potassium ferrocyanide and 10 mM EDTA. Cells and cell sprouts that turned blue during analysis were considered positive for HUS activity.

Полученные результаты приведены в таблице. The results are shown in the table.

Эти данные указывают на то, что бомбардировку частицами использовали для того, чтобы доставить ДНК в интактные растительные клетки одновременно и что ген, введенный в результате этой процедуры, может в последующем экспрессировать. These data indicate that particle bombardment was used to deliver DNA to intact plant cells simultaneously and that the gene introduced as a result of this procedure can subsequently express.

Специалисту ясно из приведенного выше описания, что возможны различные модификации настоящего изобретения в дополнение к тем вариантам, которые описаны в тексте и показаны на чертежах. По этой причине объем настоящего изобретения определяется исключительно патентной формулой. It will be apparent to those skilled in the art from the above description that various modifications of the present invention are possible in addition to the options described in the text and shown in the drawings. For this reason, the scope of the present invention is determined solely by the patent claims.

Claims

1. A device for introducing biological material into living cells, comprising a reservoir for introducing into the cell material with inlet and outlet openings and a gas source under pressure with an outlet for gas in communication with the reservoir, characterized in that the device includes three containers: the first serving as a source gas, the second, which serves as a means for supplying the introduced material, and the third, which serves as a reservoir for the introduced material, a macro sighting tube with inlet and outlet openings, the first of which is communicated with the outlet of the third container, a double three-way valve with two auxiliary valves, the first of which serves for selective pneumatic communication between the outlet of the first container or the outlet of the second container with the inlet of the third container and to provide selective communication between the inlet of the macro targeting tube and the outlet of the third container.

2. The device according to p. 1, characterized in that it further comprises a fourth container with an inlet serving as a means of regeneration, a double three-way multipurpose valve for selectively communicating the outlet of the first container or the outlet of the second container with the inlet of the third container and to provide selective communication between the inlet of the macro targeting tube or the inlet of the fourth container and the outlet of the second container.

3. The device according to claim 1, characterized in that it comprises a gas supply tank with an outlet and a gas adjustable valve, wherein the outlet of this reservoir is selectively connected between the outlet of the reservoir and the inlet and outlet of the first reservoir.

4. The device according to claim 1, characterized in that it contains a thermocouple for temperature control, built into the block heater, in which the second container is enclosed.

5. The device according to p. 1, characterized in that the second container is equipped with a pump-pump, a magnetic stirrer and a valve device or pump for the formation of oppositely directed flows inside the second container.

6. The device according to p. 1, characterized in that it contains microscopes and borescopes to increase the accuracy of biological material entering the cells.

7. The device according to paragraphs. 1 and 6, characterized in that it contains a pipette, the inlet of which is in communication with the outlet of the macro-targeting tube, wherein the pipette is selectively positioned by means of a micro-tool with a holder rigidly connected to a movable tool of a three-way micromanipulator.

8. The device according to claim 1, characterized in that it contains a transparent tube serving as a macro targeting device and two sensors located adjacent to the tube, each sensor including a photodiode and an infrared emitter for determining the flight time of the biological introduced material from the introduced material reservoir moreover, the sensors are interconnected by an electric circuit.

9. The device according to claim 1, characterized in that the macro-targeting tube is in fluid communication with the evacuated chamber in which adjustable conditions are provided.

10. The method of introducing biological material, including the preliminary cultivation of cells and the introduction of biological material associated with carrier particles into cells, characterized in that the binding of biological material is carried out by fixing it in a volume of 0.5 to 1000 μl on particles of a carrier with a diameter of 0.1 100 μm and a density of 1 25 g / cm ³ , and the introduction is carried out by supplying bound material to the cells with a gas flow of 1 100 cm ³ and mol.m. 2 40 at. units under a pressure of 15,150 atm, which provides acceleration at a speed sufficient for penetration of the introduced material into the cells.