RU2077340C1

RU2077340C1 - Method of preparing specific serum for treatment, diagnosis and prophylaxis of viral hemorrhagic disease in rabbits and a set for disease diagnosis

Info

Publication number: RU2077340C1
Application number: RU93039551A
Authority: RU
Inventors: А.А. Шевченко; И.Ф. Вишняков; М.А. Дымин; В.П. Князев; Л.В. Шевченко; Н.В. Малоголовкина; Н.К. Крюкова; Н.В. Бадаева; Г.М. Карпов
Original assignee: Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии
Priority date: 1993-08-06
Filing date: 1993-08-06
Publication date: 1997-04-20

Abstract

FIELD: virology. SUBSTANCE: method involves subcutaneous rabbits vaccination with commercial vaccine followed by immunization after 14 days with commercial vaccine or rabbit hemorrhagic disease virulent virus, strain "ВГИКИ-1652". Set for diagnosis contains: inactivated virus of rabbit hemorrhagic disease, strain "ВГИКИ-1652", serum obtained as described above, normal antigen, normal serum and human erythrocytes. EFFECT: improved method of serum preparing. 2 cl, 4 tbl

Description

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к способу получения специфической сыворотки для лечения, диагностики и профилактики вирусной геморрагической болезни кроликов (ВГБК) и набору для диагностики болезни, и может быть использовано в научных, производственных лабораториях и предприятиях биологической промышленности. The invention relates to veterinary virology, and in particular to a method for producing specific serum for the treatment, diagnosis and prevention of rabbit viral hemorrhagic disease (HBVC) and a kit for diagnosing the disease, and can be used in scientific, production laboratories and enterprises of the biological industry.

Известны способы получения специфического антигена ВГБК и специфической сыворотки для практического применения в реакции гемагглютинации (РГА), реакции задержки гемагглютинации (РЗГА), реакции преципитации в агаровом геле (Kiepkerch, Diss. Hannover, 1990-65 S; Villares G.L.А. Rev. Sci. tech. Off int Еpir, 1991, 10 (2), 471 480; Ohlinger V.F. et al Fierarzfl Umschau. 1989
Вb. 44, 5 S 284 294; Soike D. et al Mh. Vet Med. 1989 Bd. 41, 11 - S 376 378).Known methods for producing specific HBVA antigen and specific serum for practical use in the hemagglutination reaction (HGA), the reaction of delayed hemagglutination (HHA), agar gel precipitation reactions (Kiepkerch, Diss. Hannover, 1990-65 S; Villares GLA. Rev. Sci. tech. Off int Epir, 1991, 10 (2), 471,480; Ohlinger VF et al Fierarzfl Umschau. 1989
Bb. 44.5 S 284 294; Soike D. et al Mh. Vet Med. 1989 Bd. 41, 11 - S 376 378).

Имеющиеся отрывочные литературные данные реферативного характера не позволяют судить о технологии получения сыворотки против ВГБК и использования ее для лечения, профилактики и изготовления набора для диагностики этой болезни. The available fragmentary literature data of a abstract nature does not allow us to judge the technology for obtaining serum against HBV and its use for the treatment, prevention, and manufacture of a kit for the diagnosis of this disease.

В нашей стране подобных исследований не обнаружено. No similar studies have been found in our country.

Целью предполагаемого изобретения является получение высокоактивной специфической сыворотки для лечения, диагностики и профилактики и изготовление набора для диагностики ВГБК. The aim of the proposed invention is to obtain highly active specific serum for the treatment, diagnosis and prevention and the manufacture of a kit for the diagnosis of HBV.

Сущность предполагаемого изобретения заключается в том, что специфическую сыворотку получают от кроликов массой не менее 2,5 кг, вакцинированных одно- или двукратно с интервалом в 14 дней коммерческой вакциной против ВГБК. Спустя 14 дней после первой вакцинации, животных заражают вирулентным вирусом ГБК или ревакцинируют. Затем обескровливают и получают сыворотку с активностью в РЗГА от 1:256 до 1:4096, в РДСК 1:32 1:1024. The essence of the proposed invention lies in the fact that a specific serum is obtained from rabbits weighing at least 2.5 kg vaccinated once or twice with an interval of 14 days with a commercial vaccine against HBV. 14 days after the first vaccination, animals are infected with virulent HBK virus or revaccinated. Then they bled and receive serum with activity in RZHA from 1: 256 to 1: 4096, in RDSK 1:32 1: 1024.

Набор для диагностики ВГБК содержит емкости со специфической и нормальной сыворотками, специфическим и нормальным антигенами и эритроцитами человека. Набор используют для выявления антигена в РГА и РДСК, антител в РЗГА и РДСК. The kit for the diagnosis of HBV contains containers with specific and normal sera, specific and normal antigens, and human red blood cells. The kit is used to detect antigen in RGA and RDSK, antibodies in RZHA and RDSK.

Для получения высокоактивной специфической сыворотки по первой схеме используют клинически здоровых кроликов массой не менее 2,5 кг любой породы, полученных из благополучных хозяйств по инфекционным и инвазионным болезням кроликов. Животных вакцинируют согласно наставлению коммерческой инактивированной вакциной. Спустя 14 дней, кроликов заражают вирулентным вирусом ГБК штамм "Воронежский 87" (регистрационный 1652 в коллекции ВГНКИ) в дозе 1000 ЛД 50/см³ и через 10 дней проводят тотальное обескровливание.To obtain highly active specific serum according to the first scheme, clinically healthy rabbits weighing at least 2.5 kg of any breed obtained from successful farms for infectious and invasive diseases of rabbits are used. Animals are vaccinated according to the instructions of a commercial inactivated vaccine. After 14 days, rabbits are infected with the virulent virus HBK strain "Voronezh 87" (registration 1652 in the collection of VGNKI) at a dose of 1000 LD 50 / cm ³ and after 10 days total bleeding is performed.

По второй схеме кроликов иммунизируют согласно наставлению коммерческой инактивированной вакциной двукратно с интервалом в 14 дней. Через 14 дней после повторной вакцинации обескровливают. Кровь от животных берут с соблюдением правил асептики. Флаконы с кровью помещают на 30 40 минут в термостат при температуре 37^oC, затем в холодильник при температуре 6^oC. Через 12 часов сыворотку сливают и центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 20 минут. Сыворотку отбирают и инактивируют в водяной бане при температуре 60^oC в течение 2-х часов и хранят при температуре не менее 20^oC или фасуют в ампулы или флаконы и подвергают лиофилизации. Активность специфической сыворотки против ВГБК представлена в таблице 1.According to the second scheme, rabbits are immunized according to the instructions of a commercial inactivated vaccine twice with an interval of 14 days. 14 days after re-vaccination bleed. Blood from animals is taken in compliance with aseptic rules. Blood vials are placed for 30-40 minutes in a thermostat at a temperature of 37 ^o C, then in a refrigerator at a temperature of 6 ^o C. After 12 hours, the serum is drained and centrifuged at 3000 rpm. for 20 minutes. The serum is collected and inactivated in a water bath at a temperature of 60 ^o C for 2 hours and stored at a temperature of at least 20 ^o C or Packed in ampoules or vials and subjected to lyophilization. The activity of specific serum against HBV is presented in table 1.

Данные таблицы 1 показывают, что предложенные обе схемы позволяют получать высокоактивную специфическую сыворотку против ВГБК. По третьей схеме получают сыворотку против ВГБК от 1:64 до 1:256. The data in table 1 show that the proposed both schemes allow you to get highly active specific serum against HBV. In the third scheme receive serum against HBV from 1:64 to 1: 256.

Согласно первой схеме, можно в производственных условиях биофабрик при испытании эффективности коммерческих серий вакцин получать дополнительно сыворотку без затрат. Это позволяет снизить себестоимость коммерческих препаратов за счет использования 100% опытных животных (выжившие после контрольного заражения вирулентным вирусом ГБК и не заболевшие животные при получении антигена). According to the first scheme, it is possible in production conditions of biofactories when testing the effectiveness of commercial vaccine series to obtain additional serum without cost. This allows you to reduce the cost of commercial preparations due to the use of 100% of experimental animals (surviving after control of infection with virulent HBK virus and not infected animals upon receipt of the antigen).

Вторая схема получения сыворотки позволяет получить специфическую сыворотку в условиях хозяйства и биофабрик без затрат на обеспечение безопасности работ по выносу вирулентного возбудителя. The second scheme for producing serum allows you to get specific serum in the conditions of the economy and biofactories without the cost of ensuring the safety of the removal of the virulent pathogen.

Полученную специфическую сыворотку против ВГБК проверяют на кроликах, свободных от антител к вирусу ГБК, на профилактическое и лечебное действие. The obtained specific anti-HBV serum is tested on rabbits free of antibodies to the HBV virus for prophylactic and therapeutic effects.

Для оценки профилактического действия специфической леофилизированной сыворотки готовят среднюю пробу из 5 ампул, ресуспендируют каждую в 5 см³ стерильного физиологического раствора рН 7,2. Из 3-х флаконов нативной сыворотки берут по 5 см³ и объединяют. Из общей смеси каждой серии сыворотку вводят 20 кроликам по 0,5 см³, подкожно, однократно по 5 голов на серию. Для контроля берут 3 кролика. Через 24 часа после введения специфической сыворотки всех животных заражают вирулентным вирусом ГБК в дозе 1000 ЛД 50/см³. Наблюдение за животными ведут в течение 20 суток. Через 30 48 часов кролики в контрольной группе погибают с характерными клиническими и патологоанатомическими изменениями для ВГБК. Наличие вируса подтверждают в РГА. Кролики, которым перед заражением вводили специфическую сыворотку, остаются живыми и здоровыми (таблица 2).To assess the prophylactic effect of specific leophilized serum, an average sample of 5 ampoules is prepared, each is resuspended in 5 cm ^{3 of a} sterile physiological solution of pH 7.2. From 3 vials of native serum take 5 cm ³ and combine. From the total mixture of each series, the serum is administered to 20 rabbits of 0.5 cm ³ , subcutaneously, once, 5 animals per series. For control, 3 rabbits are taken. 24 hours after the introduction of specific serum, all animals are infected with virulent HBK virus at a dose of 1000 LD 50 / cm ³ . Observation of animals is carried out for 20 days. After 30 to 48 hours, rabbits in the control group die with characteristic clinical and pathological changes for HBVC. The presence of the virus is confirmed in the RGA. Rabbits that were given specific serum before infection remain alive and healthy (Table 2).

Из данных таблицы 2 видно, что однократное подкожное введение специфической нативной или лиофилизированной сыворотки в дозе 0,5 см³ защищает кроликов от вирулентного вируса ГБК.From the data of table 2 it is seen that a single subcutaneous injection of a specific native or lyophilized serum at a dose of 0.5 cm ³ protects rabbits from the virulent GBK virus.

Также подтверждено лечебное действие специфической сыворотки против ВГБК. Для этого берут 23 кролика массой не менее 2,5 кг, свободных от антител к вирусу ГБК, заражают вирулентным вирусом ГБК штамм "Воронежский 87" в дозе 1000 ЛД 50/см³. Через 20 часов, после развития клинических признаков ВГБК (угнетение, отказ от корма, взъерошенность и т.д.), 10 кроликам вводят лиофилизированную специфическую сыворотку серии 1 и 2 ( предварительно разведенную 1: 5 cтерильным физраствором) по 0,5 см³ подкожно однократно. Другим 10 кроликам вводят по 0,5 см³ подкожно однократно нативную сыворотку серии 1 и 2. На каждую серию берут по 5 кроликов. Для контроля берут 3 кролика.Also confirmed the therapeutic effect of specific serum against HBV. To do this, take 23 rabbits weighing at least 2.5 kg, free of antibodies to the GBK virus, infect the virulent virus GBK strain "Voronezh 87" at a dose of 1000 LD 50 / cm ³ . After 20 hours, after the development of clinical signs of HBVC (oppression, refusal to feed, ruffled, etc.), 10 rabbits are injected with lyophilized specific serum series 1 and 2 (previously diluted 1: 5 with sterile saline solution), 0.5 cm ³ subcutaneously once. The other 10 rabbits are injected 0.5 cm ³ subcutaneously once with a single serum of series 1 and 2. For each series, 5 rabbits are taken. For control, 3 rabbits are taken.

Результаты представлены в таблице 3. The results are presented in table 3.

Данные таблицы 3 показывают, что однократное подкожное введение нативной или лиофилизированной специфической сыворотки против ВГБК в дозе 0,5 см³ излечивает животных. Специфическую сыворотку вводят через 20 часов после заражения вирулентным вирусом ГБК, штамм "В-87". Лечебный эффект специфической сыворотки составляет от 80 до 100 процентов.The data in table 3 show that a single subcutaneous injection of native or lyophilized specific serum against HBV in a dose of 0.5 cm ³ cures animals. Specific serum is administered 20 hours after infection with a virulent HBK virus, strain B-87. The therapeutic effect of a specific serum is from 80 to 100 percent.

Таким образом, установлено профилактическое и лечебное действие специфической сыворотки против ВГБК лиофилизированных серий, хранившихся в течение года и 5 лет при температуре 6 ±2^oC, и нативных хранившейся при температуре минус 40 ± 2^oC в течение 5 лет после изготовления.Thus, the prophylactic and therapeutic effect of a specific serum against HBVC of lyophilized series stored for a year and 5 years at a temperature of 6 ± 2 ^o C and native ones stored at a temperature of minus 40 ± 2 ^o C for 5 years after manufacture was established.

Для диагностики ВГБК предлагается набор компонентов, который используют в реакциях РГА, РЗГА, РДСК. Набор состоит из емкостей: нормальная и специфическая сыворотка, нормальный и специфический антиген, а также эритроциты человека О (I) группы. For the diagnosis of HBVC, a set of components is proposed that is used in the reactions of RGA, RZHA, RDSK. The kit consists of containers: normal and specific serum, normal and specific antigen, as well as human red blood cells of the O (I) group.

Компонентный состав набора для диагностики ВГБК представлен в таблице 4. The composition of the kit for the diagnosis of HBV is presented in table 4.

Как видно из таблицы 4, специфическая и нормальная сыворотки, специфический и нормальный антигены, эритроциты человека по объему в наборе составляют от 1 до 5 см³, общего белка в специфической сыворотке от 5 до 8 кг/см³, в нормальной сыворотке от 3 до 5 мг/см³, в специфическом и нормальном антигене от 5 до 10 мг/см³, в эритроцитах человека от 2 до 4 мг/см³.As can be seen from table 4, specific and normal serum, specific and normal antigens, human erythrocytes in volume in the set are from 1 to 5 cm ³ , the total protein in specific serum is from 5 to 8 kg / cm ³ , in normal serum from 3 to 5 mg / cm ³ , in a specific and normal antigen from 5 to 10 mg / cm ³ , in human red blood cells from 2 to 4 mg / cm ³ .

Предлагаемый состав компонентов в наборе для диагностики ВГБК позволяет выявлять антиген и антитела в указанных реакциях, поставить диагноз на ВГБК в течение суток. The proposed composition of the components in the kit for the diagnosis of HBV allows to detect antigen and antibodies in these reactions, to diagnose HBV during the day.

Предложенный способ прост в исполнении, доступен и является промышленно применимым. The proposed method is simple to implement, affordable and is industrially applicable.

Claims

1 1. A method of producing specific serum for the treatment, diagnosis and prevention of rabbit viral hemorrhagic disease, comprising administering an immunizing drug followed by blood sampling and serum separation, characterized in that 14 days before administration of the immunizing drug rabbits are additionally vaccinated subcutaneously with a commercial vaccine against viral hemorrhagic rabbit diseases, and a commercial vaccine against rabbit viral hemorrhagic disease is used as an immunizing preparation, and whether the virulent virus of hemorrhagic disease of rabbits VGNKI strain 1652.2 2. A kit for the diagnosis of viral hemorrhagic disease of rabbits, including containers containing inactivated virus of hemorrhagic rabbit disease VGNKI 1652, the serum obtained according to claim 1, normal antigen, normal serum and human red blood cells.