RU2069693C1

RU2069693C1 - Strain of bacterium escherichia coli - a producer of specific dna-probe used for differentiation of toxigenic and nontoxigenic corynebacterium diphtheriae and complementary to tox99 gene determining synthesis of diphtheria toxin

Info

Publication number: RU2069693C1
Application number: RU93046076A
Authority: RU
Inventors: И.К. Мазурова; В.Л. Заикин; Н.К. Янковский; А.Г. Здановский
Original assignee: Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского
Priority date: 1993-09-23
Filing date: 1993-09-23
Publication date: 1996-11-27

Abstract

FIELD: medicine, molecular biology. SUBSTANCE: method involves nucleic acid hybridization. Invention relates to preparing strain Escherichia coli C600 r^-m^- (pABC 124 tox AB') - a producer of specific DNA-probe for differentiation of toxigenic an nontoxigenic strains of Corynebacterium diphtheriae. Strain provides high yield of plasmid DNA pABC 124 tox AB' which is used for DNA-DNA hybridization as specific probe. EFFECT: preparing strain indicated above, high yield of plasmid DNA.

Description

Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской микробиологии. The invention relates to medicine, in particular to medical microbiology.

Известно, что при лабораторной диагностике инфекционных заболеваний применяется метод ДНК-ДНК гибридизации, заключающийся в определении в исследуемом материале специфических последовательностей нуклеиновых кислот с помощью комплементарных этим последовательностям ДНК зондов (11). Метод ДНК-ДНК гибридизации со специфическими ДНК зондами сокращает время идентификации требовательных микроорганизмов, позволяет обнаруживать патогенные микроорганизмы непосредственно в клиническом материале и снижает себестоимость лабораторной диагностики инфекционных заболеваний. В зарубежной литературе имеются сведения об использовании нативных и химерных молекул ДНК или их фрагментов, часть которых представляет специфическую для tox⁺ гена дифтерийного токсина последовательность оснований, в качестве ДНК зондов при научных исследованиях [9,10] В нашей стране при конструировании штаммов-продуцентов иммунотоксинов были созданы химерные репликоны, которые были использованы или могли быть использованы как ДНК зонды при идентификации токсигенных штаммов С.diphtheriae [4,5,3] Однако редкие примеры использования химерных репликонов, несущих специфические последовательности гена дифтерийного токсина, в качестве ДНК зондов также не выходили за рамки научных исследований в основном была показана принципиальная возможность использования метода ДНК-ДНК гибридизации для выявления токсигенных штаммов С.diphtheriae [1,2] Во всех известных случаях применения нативных и химерных молекул как ДНК зондов не были определены специфические параметры (чувствительность, специфичность, прогностическая значимость положительных и отрицательных результатов) специализированного метода ДНК-ДНК гибридизации для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов С.diphtheriae, что не позволяло широко использовать этот метод, а следовательно те или иные ДНК зонды, при диагностических исследованиях.It is known that in the laboratory diagnosis of infectious diseases, the DNA-DNA hybridization method is used, which consists in determining specific nucleic acid sequences in the test material using probe probes complementary to these sequences (11). The DNA-DNA hybridization method with specific DNA probes shortens the identification time of demanding microorganisms, allows the detection of pathogenic microorganisms directly in clinical material and reduces the cost of laboratory diagnosis of infectious diseases. There is information in the foreign literature on the use of native and chimeric DNA molecules or their fragments, some of which are a base sequence specific for the tox ⁺ diphtheria toxin gene, as DNA probes for scientific research [9, 10] In our country, when constructing immunotoxin producing strains chimeric replicons were created that were used or could be used as DNA probes to identify toxigenic strains of C. diphtheriae [4,5,3] However, rare examples of the use of chimeric rep of liquids carrying specific sequences of the diphtheria toxin gene as DNA probes also did not go beyond the scope of scientific research. The principal possibility of using the DNA-DNA hybridization method to detect toxigenic C. diphtheriae strains was shown [1,2]. In all known cases of using native and chimeric molecules as DNA probes, specific parameters (sensitivity, specificity, prognostic significance of positive and negative results) of specialized DNA-DNA hybridization method for the differentiation of toxigenic and non-toxigenic C. diphtheriae strains, which did not allow widespread use of this method, and consequently certain DNA probes, for diagnostic studies.

Целью изобретения является штамм Escherichia coli C₆₀₀r^-m^- (pABC124toxAB') продуцент специфического ДНК зонда.The aim of the invention is a strain of Escherichia coli C ₆₀₀ r ^- m ^- (pABC124toxAB ') producer of specific probe DNA.

Штамм Escherichia coli C₆₀₀r^-m^- (pABC124toxAB') депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов. Справка о депонировании прилагается. Регистрационный номер 230.The strain Escherichia coli C ₆₀₀ r ^- m ^- (pABC124toxAB ') was deposited in the State collection of pathogenic microorganisms. Certificate of deposit is attached. Registration number 230.

Получение штамма. Штамм Escherichia coli C₆₀₀r^-m^- (pABC124toxAB') получен в результате СА²⁺-зависимой трансформации бактериальных клеток штамма Escherichia coli C₆₀₀thri leu6 thil supE44 LacYI tonA r^-m^- λ^- F^- изолированной ДНК плазмиды pABC124toxAB'по незначительно модифицированному методу Mandel и Higa [8] Селекция трансформантов проведена по устойчивости к ампициллину на полноценной питательной среде, содержащей 50 мкг/мл ампициллина; очистка трансформантов - три последовательных субкультивирования на той же среде. Плазмида, выделенная из устойчивых к ампициллину трансформантов, имела ту же электрофоретическую подвижность, что и исходная плазмида, то же электрофоретический рисунок при электрофорезе в агарозном геле BamH I рестриктов и давала положительный гибридизационный сигнал при ДНК-ДНК гибридизации с ДНК токсигенного штамма С.diphtheriae 665.Getting strain. The strain Escherichia coli C ₆₀₀ r ^- m ^- (pABC124toxAB ') was obtained as a result of CA ²⁺ -dependent transformation of bacterial cells of the strain Escherichia coli C ₆₀₀ thri leu6 thil supE44 LacYI tonA r ^- m ^- λ ^- F ^- isolated plasmid pABC124toxAB' DNA only slightly the modified method of Mandel and Higa [8] Selection of transformants was carried out by resistance to ampicillin in a complete nutrient medium containing 50 μg / ml ampicillin; purification of transformants — three successive subcultures on the same medium. The plasmid isolated from ampicillin-resistant transformants had the same electrophoretic mobility as the original plasmid, the same electrophoretic pattern by electrophoresis in BamH I restriction agarose gel and gave a positive hybridization signal when DNA-DNA hybridization with DNA of the toxigenic strain C. diphtheriae 665 .

Характеристика штамма. Штамм Escherichia coli C₆₀₀r^-m^- (pABC124toxAB') имеет следующие характеристики. Штамм растет на полноценной питательной среде, содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Штамм растет на минимальной питательной среде, содержащей 100 мкг/мл треонина, 100 мкг/мл лейцина, 1 мкг/мл тиамина и 50 мкг/мл ампициллина. Штамм не ферментирует лактозу. Штамм обеспечивает стабильность молекулы химерного репликона плазмида pABC124toxAB', высокий выход плазмидной ДНК при выделении ее методом щелочного лизиса и возможность использования изолированной плазмидной ДНК при ДНК-ДНК гибридизации в качестве специфического ДНК зонда и при Ca²⁺-зависимой трансформации без дополнительной очистки в градиенте хлористого цезия бромистого этидия. Плазмида pABC124toxAB' стабильна в штамме Escherichia coli C₆₀₀r^-m^- (pАВС124toxAB') при культивировании его на средах, содержащих 50 мкг/мл ампициллина, и элиминируется из бактериальных клеток этого штамма при культивировании его на средах, не содержащих ампициллин. На плазмиде pABC124toxAB' локализован ген устойчивости к ампициллину. Рестриктаза BamH I расщепляет плазмиду pABC124toxAB' на два фрагмента, меньший из которых, в основном, представляет специфическую последовательность оснований структурных генов дифтерийного токсина toxA и toxB. Тотальный препарат ДНК штамма Escherichia coli C₆₀₀r^-m^- (pABC124toxAB'), плазмидная ДНК и меньший по размерам BAmH I фрагмент плазмидной ДНК дают положительный гибридизационный сигнал при ДНК-ДНК гибридизации с ДНК токсигенного штамма C.diphtheriae 665.Characterization of the strain. The strain Escherichia coli C ₆₀₀ r ^- m ^- (pABC124toxAB ') has the following characteristics. The strain grows on a complete nutrient medium containing 50 μg / ml ampicillin. The strain grows on a minimal nutrient medium containing 100 μg / ml threonine, 100 μg / ml leucine, 1 μg / ml thiamine and 50 μg / ml ampicillin. The strain does not ferment lactose. The strain ensures the stability of the chimeric replicon molecule, plasmid pABC124toxAB ', a high yield of plasmid DNA when it is isolated by alkaline lysis, and the possibility of using isolated plasmid DNA during DNA-DNA hybridization as a specific probe DNA and in Ca ²⁺ -dependent transformation without additional purification in the gradient of chloride cesium ethidium bromide. The plasmid pABC124toxAB 'is stable in the Escherichia coli strain C ₆₀₀ r ^- m ^- (pABC124toxAB') when cultured on media containing 50 μg / ml ampicillin and is eliminated from the bacterial cells of this strain when cultured on media not containing ampicillin. An ampicillin resistance gene is located on plasmid pABC124toxAB '. The restriction enzyme BamH I cleaves the plasmid pABC124toxAB 'into two fragments, the smaller of which mainly represents the specific base sequence of the structural genes of diphtheria toxin toxA and toxB. The total DNA preparation of the strain Escherichia coli C ₆₀₀ r ^- m ^- (pABC124toxAB '), plasmid DNA and the smaller BAmH I fragment of plasmid DNA give a positive hybridization signal when DNA DNA hybridizes with the DNA of the toxigenic strain C. diphtheriae 665.

При выделении ДНК плазмиды pABC124toxAB'-специфического ДНК зонда для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов C.diphteriae штамм Escherichia coli C₆₀₀r^-m_- (pABC124toxAB') выращивают в полноценной жидкой питательной среде, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, при 37^oС в течение 18-20 ч. Бактериальные клетки осаждают и отмывают центрифугированием; плазмидную ДНК выделяют методом щелочного лизиса с последующей обработкой неочищенного препарата плазмидной ДНК хлористым литием (конечная концентрация 3М), рибонуклеазой (конечная концентрация 25 мкг/мл), протеиназой Т (конечная концентрация 1 мг/мл), депротеинизацией фенолом, смесью фенол-хлороформ и хлороформом и переосаждением этиловым спиртом [6] Выделенную плазмидную ДНК фрагментируют рестриктазой BamH I в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя фермента, и тотальный препарат плазмидной ДНК метят радиоактивной меткой методом рассеянной затравки с целью получения специфического радиоактивного ДНК зонда [7]
Параметры (чувствительность, специфичность, прогностические значения положительных и отрицательных результатов), позволяющие использовать при диагностических исследованиях специализированный метод ДНК-ДНК гибридизации для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов C.diphtheriae, при котором меченные радиоактивным изотопом препараты ДНК плазмиды pABC124toxAB'. Escherichiae coli C₆₀₀r^-m^- применяются как специфический радиоактивный ДНК зонд, были установлены при сравнительной оценке настоящего метода ДНК-ДНК гибридизации и традиционного метода выявления токсигенных штаммов реакции преципитации в агаре. Обоими методами были изучены 134 токсигенных и 125 нетоксигенных штаммов С. diphtheriae, выделенных на территории России, преимущественно во Владимирской и Пензенской областях, за период с 1986 по 1989 гг. При проведении ДНК-ДНК гибридизации бактериальные клетки изучаемых штаммов лизировали лизоцином (конечная концентрация 2 мг/мл) и додецилсульфатом натрия (конечная концентрация 1%). Лизаты бактериальных клеток последовательно обрабатывали протеиназой Т (конечная концентрация 1 мг/мл), ацетатом натрия (конечная концентрация 0,3 М), ДНК переосаждали этиловым спиртом [6] Пробы наносили на нейлоновой мембранный фильтр; обработку фильтров, ДНК-ДНК гибридизацию на мембранных фильтрах и авторадиографию проводили по модифицированному методу Бобкова с соавторами (1988) [2] Было показано, что при замене в традиционной технологии бактериологического анализа метода преципитации в агаре методом ДНК-ДНК гибридизации параметры, характеризующие настоящий метод ДНК-ДНК гибридизации с ДНК зондом pABC124toxAB', Escherichia coli C₆₀₀r^-m^-, а именно чувствительность, специфичность, прогностические значения положительных и отрицательных результатов, были соответственно равны 97, 87, 90 и 98% в случае, если слабый гибридизационный сигнал расценивается как положительный, и 97, 98% в случае, если слабый гибридизационный сигнал расценивается как отрицательный. В отличие от реакции преципитации в агаре, метод ДНК-ДНК гибридизации с ДНК зондом pABC124toxAB'. Escherichia coli C₆₀₀r^-m^- позволил выявить штаммы C.diphtheriae с дефектным геном дифтерийного токсина, то есть штаммы, не продуцирующие дифтерийный токсин. Таким образом, метод ДНК-ДНК гибридизации с ДНК зондом pABC124toxAB'. Echerichia coli C₆₀₀r^-m^- может быть использован не только при диагностических исследованиях, но и при наблюдениях за миграцией tox⁺ гена, детерминирующего синтез дифтерийного токсина и/или его фрагментов в популяциях C.diphtheriae.When plasmid DNA of the pABC124toxAB'-specific DNA probe was isolated for the differentiation of toxigenic and non-toxigenic C.diphteriae strains, the Escherichia coli strain C ₆₀₀ r ^- m _- (pABC124toxAB ') was grown in a complete liquid nutrient medium containing 50 μg / ml ampicillin at 37 ^° C within 18-20 hours. Bacterial cells are precipitated and washed by centrifugation; plasmid DNA is isolated by alkaline lysis followed by treatment of the crude plasmid DNA preparation with lithium chloride (final concentration 3M), ribonuclease (final concentration 25 μg / ml), proteinase T (final concentration 1 mg / ml), phenol deproteinization, phenol-chloroform mixture and chloroform and ethanol reprecipitation [6] The isolated plasmid DNA is fragmented with restriction enzyme BamH I in accordance with the recommendations of the enzyme manufacturer, and the total plasmid DNA preparation is labeled with a radioactive label. m scattered seed in order to obtain specific radioactive DNA probe [7]
Parameters (sensitivity, specificity, prognostic values of positive and negative results) that make it possible to use the specialized DNA-DNA hybridization method for diagnostic studies to differentiate toxigenic and non-toxigenic C. diphtheriae strains, in which pABC124toxAB 'DNA plasmid-labeled preparations are marked with a radioactive isotope. Escherichiae coli C ₆₀₀ r ^- m ^- used as a specific radioactive DNA probe, were established by a comparative assessment of the present DNA-DNA hybridization method and the traditional method for detecting toxigenic strains of the precipitation reaction in agar. Using both methods, 134 toxigenic and 125 non-toxigenic C. diphtheriae strains isolated in Russia, mainly in the Vladimir and Penza regions, were studied from 1986 to 1989. During DNA-DNA hybridization, the bacterial cells of the studied strains were lysed with lyso-cine (final concentration 2 mg / ml) and sodium dodecyl sulfate (final concentration 1%). Bacterial cell lysates were sequentially treated with proteinase T (final concentration 1 mg / ml), sodium acetate (final concentration 0.3 M), DNA was reprecipitated with ethanol [6] Samples were applied to a nylon membrane filter; filter processing, DNA-DNA hybridization on membrane filters and autoradiography were carried out according to the modified method of Bobkov et al. (1988) [2] It was shown that when traditional method of bacteriological analysis was replaced by the method of precipitation in agar using DNA-DNA hybridization, the parameters characterizing the present method DNA-DNA hybridization with the DNA probe pABC124toxAB ', Escherichia coli C ₆₀₀ r ^- m ^- , namely the sensitivity, specificity, prognostic values of positive and negative results, were respectively 97, 87, 90 and 9 8% if a weak hybridization signal is regarded as positive, and 97, 98% if a weak hybridization signal is regarded as negative. In contrast to the precipitation reaction in agar, the DNA-DNA hybridization method with pABC124toxAB 'DNA probe. Escherichia coli C ₆₀₀ r ^- m ^- revealed strains of C. diphtheriae with a defective diphtheria toxin gene, i.e. strains that do not produce diphtheria toxin. Thus, the DNA-DNA hybridization method with pABC124toxAB 'DNA probe. Echerichia coli C ₆₀₀ r ^- m ^- can be used not only for diagnostic studies, but also for monitoring the migration of the tox ⁺ gene, which determines the synthesis of diphtheria toxin and / or its fragments in populations of C. diphtheriae.

Литература:
1. Бобкова М.Р. Маркина С.С. Мазурова И.К. Бобков А.Ф. Гараев М.М. Тезисы докладов 1-й Всесоюзной конференции "Молекулярная структура бактериальных токсинов и генетический контроль их биосинтеза" 1-2 октября, 1985 г. г. Москва. стр.3-4.Literature:
1. Bobkova M.R. Markina S.S. Mazurova I.K. Bobkov A.F. Garaev M.M. Abstracts of the 1st All-Union Conference "The molecular structure of bacterial toxins and the genetic control of their biosynthesis" October 1-2, 1985, Moscow. pg. 3-4.

2. Бобков А.Ф. Бобкова М.Р. Гараев М.М. Комбарова С.Ю. Мазурова И.К. Маркина С.С. Авт. свидетельство N 4406330/30-13 от 21 марта 1988 г. 2. Bobkov A.F. Bobkova M.R. Garaev M.M. Kombarova S.Yu. Mazurova I.K. Markina S.S. Auth. Certificate N 4406330 / 30-13 dated March 21, 1988

3. Гараев М. М. Бобкова М.Р. Бобков А.Ф. Лукашевич Н.В. Казенкова Е.В. "Генетика", 1990, N 6, стр. 990-999. 3. Garaev M. M. Bobkova M. R. Bobkov A.F. Lukashevich N.V. Kazenkova E.V. Genetics, 1990, N 6, pp. 990-999.

4. Здановский А.Г. Здановская М.В. Зайцев Е.М. Свиридов В.В. Якубович Н. В. Ребентиш Б.А. Янковский Н.К. Молек.биол. 1988, т.22, N 5, стр. 1293-1300. 4. Zdanovsky A.G. Zdanovskaya M.V. Zaitsev E.M. Sviridov V.V. Yakubovich N.V. Rebentish B.A. Yankovsky N.K. Molec. Biol. 1988, v. 22, No. 5, pp. 1293-1300.

5. Ковган А.А. Жданов В.М. МЭИ, 1988, N 8, стр. 23-31. 5. Kovgan A.A. Zhdanov V.M. MPEI, 1988, N 8, pp. 23-31.

6. "Плазмиды", под редакцией Харди К. Москва, "Мир", 1990. 6. Plasmids, edited by Hardy K. Moscow, Mir, 1990.

7. Feinberg A.P. Vogelstein B. Anal. Biochem. 1984, v. 137, p. 266-267. 7. Feinberg A.P. Vogelstein B. Anal. Biochem. 1984, v. 137, p. 266-267.

8. Mandel M. Higa A. J. Mol. Biol. 1970, v.53, p. 154. 8. Mandel M. Higa A. J. Mol. Biol. 1970, v. 53, p. 154.

9. Papenheimer A.M. Murphy J.R. The Lancet, 1983, v.2, p. 923-926. 9. Papenheimer A.M. Murphy J.R. The Lancet, 1983, v. 2, p. 923-926.

10. Rappuoli R. Perugini M. Falsen E. The New England Journal of Medicine, 1988, v. 318, p. 12-14. 10. Rappuoli R. Perugini M. Falsen E. The New England Journal of Medicine, 1988, v. 318, p. 12-14.

11. Tenover F.C. Clinical Microbiology Reviews, 1988, v. 1, p. 82-101. 11. Tenover F.C. Clinical Microbiology Reviews, 1988, v. 1, p. 82-101.

Claims

The bacterial strain Escherichia coli N 230 (GISK named after L.A. Tarasevich) is a producer of a specific DNA probe used to differentiate toxigenic and non-toxigenic strains of Corynebacterium diphtheriae and a complementary tox ⁺ gene that determines the synthesis of diphtheria toxin.