RU2066996C1

RU2066996C1 - Method for producing film materials usable in ophthalmic surgery

Info

Publication number: RU2066996C1
Application number: RU93041394A
Authority: RU
Inventors: С.А. Башкатов; С.А. Лобанов; В.В. Сперанский
Original assignee: Башкирский государственный медицинский институт
Priority date: 1993-08-18
Filing date: 1993-08-18
Publication date: 1996-09-27

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: method involves carefully washing up umbilical cords received from female donors checked for absence of syphilis infection, AIDS human virus infection or hepatitis infection from blood, freezing, homogenizing, pouring over with caustic sodium solution and retaining for 7 days at 18-24 C under constant stirring. Then it is centrifuged, the sediment is removed, the supernatant is neutralized with hydrochloric acid, trichloracetic acid is added, the mixture is stirred and centrifuged in 1 h. The sediment is removed, the supernatant is neutralized with caustic sodium, ethanol is added and retained for 24 h at 4 C. Next to it, centrifuging is carried out, the supernatant is removed, the sediment is dissolved in distilled water and dialyzed against distilled water during 22-26 h at 4 C. The dialysis being finished, the solution is poured into flask with round bottom, water is removed and the product is dried until the weight is constant. The so obtained colorless powder is placed into glass container. 0.1-0.5 ml of distilled water is added. Viscous transparent colloid solution is formed and dried in drying dust-proof cabinet during 48 h at 18-24 C. The finished film material is sterilized with gamma radiation. EFFECT: no changes in optical properties when applied to corneal surface.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно офтальмохирургии, и может быть использовано для коррекции репаративной регенерации роговицы. The invention relates to medicine, namely to ophthalmic surgery, and can be used to correct reparative regeneration of the cornea.

В настоящее время в мировой практике в офтальмологии среди всех случаев патологии глаза прослеживается чрезвычайно высокая встречаемость (22-38%) повреждений роговой оболочки глаз, связанных с механическими травмами, ожогами, последствиями хирургических вмешательств (С.Н. Федоров и др. 1992; Г. Е. Венгер, 1992). Currently, in world practice in ophthalmology, among all cases of eye pathology, an extremely high occurrence (22-38%) of injuries of the cornea of the eyes associated with mechanical injuries, burns, and the consequences of surgical interventions is observed (S.N. Fedorov et al. 1992; D E. Wenger, 1992).

В настоящее время отечественная и зарубежная медицина не располагают пленочными материалами, являющимися эффективными корректорами репаративной регенерации тканей глаза. Известен способ получения препарата "геалон" фирмы "Фармация", представляющий собой 1%-ный раствор натриевой соли гиалуроновой кислоты, предназначенный для интраокулярного введения, близкий по химической структуре к полученному нами пленочному материалу (D.A. Swan Studies on Hyaluronic Acid // Biochim. Biophys. Acta, 1968, v. 156, p. 17-30). At present, domestic and foreign medicine does not have film materials, which are effective correctors for the reparative regeneration of eye tissues. A known method of obtaining the drug "gealon" company "Pharmacy", which is a 1% solution of sodium salt of hyaluronic acid, intended for intraocular administration, close in chemical structure to the film material we obtained (DA Swan Studies on Hyaluronic Acid // Biochim. Biophys Acta, 1968, v. 156, p. 17-30).

Способ получения натриевой соли гиалуроновой кислоты заключается в следующем: ткань петушиных гребешков измельчают, осушивают ацетоном, экстрагируют дистиллированной водой, центрифугируют, проводят солевую обработку, осаждают тремя объемами этанола, очищают хлороформом, хроматографией и цитилпиридинхлоридом. The method of obtaining the sodium salt of hyaluronic acid is as follows: the fabric of cocks is crushed, dried with acetone, extracted with distilled water, centrifuged, saline is carried out, precipitated with three volumes of ethanol, purified with chloroform, chromatography and citylpyridinium chloride.

Прототипом настоящего изобретения является коллагеновое покрытие (С.Н. Федоров, С. Н. Багров, Т.С. Амсиславская и др. Способ изготовления коллагенового покрытия для использования в офтальмологии. А. с. N 1321420 от 07.07.1987, Бюл. N 25), которое получают из склеры глаз свиньи. Склеру глаз свиньи подвергают щелочно-солевой обработке, нейтрализуют, промывают и растворяют в уксусной кислоте. Полученный раствор разливают на матрицы для формования, проводят воздушную сушку и гамма-стерилизацию. The prototype of the present invention is a collagen coating (S. N. Fedorov, S. N. Bagrov, T. Amsislavskaya and others. A method of manufacturing a collagen coating for use in ophthalmology. A. S. N 1321420 from 07.07.1987, Bull. N 25), which is obtained from the sclera of the pig’s eyes. The sclera of the pig’s eyes is subjected to alkaline-salt treatment, neutralized, washed and dissolved in acetic acid. The resulting solution is poured onto molding matrices, air drying and gamma sterilization are carried out.

Недостатками прототипа являются: негомологичность тканям человека (коллагеновые покрытия получают из склеры глаз свиньи); относительно низкая прозрачность по сравнению с роговицей; стимуляция лишь отдельных этапов репаративной регенерации (в основном фибриллогенеза); трудоемкость при заборе сырья (препарирование вручную глаз свиньи, выделение и очистка склер от прилегающих тканей), ведущая к большим затратам рабочего времени и удорожанию конечного продукта. The disadvantages of the prototype are: the inhomology of human tissues (collagen coatings are obtained from the sclera of the pig’s eyes); relatively low transparency compared with the cornea; stimulation of only certain stages of reparative regeneration (mainly fibrillogenesis); the complexity of the collection of raw materials (manual preparation of the pig’s eyes, isolation and cleaning of the sclera from adjacent tissues), which leads to high costs of working time and cost of the final product.

Целью изобретения является повышение прозрачности пленочных материалов и стимуляция репаративной регенерации в роговице. The aim of the invention is to increase the transparency of film materials and stimulate reparative regeneration in the cornea.

Способ изготовления пленочного материала из гликозаминогликанов для офтальмохирургии осуществляется следующим образом:
Пупочные канатики, полученные от женщин-доноров, проверенных на инфицирование сифилисом, вирусом ВИЧ-инфекции и гепатита, тщательно отмывают от крови, замораживают, гомогенизируют, заливают 2 М раствором едкого натра в соотношении 1 2 (вес/объем), оставляют на 7 сут при 18-24^oC и постоянном перемешивании. Центрифугируют при 3000 G в течение 30 мин, осадок отбрасывают, супернатант нейтрализуют соляной кислотой до pН 6,8-7,2, добавляют трихлоруксусную кислоту до концентрации 5% перемешивают, через 1 час центрифугируют при 3000 G. Осадок отбрасывают, супернатант нейтрализуют едким натром до pН 6,8-7,2, добавляют два объема 95%-ного этанола, оставляют на 24 ч при 4^oC. Центрифугируют 30 мин при 3000 G, супернатант отбрасывают, осадок растворяют в дистиллированной воде, диализуют против дистиллированной воды в течение 22-26 ч при 4^oC. После диализа раствор помещают в круглодонную колбу, воду отгоняют под вакуумом при 37-42^oС, продукт досушивают до постоянного веса при тех же условиях. Полученный бесцветный порошкообразный продукт вносят в стеклянную форму, добавляют 0,1-0,5 мл дистиллированной воды, при этом образуется вязкий прозрачный коллоидный раствор, который сушат в пылезащищенном сушильном шкафу 48 ч при 18-24^oС.A method of manufacturing a film material from glycosaminoglycans for ophthalmic surgery is as follows:
Umbilical cords obtained from female donors tested for infection with syphilis, HIV and hepatitis virus, are thoroughly washed from the blood, frozen, homogenized, filled with 2 M sodium hydroxide solution in the ratio of 1 2 (weight / volume), left for 7 days at 18-24 ^o C and constant stirring. It is centrifuged at 3000 G for 30 min, the precipitate is discarded, the supernatant is neutralized with hydrochloric acid to pH 6.8-7.2, trichloroacetic acid is added to a concentration of 5%, stirred, after 1 hour centrifuged at 3000 G. The precipitate is discarded, the supernatant is neutralized with sodium hydroxide. to pH 6.8-7.2, add two volumes of 95% ethanol, leave for 24 hours at 4 ^o C. Centrifuge for 30 minutes at 3000 G, discard the supernatant, dissolve the precipitate in distilled water, dialyze against distilled water for 22-26 hours at 4 ^o C. After dialysis solution is placed in a circle Odón flask, water was distilled off in vacuo at 37-42 ^o C, the product is finally dried to constant weight under the same conditions. The resulting colorless powdery product is introduced into a glass form, 0.1-0.5 ml of distilled water is added, and a viscous transparent colloidal solution is formed, which is dried in a dustproof oven for 48 hours at 18-24 ^° C.

Готовые пленочные материалы из гликозаминогликанов стерилизуют гамма-излучением в дозе 2,5 МРад и мощности 0,5 МРад/ч. Finished film materials from glycosaminoglycans are sterilized with gamma radiation at a dose of 2.5 Mrad and a power of 0.5 Mrad / h.

Пример 1. 1 кг отмытых пупочных канатиков человека замораживают при -20^oC, гомогенизируют, заливают 2 л 2 М раствора едкого натра, оставляют 7 сут при 20^oС и постоянном перемешивании. Центрифугируют 30 мин при 3000 G, осадок отбрасывают, супернатант нейтрализуют соляной кислотой до pН 7,0, добавляют трихлоруксусную кислоту до концентрации 5% перемешивают, через 1 ч центрифугируют при 3000 G, осадок отбрасывают, супернатант нейтрализуют едким натром до pН 7,0, добавляют два объема 95%-ного этанола, оставляют на 24 ч при 4^oC. Центрифугируют 30 мин при 3000 G, супернатант отбрасывают, осадок растворяют в дистиллированной воде и диализуют против дистиллированной воды при 4^oC. После диализа раствор помещают в круглодонную колбу объемом 2 л, воду отгоняют под вакуумом при 40^oC, продукт досушивают до постоянного веса при тех же условиях. Получают 1,5 г гликозаминогликанов - бесцветного порошкообразного продукта. По 75 мг продукта вносят в стеклянные формы, имеющие профиль внешней оболочки глаза, добавляют по 0,1 мл дистиллированной воды с образованием прозрачного коллоида, сушат в пылезащищенном сушильном шкафу 48 ч при 20^oC. Готовые пленочные материалы стерилизуют гамма-излучением в дозе 2,5 МРад и мощности 0,5 МРад/ч.Example 1. 1 kg of washed umbilical cord of a person is frozen at -20 ^o C, homogenized, pour 2 l of 2 M sodium hydroxide solution, leave for 7 days at 20 ^o C with constant stirring. It is centrifuged for 30 min at 3000 G, the precipitate is discarded, the supernatant is neutralized with hydrochloric acid to pH 7.0, trichloroacetic acid is added to a concentration of 5%, stirred, after 1 h, centrifuged at 3000 G, the precipitate is discarded, the supernatant is neutralized with sodium hydroxide to pH 7.0, add two volumes of 95% ethanol, leave for 24 h at 4 ^o C. Centrifuged for 30 min at 3000 G, discard the supernatant, the residue is dissolved in distilled water and dialyzed against distilled water at 4 ^o C. After dialysis, the solution is placed in a round bottom flask 2 liter water was distilled under vacuum at 40 ^o C, product was finally dried to constant weight under the same conditions. 1.5 g of glycosaminoglycans, a colorless powdery product, are obtained. 75 mg of the product is introduced into glass forms having the profile of the outer shell of the eye, 0.1 ml of distilled water is added to form a transparent colloid, dried in a dustproof oven for 48 hours at 20 ^o C. Finished film materials are sterilized with gamma radiation at a dose of 2 , 5 mrad and power of 0.5 mrad / h.

В эксперименте на лабораторных животных показана нетоксичность пленочного материала из гликозаминогликанов (ЛД₅₀ > 5 г/кг при введении в желудок крысам, что позволяет отнести материал к IV классу опасности веществ "мало токсичные и мало опасные", признаки интоксикации отсутствуют при внутривенном введении кроликам в дозе 10 мг/кг). Аллергические реакции отсутствуют при аппликации материала на роговицу кроликам и на модели аллергического контактного дерматита, воспроизведенного на морских свинках. Также не обнаружено по сравнению с биологическим контролем изменений со стороны биохимических и морфологических показателей при ежедневном в течение 24 сут эпикутанном нанесении пленочного материала из гликозаминогликанов морским свинкам. Выявлена стимуляция репаративной регенерации под воздействием пленочного материала на моделях кожных резаных ран у крыс, экспериментальных непроникающих повреждениях роговицы и кератотомии у кроликов. Восстановление полноценного дифференцированного эпителия наблюдалось во всех случаях.In an experiment in laboratory animals, non-toxicity of the film material from glycosaminoglycans (LD ₅₀ > 5 g / kg when injected into the stomach of rats was shown, which makes it possible to classify the material as “low toxic and low hazard” substances into the IV hazard class, there are no signs of intoxication when administered to rabbits intravenously dose of 10 mg / kg). Allergic reactions are absent in the application of material to the cornea to rabbits and in the model of allergic contact dermatitis reproduced in guinea pigs. Also, compared with the biological control, no changes were observed from the side of biochemical and morphological indices during the daily epicutaneous application of the film material from glycosaminoglycans to guinea pigs for 24 days. The stimulation of reparative regeneration under the influence of film material was revealed on models of cut skin wounds in rats, experimental non-penetrating lesions of the cornea and keratotomy in rabbits. Recovery of a full differentiated epithelium was observed in all cases.

Гистологические и электронно-микроскопические исследования кожи и роговицы после проведенного лечения доказывают полное восстановление дифференцированного эпителия и стромы тканей к 10-12 сут эксперимента. Histological and electron microscopic studies of the skin and cornea after treatment prove complete restoration of differentiated epithelium and tissue stroma by the 10-12 day of the experiment.

Предлагаемый пленочный материал при аппликации на роговицу не изменяет ее оптические свойства и обладает выраженным репаративным эффектом для ткани роговицы. The proposed film material when applied to the cornea does not change its optical properties and has a pronounced reparative effect for corneal tissue.

Предлагаемый способ изготовления пленочного материала из гликозаминогликанов технологичен, не требует дорогостоящего оборудования и реактивов, обладает по сравнению с прототипом следующими преимуществами: гомологичность тканям человека; прозрачность материала при аппликации идентична роговице; стимуляция всех этапов репаративной регенерации (пролиферации и дифференциации); дешевизна сырья, меньшая трудоемкость при его заборе и предварительной обработке. The proposed method of manufacturing a film material from glycosaminoglycans is technologically advanced, does not require expensive equipment and reagents, has the following advantages compared to the prototype: homology to human tissues; the transparency of the material during application is identical to the cornea; stimulation of all stages of reparative regeneration (proliferation and differentiation); low cost of raw materials, less laborious for its collection and pre-processing.

Claims

A method of manufacturing a film material for ophthalmic surgery by tissue homogenization, alkaline treatment, neutralization, dialysis, drying, characterized in that human umbilical cords are used as raw materials, protein impurities are removed by alkaline hydrolysis, followed by trichloroacetic acid treatment, glycosaminoglycans are precipitated with two volumes of ethanol, drying is carried out under vacuum, Packed in glass forms, add distilled water, dried to form a transparent film.