RU2066197C1 - Method of pulmonary surfactant preparing - Google Patents
Method of pulmonary surfactant preparing Download PDFInfo
- Publication number
- RU2066197C1 RU2066197C1 RU95103259A RU95103259A RU2066197C1 RU 2066197 C1 RU2066197 C1 RU 2066197C1 RU 95103259 A RU95103259 A RU 95103259A RU 95103259 A RU95103259 A RU 95103259A RU 2066197 C1 RU2066197 C1 RU 2066197C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- surfactant
- amniotic fluid
- organic solvents
- minutes
- supernatant
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к получению лекарственных препаратов, и может найти применение в промышленном производстве природных легочных сурфактантов. The invention relates to medicine, namely to the production of drugs, and may find application in the industrial production of natural pulmonary surfactants.
Легочный сурфактант представляет собой природный комплекс веществ, состоящий из фосфолипидов, нейтральных липидов и сурфактант-ассоциированных белков. Он синтезируется в эпителиальных клетках легкого (альвеолоциты II типа) и экстретируется ими на внутреннюю поверхность легких, создавая таким образом высокоспецифическую легочную "смазку". Сурфактант покрывает поверхность альвеолярного эпителия и, обладая способностью резко снижать поверхностное натяжение, предотвращает коллапс альвеол в конце выдоха. Pulmonary surfactant is a natural complex of substances consisting of phospholipids, neutral lipids and surfactant-associated proteins. It is synthesized in lung epithelial cells (type II alveolocytes) and is extruded by them onto the inner surface of the lungs, thus creating a highly specific pulmonary “lubricant”. Surfactant covers the surface of the alveolar epithelium and, having the ability to sharply reduce surface tension, prevents the collapse of the alveoli at the end of exhalation.
Известно, что основной причиной синдрома дыхательных pасстройств новорожденных, в особенности недоношенных, является недостаточность системы легочного сурфактанта. По этой причине до начала 90-х годов в развитых странах Запада умирало, а в России и в настоящее время погибает около половины недоношенных детей или около 15 20 тысяч детей ежегодно. Кроме того, те новорожденные, которые выживают после развития у них синдрома дыхательных расстройств, из-за применения в их лечении искусственной вентиляции легких с использованием газовых смесей с высоким (более 60%) содержанием кислорода впоследствии страдают тяжелыми хроническими заболеваниями легких, причиной которых является бронхо-легочная дисплазия. It is known that the main cause of respiratory distress syndrome in newborns, especially premature infants, is the failure of the pulmonary surfactant system. For this reason, before the beginning of the 90s in the developed countries of the West, about half of premature babies or about 15 20 thousand children die every year in developed Western countries. In addition, those newborns who survive after the development of respiratory distress syndrome due to the use of artificial ventilation in their treatment using gas mixtures with a high (more than 60%) oxygen content subsequently suffer from severe chronic lung diseases caused by bronchus pulmonary dysplasia.
Легочный сурфактант является единственным и чрезвычайно эффективным средством профилактики и лечения синдрома дыхательных расстройств и бронхо-легочной дисплазии новорожденных детей. Pulmonary surfactant is the only and extremely effective means of preventing and treating respiratory distress syndrome and bronchopulmonary dysplasia in newborns.
Применение такого рода препаратов в последние годы в экономически развитых странах позволило резко (на 60 90%) снизить смертность недоношенных новорожденных. В нашей стране легочные сурфактанты не производятся и из-за дороговизны не закупаются, а потому практически не используются. The use of such drugs in recent years in economically developed countries has dramatically (60 90%) reduce the mortality of premature infants. In our country, pulmonary surfactants are not produced and are not purchased due to the high cost, and therefore are practically not used.
В мировой медицинской практике применяют как синтетические и полусинтетические, так и природные легочные сурфактанты. Считают, что синтетические сурфактанты менее эффективны, хотя они безусловно более доступны. В то же время эти препараты в отличие от природных не содержат чрезвычайно важных для их свойств сурфактант-ассоциированных белков. In world medical practice, both synthetic and semi-synthetic, as well as natural pulmonary surfactants are used. Synthetic surfactants are believed to be less effective, although they are certainly more affordable. At the same time, these drugs, unlike natural ones, do not contain surfactant-associated proteins that are extremely important for their properties.
Предлагаемый способ относится к получению природного легочного сурфактанта, в частности сурфактанта человека. The proposed method relates to the production of natural pulmonary surfactant, in particular human surfactant.
Наиболее близким к нему является способ получения легочного сурфактанта из амниотической жидкости рожениц [1] взятый в качестве прототипа. Эта работа является единственной, посвященной получению легочного сурфактанта человека из амниотической жидкости рожениц. Closest to it is a method of producing pulmonary surfactant from the amniotic fluid of women in labor [1] taken as a prototype. This work is the only one devoted to the production of human pulmonary surfactant from the amniotic fluid of women in labor.
Способ заключается во взятии амниотической жидкости при проведении Кесарева сечения. Жидкость центрифугируют при 150 g в течение 10 мин, а полученный супернатант подвергают центрифугированию при 7500 g в течение 90 мин. Осадок ресуспендируют в физиологическом растворе, наносят на ступенчатый градиент 0,55 0,27 М сахарозы в 0,15 М хлориде натрия и центрифугируют при 1000000 g в течение 90 мин. Интерфазу, расположенную между двумя сахарозными слоями, забиpают, продавливают через нейлоновый фильтр с диаметром пор 20 мкм и разводят дистиллированной водой. Сурфактант осаждают центрифугированием при 7500 g в течение 120 мин и из-за его очень высокой вязкости продавливают ресуспендированный материал через тот же фильтp еще раз и снова центрифугируют. С осадком процедуру повторяют еще раз. The method consists in taking amniotic fluid during Caesarean section. The liquid is centrifuged at 150 g for 10 minutes, and the resulting supernatant is centrifuged at 7500 g for 90 minutes. The precipitate was resuspended in physiological saline, applied to a step gradient of 0.55 0.27 M sucrose in 0.15 M sodium chloride and centrifuged at 1,000,000 g for 90 minutes. The interphase located between the two sucrose layers is withdrawn, forced through a nylon filter with a pore diameter of 20 μm and diluted with distilled water. The surfactant is precipitated by centrifugation at 7500 g for 120 minutes and, due to its very high viscosity, the resuspended material is forced through the same filter again and centrifuged again. With the precipitate, the procedure is repeated again.
Полученный этим способом препарат содержит 80,7% фосфолипидов, 9,4% нейтральных липидов и 5,4% белка. The preparation obtained by this method contains 80.7% phospholipids, 9.4% neutral lipids and 5.4% protein.
Такой состав характерен для природного легочного сурфактанта. Наличие указанного количества белка свидетельствует о присутствии в нем как гидрофобных, так и гидрофильных сурфактант-ассоциированных белков. Эти белки существенны для проявления функциональных свойств легочного сурфактанта. This composition is characteristic of natural pulmonary surfactant. The presence of the indicated amount of protein indicates the presence in it of both hydrophobic and hydrophilic surfactant-associated proteins. These proteins are essential for the manifestation of the functional properties of pulmonary surfactant.
Вместе с тем, высокая вязкость препарата, вынуждающая авторов для ее уменьшения проводить трехкратное продавление суспензии через нейлоновый фильтр с диаметром пор 20 мкм, свидетельствует, как нами показано, о присутствии в препарате значительного количества ДНК (0,06 0,2 мг/мг фосфолипидов), что в настоящее время считается абсолютно недопустимым. At the same time, the high viscosity of the preparation, forcing the authors to perform a three-fold pushing of the suspension through a nylon filter with a pore diameter of 20 μm, indicates, as we have shown, the presence of a significant amount of DNA in the preparation (0.06 0.2 mg / mg phospholipids ), which is currently considered absolutely unacceptable.
Как свидетельствует описание способа выделения сурфактанта по прототипу, он чрезвычайно трудоемок, сложен и длителен. Шесть процедур центрифугирования, причем 5 из них длительного (90 120 мин), в том числе ультрацентрифугирование, а также многократное переосаждение с упомянутым промежуточным продавливанием через фильтры для снижения вязкости продукта делают способ нетехнологичным, а продукт чрезвычайно дорогим. Такой способ безусловно не может лечь в основу промышленного производства сурфактанта. Следует еще раз подчеркнуть, что получаемый при этом продукт содержит ДНК. As evidenced by the description of the method for isolating surfactant according to the prototype, it is extremely laborious, complex and time consuming. Six centrifugation procedures, 5 of which are long (90-120 min), including ultracentrifugation, as well as multiple reprecipitation with the mentioned intermediate forcing through filters to reduce the viscosity of the product, make the method non-technological and the product extremely expensive. This method certainly can not form the basis of the industrial production of surfactant. It should be emphasized once again that the resulting product contains DNA.
Технический результат изобретения состоит в упрощении способа получения сурфактанта и улучшении его качества. The technical result of the invention is to simplify the method of producing surfactant and improve its quality.
Этот результат достигается тем, что в известном способе получения легочного сурфактанта путем взятия амниотической жидкости и центрифугировании ее при 150 g в течение 10 мин амниотическую жидкость берут в родах, полученный при ее центрифугировании супернатант замораживают, затем оттаивают при температуре не выше +10o С, после чего суспензию центрифугируют, полученный осадок экстрагируют органическими растворителями, экстракт обрабатывают водно-солевыми растворами, после чего из него удаляют органические растворители до получения целевого продукта.This result is achieved in that in the known method for producing pulmonary surfactant by taking amniotic fluid and centrifuging it at 150 g for 10 min, the amniotic fluid is taken in childbirth, the supernatant obtained by centrifugation is frozen, then thawed at a temperature not exceeding + 10 o С, after which the suspension is centrifuged, the resulting precipitate is extracted with organic solvents, the extract is treated with water-salt solutions, after which organic solvents are removed from it to obtain the desired of the product.
Целесообразно центрифугирование суспензии, полученной после замоpаживания и оттаивания супернатанта, проводить при 3000 15000 g в течение 20 30 мин или проточно, экстракцию полученного осадка проводить смесями хлороформа и метилового спирта в соотношениях 2:1 (об/об) по Фолчу [2] или 1:1 по Блайю и Дайеру [3] а в качестве водно-солевых растворов использовать 0,1% раствор хлоридов натрия или калия в соотношениях экстракт:водно-солевой раствор 10:2 (об/об) при экстракции по Фолчу или 10:4,5 при экстракции по Блайю и Дайеру. It is advisable to centrifuge the suspension obtained after freezing and thawing of the supernatant, to carry out at 3000-15000 g for 20 30 minutes or flow, extraction of the resulting precipitate is carried out with mixtures of chloroform and methyl alcohol in the ratio 2: 1 (v / v) according to Folch [2] or 1 : 1 according to Blyay and Dyer [3] and as a water-salt solutions use a 0.1% solution of sodium or potassium chlorides in the ratios of extract: water-salt solution of 10: 2 (v / v) during extraction according to Folch or 10: 4 , 5 during extraction according to Blyay and Dyer.
Использование для получения сурфактанта амниотической жидкости, взятой в родах, значительно упрощает получение исходного сырья и делает его доступным. The use of amniotic fluid taken in childbirth to obtain a surfactant significantly simplifies the production of feedstock and makes it available.
Получение таким способом большого количества амниотической жидкости поставило перед нами задачу ее хранения. Для этой цели мы использовали замораживание. При оттаивании мы заметили появление хлопьевидного осадка. Отделив его центрифугированием, мы обнаружили, что в супернатанте содержатся лишь следы сурфактанта. Это побудило нас исследовать осадок и оказалось, что он представляет собой более чем на 90% легочный сурфактант. Этот неожиданный факт позволил избежать трудоемких и длительных процедур выделения искомого продукта, включая ультрацентрифугирование, применяемых для этих целей в известном способе и ранее нами. Obtaining in this way a large amount of amniotic fluid posed the problem of its storage. For this purpose, we used freezing. When thawing, we noticed the appearance of a flocculent precipitate. Separating it by centrifugation, we found that the supernatant contained only traces of surfactant. This prompted us to investigate the sediment and it turned out that it represents more than 90% pulmonary surfactant. This unexpected fact allowed us to avoid time-consuming and lengthy procedures for the isolation of the desired product, including ultracentrifugation, used for these purposes in a known manner and previously by us.
Как известно, ультрацентрифугирование, например, позволяет одновременно обрабатывать не более 1 1,5 л жидкости в течение часа. Обнаруженная агрегация сурфактанта позволила нам впервые использовать для его выделения низкоскоростное центрифугирование, а практически полное осаждение сурфактанта в этих условиях и отсутствие его в супернатате позволило использовать проточное центрифугирование со скоростью обработки амниотической жидкости до 10 л в час. Это привело к значительному упрощению способа, сделало его высокотехнологичным и при предложенном источнике сырья сделало способ пригодным для использования его в промышленном производстве. As you know, ultracentrifugation, for example, allows you to simultaneously process no more than 1 1.5 liters of fluid for an hour. The observed aggregation of surfactant made it possible for the first time to use low-speed centrifugation to isolate it, and the almost complete precipitation of surfactant under these conditions and its absence in the supernatate made it possible to use flow centrifugation with an amniotic fluid treatment rate of up to 10 l per hour. This led to a significant simplification of the method, made it high-tech and with the proposed source of raw materials made the method suitable for use in industrial production.
Кроме того, обнаруженные нами условия агрегации сурфактанта, а именно замораживание и последующее оттаивание супернатанта при температуре не выше +10oС, обеспечивают в таких мягких условиях сохранность его природных свойств, а возможность использования низкоскоростного центрифугирования приводит, несомненно, к значительно меньшему соосаждению вместе с сурфактантом балластных белков, что улучшает качество конечного продукта.In addition, the conditions of surfactant aggregation that we discovered, namely, freezing and subsequent thawing of the supernatant at a temperature of no higher than + 10 o С, ensure the preservation of its natural properties under such mild conditions, and the possibility of using low-speed centrifugation undoubtedly leads to significantly less coprecipitation together with ballast protein surfactant, which improves the quality of the final product.
Экстрагирование органическими растворителями полученного центрифугированием осадка и последующая обработка экстракта водно-солевыми растворами создают условия перехода оставшихся в осадке балластных белков и ДНК в водную фазу, что освобождает экстракт с целевым продуктом от примесей и в еще большей степени повышает его качество. Причем предлагаемые нами смеси органических растворителей с экстракцией по Фолчу (хлороформ: метанол 2:1) (об/об) или по Блайю и Дайеру (хлороформ:метанол 1:1) (об/об), обеспечивая высокое качество искомого продукта, наиболее доступны, что также является важным для использования способа в промышленном производстве. The extraction of the precipitate obtained by centrifugation with organic solvents and the subsequent treatment of the extract with water-salt solutions create the conditions for the transfer of the remaining ballast proteins and DNA into the aqueous phase, which frees the extract with the target product from impurities and further improves its quality. Moreover, the mixtures of organic solvents we offer with extraction according to Folch (chloroform: methanol 2: 1) (v / v) or according to Blyay and Dyer (chloroform: methanol 1: 1) (v / v), ensuring the high quality of the desired product, are most available , which is also important for using the method in industrial production.
Использование водно-солевых растворов в виде 0,1% растворов хлорида натрия или калия в указанных соотношениях, как нами показано, позволяет исключить потери фосфолипидов сурфактанта и удалять нелипидные примеси из искомого продукта, что обеспечивает его высокое качество. The use of water-salt solutions in the form of 0.1% sodium or potassium chloride solutions in the indicated proportions, as we have shown, allows us to exclude the loss of surfactant phospholipids and remove non-lipid impurities from the desired product, which ensures its high quality.
Пример 1. Роженице по строгим акушерским показаниям производят вскрытие околоплодного пузыря, в который вводят полиэтиленовый стерильный катетер и через него забирают амниотическую жидкость. Первые 10 мл амниотической жидкости выбрасывают, последующие 500 мл собирают в стерильную посуду и центрифугируют при 150 g в течение 10 мин. Полученный супернатант замораживают при -20oС в течение 60 мин, после чего оттаивают при 4oС. Полученную суспензию центрифугируют при 3000 g в течение 20 мин на центрифуге РС-6 при +4oC. Полученный осадок экстрагируют по Блайю и Дайеру [3] Для этого его ресуспендируют в 20 мл дистиллированной воды, добавляют 75 мл смеси из 25 мл хлороформа и 50 мл метанола и перемешивают в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого добавляют 25 мл хлороформа и 25 мл 0,18% раствора хлорида калия (т.е. конечное соотношение в смеси хлороформа и метанола составляло 1: 1 соотношение объема экстракта и 0,1% раствора хлорида калия 10: 4,5). Суспензию перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре и центрифугируют при 600 g в течение 20 мин. Из образовавшейся двуфазной системы верхнюю фазу отбрасывают, а нижнюю отбирают и удаляют из нее органические растворители под вакуумом на ротационном испарителе RVO-64 при температуре 37oС. Сухой остаток ресуспендируют в 20 мл дистиллированной воды и лиофилизируют.Example 1. A woman in labor, according to strict obstetric indications, opens an amniotic fluid into which a sterile polyethylene catheter is inserted and an amniotic fluid is taken through it. The first 10 ml of amniotic fluid is discarded, the next 500 ml are collected in a sterile dish and centrifuged at 150 g for 10 minutes. The resulting supernatant was frozen at -20 ° C. for 60 minutes, then thawed at 4 ° C. The resulting suspension was centrifuged at 3,000 g for 20 minutes on a PC-6 centrifuge at + 4 ° C. The resulting precipitate was extracted according to Blyay and Dyer [ 3] For this, it is resuspended in 20 ml of distilled water, 75 ml of a mixture of 25 ml of chloroform and 50 ml of methanol are added and stirred for 1 h at room temperature. After this, 25 ml of chloroform and 25 ml of a 0.18% potassium chloride solution are added (i.e., the final ratio in the mixture of chloroform and methanol was 1: 1, the ratio of the volume of the extract and the 0.1% potassium chloride solution was 10: 4.5). The suspension is stirred for 30 minutes at room temperature and centrifuged at 600 g for 20 minutes. From the resulting two-phase system, the upper phase is discarded, and the lower phase is removed and organic solvents are removed from it under vacuum on a RVO-64 rotary evaporator at a temperature of 37 o C. The dry residue is resuspended in 20 ml of distilled water and lyophilized.
Получено 50 мг белого с кремоватым оттенком цвета аморфного порошка. Received 50 mg of a white with a creamy tint amorphous powder.
Результаты анализа:
Фосфолипиды 46,9 мг
Нейтральные липиды 2,1 мг
Белок 1,0 мг
Анализ продукта на содержание липидного фосфора проводился по Васьковскому [4] содержание белка определяли по методу Лоури после делипидизации материала хроматографией в тонком слое силикагеля. Анализ спектра белков с помощью электрофореза в ПАГ в присутствии мочевины и додецилсульфата натрия [5] выявил группы белков с м.м. 18 кДа и 5 8 кДа. Эти гидрофильные белки специфичны для природного легочного сурфактанта. Других белков не обнаружено. Анализ на содержание ДНК по Бартону [6] отрицательный.Analysis Results:
Phospholipids 46.9 mg
Neutral lipids 2.1 mg
Protein 1.0 mg
The analysis of the product for the content of lipid phosphorus was carried out according to Vaskovsky [4] the protein content was determined by the Lowry method after delipidization of the material by chromatography in a thin layer of silica gel. Analysis of the protein spectrum by electrophoresis in PAG in the presence of urea and sodium dodecyl sulfate [5] revealed groups of proteins with m.m. 18 kDa and 5 8 kDa. These hydrophilic proteins are specific for natural pulmonary surfactant. No other proteins were found. The analysis for DNA content according to Barton [6] is negative.
Подлинность препарата подтверждена по ВФС Положительным пенным тестом, а также исследованием фосфолипидного состава с помощью двумерной тонкослойной хроматографии на силикагеле в системах: хлороформ метанол 7N NH3 (65:25:5) и хлороформ ацетон метанолуксусная кислота вода (30:40:10:10:5). Содержание отдельных классов фосфолипидов препарата белка и ДНК представлено в табл.1 в сравнении с прототипом [1]
Как видно из таблицы, в отличие от прототипа, полученный препарат сурфактанта лучшего качества, а именно в нем отсутствует ДНК, он содержит значительно меньше белка (2,0 против 5,4), причем это только гидрофобные сурфактант-ассоциированные белки, необходимые для проявления его функции. Анализ содержания отдельных классов фосфолипидов показывает сходство с прототипом и соответствует составу легочного сурфактанта человека.The authenticity of the drug was confirmed by VFS Positive foam test, as well as the study of phospholipid composition using two-dimensional thin-layer chromatography on silica gel in the systems: chloroform methanol 7N NH 3 (65: 25: 5) and chloroform acetone methanolacetic acid water (30: 40: 10: 10 :5). The content of individual classes of phospholipids of the protein and DNA preparation is presented in table 1 in comparison with the prototype [1]
As can be seen from the table, in contrast to the prototype, the obtained surfactant preparation of better quality, namely, it lacks DNA, it contains significantly less protein (2.0 vs. 5.4), and these are only hydrophobic surfactant-associated proteins necessary for manifestation its function. Analysis of the content of individual classes of phospholipids shows similarities with the prototype and corresponds to the composition of human pulmonary surfactant.
Подлинность препарата подтверждена также исследованием терапевтической активности. The authenticity of the drug is also confirmed by a study of therapeutic activity.
После интратрахеального введения собакам с моделью сурфактант-дефицитного синдрома дыхательных расстройств полученного препарата в дозе 15 мг/кг массы уже через 15 мин после введения обнаружено увеличение парциального напряжения кислорода в артериальной крови и насыщения гемоглобина кислородом, а также снижение парциального напряжения углекислого газа в артериальной крови. Через сутки после введения препарата у собак не было одышки, были нормальные параметры газов крови и отсутствовали патологические изменения на рентгенограммах грудной клетки (нормальная воздушность легких без ателектазов), а их поведение и состояние не отличалось от здоровых. Собаки с той же моделью синдрома дыхательных расстройств, не получавшие препарата, характеризовалась одышкой при нагрузке в течение 3 суток, наличием сливных ателектазов в легких на рентгенограммах грудной клетки и восстановлением всех параметров только к 7 8 суткам после развития синдрома дыхательных расстройств. After intratracheal administration to dogs with a surfactant-deficient respiratory syndrome model of the obtained drug at a dose of 15 mg / kg of the mass, an increase in the partial pressure of oxygen in arterial blood and saturation of hemoglobin with oxygen, as well as a decrease in the partial tension of carbon dioxide in arterial blood, were found 15 minutes after administration . A day after the administration of the drug, the dogs did not have shortness of breath, there were normal parameters of blood gases and there were no pathological changes in chest radiographs (normal airiness of the lungs without atelectasis), and their behavior and condition did not differ from healthy ones. Dogs with the same model of respiratory distress syndrome, not receiving the drug, were characterized by shortness of breath with a load of 3 days, the presence of confluent atelectasis in the lungs on chest radiographs and the restoration of all parameters only to 7 8 days after the development of respiratory distress syndrome.
Пример 2. Амниотическую жидкость берут у рожениц, как в примере 1. Example 2. Amniotic fluid taken from women in labor, as in example 1.
30 л амниотической жидкости центрифугируют при 150 g в течение 10 мин. Супернатант (29,9 л) замораживают при -20oС и через 3 ч оттаивают при -10oС. Суспензию центрифугируют при 15000 g на проточной центрифуге (3 ч). Осадок (3,5 г) экстрагируют по Фолчу [2] Для этого его ресуспендируют в 0,5 л дистиллированной воды, добавляют 10 л смеси из 6,65 л хлороформа и 3,35 л метанола, суспензию перемешивают в течение 1 ч и добавляют 1,5 л стерильного 0,13% водного раствора хлорида натрия (т.е. конечное соотношение хлороформа и метанола составляет 2:1, а соотношение объема экстракта и водного раствора хлорида натрия 10:2). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 600 g в течение 30 мин. Из полученной двуфазной системы верхнюю отбрасывают, а нижнюю забирают и фильтруют через капроновый фильтр с величиной пор 0,2 мкм (стерилизующее фильтрование). Полученный фильтрат упаривают досуха на ротационном испарителе под вакуумом при +35oС. Остаток ресуспендируют в 600 мл стерильной дистиллированной воды, эмульсию разливают в стерильные флаконы по 5 мл и лиофилизируют. Флаконы упаривают в атмосфере аргона.30 liters of amniotic fluid are centrifuged at 150 g for 10 minutes. The supernatant (29.9 L) was frozen at -20 ° C and thawed at -10 ° C after 3 hours . The suspension was centrifuged at 15,000 g in a flow centrifuge (3 hours). The precipitate (3.5 g) was extracted according to Folch [2]. For this, it was resuspended in 0.5 l of distilled water, 10 l of a mixture of 6.65 l of chloroform and 3.35 l of methanol was added, the suspension was stirred for 1 h and added 1.5 l of a sterile 0.13% aqueous solution of sodium chloride (i.e., the final ratio of chloroform and methanol is 2: 1, and the ratio of the volume of the extract to the aqueous solution of sodium chloride is 10: 2). The resulting mixture was stirred and centrifuged at 600 g for 30 minutes. From the obtained two-phase system, the upper one is discarded, and the lower one is taken and filtered through a nylon filter with a pore size of 0.2 μm (sterilizing filtering). The resulting filtrate was evaporated to dryness on a rotary evaporator under vacuum at +35 o C. The residue was resuspended in 600 ml of sterile distilled water, the emulsion was poured into sterile 5 ml vials and lyophilized. The vials are evaporated in an argon atmosphere.
Получено 120 флаконов по 25 мг белого с кремоватым оттенком аморфного порошка в каждом (всего 3 г сурфактанта)
Результаты анализа (одного флакона),мг:
фосфолипиды 23,4
нейтральные липиды 1,1
белок 0,5
Подлинность и специфические свойства на модели сурфактант-дефицитного синдрома дыхательных расстройств подтверждены как и в примере 1.Received 120 vials of 25 mg of a white with a creamy tint of amorphous powder in each (only 3 g of surfactant)
The results of the analysis (one bottle), mg:
phospholipids 23.4
neutral lipids 1.1
protein 0.5
The authenticity and specific properties of the model surfactant-deficient syndrome of respiratory disorders are confirmed as in example 1.
Предлагаемый способ получения легочного сурфактанта по сравнению с известным имеет ряд существенным преимуществ. The proposed method for producing pulmonary surfactant in comparison with the known has several significant advantages.
1. В отличие от прототипа способ значительно проще, так как включает всего 5 достаточно простых операций, выполнимых в течение одного рабочего дня; он доступнее, так как основан на получении амниотической жидкости в родах. Все это делает его применимым в промышленном производстве. 1. In contrast to the prototype, the method is much simpler, since it includes only 5 fairly simple operations that can be performed within one working day; it is more accessible, since it is based on the production of amniotic fluid in childbirth. All this makes it applicable in industrial production.
2. Способ обеспечивает получение препарата более высокого качества, не содержащего балластных белков и ДНК за счет дополнительной очистки сурфактанта. 2. The method provides a higher quality preparation that does not contain ballast proteins and DNA due to additional purification of surfactant.
Способ разработан в лаборатории биотехнологии препаратов для лучевой диагностики и терапии Центрального научно-исследовательского рентгено-радиологического института Минздравмедпрома РФ совместно с ТОО "Контраст, ЛТД". The method was developed in the biotechnology laboratory of drugs for radiation diagnostics and therapy at the Central Research X-ray and Radiological Institute of the Ministry of Health of the Russian Federation together with Kontrast, LTD LLP.
Препарат прошел доклинические испытания и 29 декабря 1994 года представлен в Фармакологический и Фармакопейный комитеты Минздравмедпрома для получения разрешения на клинические испытания. The drug passed preclinical trials and on December 29, 1994 was submitted to the Pharmacological and Pharmacopoeial Committees of the Ministry of Health and Medical Industry to obtain permission for clinical trials.
Предлагаемый способ положен в основу разрабатываемого в настоящее время регламента промышленного производства природного легочного сурфактанта. The proposed method is the basis of the currently developed regulations for the industrial production of natural pulmonary surfactant.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU95103259A RU2066197C1 (en) | 1995-03-17 | 1995-03-17 | Method of pulmonary surfactant preparing |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU95103259A RU2066197C1 (en) | 1995-03-17 | 1995-03-17 | Method of pulmonary surfactant preparing |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2066197C1 true RU2066197C1 (en) | 1996-09-10 |
| RU95103259A RU95103259A (en) | 1996-11-27 |
Family
ID=20165416
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU95103259A RU2066197C1 (en) | 1995-03-17 | 1995-03-17 | Method of pulmonary surfactant preparing |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2066197C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2502514C2 (en) * | 2012-04-06 | 2013-12-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Волгоградский государственный аграрный университет | Method for producing therapeutic biologically active preparation for treating dyspepsia in newborn calves |
| RU2691648C1 (en) * | 2018-05-28 | 2019-06-17 | Олег Александрович Розенберг | Method for obtaining surfactant from bovine lungs |
-
1995
- 1995-03-17 RU RU95103259A patent/RU2066197C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Pediatrics 1983, Y.7, р. 473-481. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2502514C2 (en) * | 2012-04-06 | 2013-12-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Волгоградский государственный аграрный университет | Method for producing therapeutic biologically active preparation for treating dyspepsia in newborn calves |
| RU2691648C1 (en) * | 2018-05-28 | 2019-06-17 | Олег Александрович Розенберг | Method for obtaining surfactant from bovine lungs |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU95103259A (en) | 1996-11-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU619462B2 (en) | Natural pulmonary surfactant, method of preparation and pharmaceutical compositions | |
| US4338301A (en) | Lung tissue extract useful for treating hyaline-membrane disease and method for producing the extract | |
| US20080242589A1 (en) | Synthetic lipid mixtures for the preparation of a reconstituted surfactant | |
| JPS6296425A (en) | Artificial surfactant and medicinal composition containing same | |
| DE3141223A1 (en) | "ORAL-AVAILABLE MEDICINES FOR THERAPY AND PROPHYLAXIS OF HAEMOPHILIA A" | |
| EP0145005B1 (en) | Pulmonary surfactant, process for its preparation and its pharmaceutical use | |
| RU2066197C1 (en) | Method of pulmonary surfactant preparing | |
| US6172203B1 (en) | Method for extracting and purifying pulmonary surfactant | |
| FI74475C (en) | FREQUENCY FOR EXTRACTION OF NYY, UR KLEBSIELLA PNEUMONIAE EXTRAHERADE GLYKOPROTEINER. | |
| WO1980001456A1 (en) | Pharmaceutical composition and process for the preparation thereof | |
| RU2066198C1 (en) | Method of pulmonary surfactant preparing | |
| RU2152219C1 (en) | Peptides showing immunostimulating activity, method of their synthesis, drug based on thereof, splenopid and its using | |
| US3591677A (en) | Allergenic extract and process for preparing same | |
| RU2178309C2 (en) | Antithymocytic globulin for intravenous injection and method for its obtaining | |
| US2687980A (en) | Thromboplastin product and method for preparing same | |
| CN109394750A (en) | Application of the hydroxyl radical carthamin yellow carthamus A in preparation treatment medication for treating pyemia | |
| RU2198670C1 (en) | Method for obtaining pulmonary surfactant in cattle | |
| KR960013436B1 (en) | Natural pulmonary surfactant, method of preparation and pharmaceutical compositions | |
| RU2264826C1 (en) | Method for obtaining antithymocytic globulin for intravenous injection | |
| DE2630380A1 (en) | PROCESS FOR MANUFACTURING A VACZINE | |
| US3798319A (en) | Therapeutic and diagnostic allergenic extract and process for preparing same | |
| JPS6236483B2 (en) | ||
| RU2019190C1 (en) | Method of monospecific antiserum preparing | |
| Kildruffe et al. | Effect of blood preservatives on urea determination | |
| AT334525B (en) | METHOD FOR PRODUCING HUMAN ANTISTAPHYLOCOCCUS IMMUNOGLOBULIN |