RU2065879C1

RU2065879C1 - Method of determination of microorganism antihiston activity

Info

Publication number: RU2065879C1
Authority: RU
Inventors: В.Ю. Соколов
Original assignee: Соколова Елена Владимировна
Priority date: 1992-08-14
Filing date: 1992-08-14
Publication date: 1996-08-27

Abstract

FIELD: medicinal microbiology. SUBSTANCE: examined culture is sown locally on the solid nutrient medium containing histons at concentration sufficient to detect maximal activity of culture to be examined but not less 0.8 mg/ml. After incubation culture is inactivated and the second layer of nutrient medium is added where test-culture Micrococcus lysodeikticus "ГИСК"-2665 is suspended. The presence of antihiston activity in the examined culture is made if test-culture growth around the tested microorganism culture is appeared. EFFECT: improved method of antihiston activity assay.

Description

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и может быть использовано при определении биологической активности микроорганизмов. The invention relates to the field of medical microbiology and can be used to determine the biological activity of microorganisms.

С точки зрения медицинской микробиологии особое значение имеет технология определения биологической активности микроорганизмов по отношению к ключевым структурным и функциональным белкам микроорганизма. Изучение этих активностей позволило установить антикомплементарную, антииммуноглобулиновую, антилизоцимную, антиинтерфероновую активности микроорганизмов, на базе которых разработан ряд способов, используемых в медицине [1,2,3,4]
До настоящего времени, каких-либо исследований по определению активности бактерий в отношении важнейших белков хроматина-гистонов не проводилось. Соответственно, поэтому не существовало и способов обнаружения антигистоновой активности микрооргангизмов, что не позволяет выбрать прототип изобретения.From the point of view of medical microbiology, the technology of determining the biological activity of microorganisms with respect to the key structural and functional proteins of the microorganism is of particular importance. The study of these activities made it possible to establish the anti-complementary, anti-immunoglobulin, anti-isosymic, anti-interferon activity of microorganisms, on the basis of which a number of methods used in medicine have been developed [1,2,3,4]
To date, no studies have been conducted to determine the activity of bacteria against the most important chromatin-histone proteins. Accordingly, therefore, there were no ways to detect the antihistone activity of microorganisms, which does not allow us to choose a prototype of the invention.

Между тем, гистоны основные ядерные белки всех эукариотических организмов, играют доминирующую роль в структурной организации хроматина и связанной с ней экспрессии и активации генов [5] Давно известна и хорошо изучена антимикробная активность гистонов и различная чувствительность к ним микроорганизмов [6] но способность бактерий к инактивации гистонов в литературе не описана. Meanwhile, histones, the main nuclear proteins of all eukaryotic organisms, play a dominant role in the structural organization of chromatin and the associated expression and activation of genes [5] The antimicrobial activity of histones and the different sensitivity of microorganisms to them have long been known and well studied [6] but the ability of bacteria to histone inactivation is not described in the literature.

Целью изобретения является разработка способа определения антигистоновой активности микроорганизмов. The aim of the invention is to develop a method for determining the antihistone activity of microorganisms.

Указанная цель достигается тем, что в способе определения антигистоновой активности микроорганизмов исследуемые бактерии высевают на плотную питательную среду с подобранными концентрациями гистонов. Посев осуществляют локально на поверхность среды. После инкубации культуру инактивируют и наслаивают второй слой питательной среды в которой суспендируют тест-культуру Micrococcus lysodeikticus ГИСК 2665. После повторной инкубации посевов в течение 24 часов изучают локализацию колоний тест-культуры. Если исследуемая культура обладает антигистоновой активностью, то вокруг колоний вырастают колонии тест-культуры. This goal is achieved by the fact that in the method for determining the antihistone activity of microorganisms, the studied bacteria are seeded on a solid nutrient medium with selected histone concentrations. Sowing is carried out locally on the surface of the medium. After incubation, the culture is inactivated and layered a second layer of culture medium in which the Micrococcus lysodeikticus GISK 2665 test culture is suspended. After repeated incubation of the crops for 24 hours, the localization of the test culture colonies is studied. If the studied culture has antihistone activity, then colonies of the test culture grow around the colonies.

Для осуществления способа в качестве тест-культуры к гистонам используют известный штамм Micrococcus lysodeikticus ГИСК 2665 Культурно-моpфологические признаки штамма: величина клеток суточной культуры на обычном мясо-пептонном агаре 1,5-2 мк. Грамположительны, располагаются поодиночке и в парах, образуют неправильные группы и тетрады. Хорошо растут на простых питательных средах. На мясо-пептонном бульоне растет в виде равномерной взвеси. На мясо-пептонном агаре образует ровные гладкие колонии с желтым пигментом диаметром 1 мм. To implement the method, a known strain of Micrococcus lysodeikticus GISK 2665 is used as a test culture for histones. Cultural and morphological characteristics of the strain: the daily culture cell size on ordinary meat-peptone agar is 1.5-2 microns. Gram-positive, located singly and in pairs, form irregular groups and tetrads. They grow well on simple nutrient media. On meat-peptone broth it grows in the form of a uniform suspension. On meat-peptone agar forms smooth smooth colonies with a yellow pigment with a diameter of 1 mm.

Физико-химические признаки
Развивается в аэробных условиях. Оптимум роста 25-30^oС. Растет при концентрации хлорида натрия до 5% Не расщепляют мальтозу, маннит, галактозу и глюкозу. Чувствителен к эритромицину, тетрациклину, пенициллину, стрептомицину. Чувствителен к яичному лизоциму/литическое действие/в концентрации 1 мкг. [3]
Чувствителен к общей фракции гистонов ("Сигма") МБК 0,8 мкг/мл. Способ осуществляется следующим образом:
Пример N1 У 100 штаммов бактерий, выделенных с переднего отдела слизистой носа обследуемых лиц определяли антигистоновую активность. С этой целью готовили четыре ряда чашек Петри. Чашки заливали 1,5% мясо-пептонным агаром содержащим гистоны в восходящей концентрации: 0,4; 0,8; 3,2; 4,5; 8; 10 мг/мл агара. После застывания среды и ее подсушивания на поверхность агара локально (в виде отдельных "пятачков") засевали петлей суточную культуру исследуемых штаммов. На каждый ряд чашек засевали по 25 штаммов. Чашки инкубируют сутки при 37^oС, после чего выросшие культуры убивают парами хлороформа 20 мин. на инактивированные культуры наслаивают второй слой питательного 0,7% агара (3-4 мл), содержащим взвесь суточной культуры Micrococcus lusodeiktius ГИСК N2665. Чашки инкубируют повторно 24 часа при 37^oС. Величину антигистоновой активности бактерий определяют по наличию роста тест культуры вокруг колоний испытуемой культуры по чашке с максимальной концентрацией гистонов, на которой выявилась еще активность исследуемого штамм. Результаты распределились следующим образом:
На чашках с концентрацией гистонов 0,4 мг/мл учет антигистоновой активности был невозможен из-за сплошного фонового роста тест культуры по всей чашке. Таким образом, нижняя концентрация гистонов в среде определяется чувствительностью к гистонам тест-культуры.Physico-chemical characteristics
It develops under aerobic conditions. The optimum growth is 25-30 ^o C. It grows at a concentration of sodium chloride up to 5% Do not break down maltose, mannitol, galactose and glucose. It is sensitive to erythromycin, tetracycline, penicillin, streptomycin. Sensitive to egg lysozyme / lytic effect / at a concentration of 1 μg. [3]
Sensitive to the total histone fraction ("Sigma") MBC 0.8 μg / ml. The method is as follows:
Example N1. In 100 strains of bacteria isolated from the anterior nasal mucosa of the examined individuals, antihistone activity was determined. For this purpose, prepared four rows of Petri dishes. The cups were poured with 1.5% meat-peptone agar containing histones in ascending concentration: 0.4; 0.8; 3.2; 4,5; 8; 10 mg / ml agar. After solidification of the medium and its drying on the surface of the agar locally (in the form of separate “spots”), the daily culture of the studied strains was sown with a loop. For each row of cups, 25 strains were seeded. Cups are incubated for a day at 37 ^o C, after which the grown cultures are killed in pairs of chloroform for 20 minutes. a second layer of nutrient 0.7% agar (3-4 ml) containing a suspension of the daily culture of Micrococcus lusodeiktius GISK N2665 is layered on inactivated cultures. The plates are re-incubated for 24 hours at 37 ^° C. The antihistone activity of the bacteria is determined by the presence of growth of the test culture around the colonies of the test culture in a plate with a maximum concentration of histones, on which the activity of the studied strain was revealed. The results were distributed as follows:
On plates with a histone concentration of 0.4 mg / ml, taking into account antihistone activity was not possible due to continuous background growth of the test culture throughout the plate. Thus, the lower concentration of histones in the medium is determined by the sensitivity to histones of the test culture.

На чашках с концентрацией гистонов 0,8 мг/мл из 100 штаммов активность выявлена у 43. Это же число активных штаммов выявилось и на концентрации гистонов в среде 3,2 мг/мл. На концентрации гистонов 4 мг/мл число активных штаммов уменьшилось на 2 и составило 41 (табл.1). То есть у 2 штаммов эпидермального стафилококка антигистоновая активность определялась верхним пределом 3,2 мг/мл. На концентрации гистонов в среде 5 мг/мл число активных штаммов понизилось с 41 до 20. Таким образом, у 21 штамма золотистого стафилококка антигистоновая активность составила 4 мг/мл (табл.1). У 20 оставшихся штаммов, среди которых коринебактерии, нейссерии, микрококки Антигистоновая активность продолжала выявляться на концентрации гистонов в среде 8, 10 мг/мл. Таким образом, верхний предел концентрации в среде гистонов, определяется индивидуально для выявления максимальной активности каждого испытуемого штамма. Представленный пример поясняется таблицей 1. On plates with a histone concentration of 0.8 mg / ml from 100 strains, activity was detected in 43. The same number of active strains was also detected in a concentration of histones in the medium of 3.2 mg / ml. At a histone concentration of 4 mg / ml, the number of active strains decreased by 2 and amounted to 41 (Table 1). That is, in 2 strains of epidermal staphylococcus antihistone activity was determined by the upper limit of 3.2 mg / ml. At a concentration of histones in the medium of 5 mg / ml, the number of active strains decreased from 41 to 20. Thus, in 21 strains of Staphylococcus aureus, the antihistone activity was 4 mg / ml (Table 1). In the remaining 20 strains, including corynebacteria, neisseria, micrococci, antihistone activity continued to be detected at a concentration of histones in the medium of 8, 10 mg / ml. Thus, the upper limit of concentration in histone medium is determined individually to identify the maximum activity of each test strain. The presented example is illustrated in table 1.

Как видно из таблицы в результате применения заявляемого способа удалось зарегистрировать неизвестное ранее свойство бактерий, антигистоновую активность (АГА) и изучить распространение ее у разных видов микроорганизмов. As can be seen from the table as a result of the application of the proposed method, it was possible to register a previously unknown bacterial property, antihistone activity (AHA) and study its distribution in different types of microorganisms.

Пример N2. Определяли АГА у штаммов бактерий, выделенных с переднего отдела слизистой носа лиц, проживающих в двух различных по заболеваемости регионах. В первом регионе заболеваемость органов дыхания на 1000 населения составило 1347, процент антигистонактивных штаммов, выделенных от этого контингента, составил 44% Во втором регионе заболеваемость составила 1117, количество антигистонактивных штаммов, выделенных от жителей данного региона, составило 14% В приведенном примере число бактерионосителей штаммов с новой биологической активностью, обнаруженной предлагаемым методом, косвенно отражает уровень инфекционной заболеваемости органов дыхания жителей разных регионов. Example N2. AHA was determined in bacterial strains isolated from the anterior nasal mucosa of individuals living in two regions with different morbidity. In the first region, the incidence of respiratory organs per 1000 population was 1347, the percentage of antihistonative strains isolated from this contingent was 44%. In the second region, the incidence was 1117, the number of antihistonative strains isolated from the inhabitants of this region was 14%. In the given example, the number of bacterial carriers of strains with the new biological activity detected by the proposed method, indirectly reflects the level of infectious diseases of the respiratory system of residents of different regions.

Пример N3. Наличие АГА впервые выявленное предложенным способом позволило предположить инвазию бактерий в место первоначального расположения гистонов в ядро клетки. Это предположение было подтверждено на светомикроскопическом уровне. Результаты данного исследования позволяют поставить вопрос о качественно новом, ядерном уровне взаимодействия бактерия-макроорганизм. Example N3. The presence of AHA was first identified by the proposed method, suggesting an invasion of bacteria at the initial location of histones in the cell nucleus. This assumption was confirmed at the light microscopic level. The results of this study raise the question of a qualitatively new, nuclear level of interaction between the bacterium and the macroorganism.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволило впервые выявить и начать изучение АГА бактерий разных видов, впервые поставить вопрос о бактериальной инфекции ядра клетки макроорганизма и подтвердить это на светомикроскопическом уровне, провести косвенную оценку заболеваемости населения по частоте встречаемости штаммов бактерий с АГА выделенных от данного контингента населения. ТТТ1 Thus, the use of the proposed method made it possible for the first time to identify and begin the study of AHA of bacteria of various species, to raise for the first time the question of bacterial infection of the nucleus of a macroorganism cell and confirm this at the light microscopic level, to conduct an indirect assessment of the incidence of the population by the frequency of bacterial strains with AHA isolated from this population . TTT1

Claims

A method for determining the antihistone activity of microorganisms, which consists in the fact that the studied culture of microorganisms is grown on a nutrient medium in the presence of histones at a concentration of not less than 0.8 mg / ml and at the same time sufficient to identify the maximum activity of the test culture, the grown culture is inactivated, the second layer is layered culture medium containing a suspension of the test culture Micrococcus lysodeiticus GISK N 2665, the inoculum is incubated and the antihistone activity of microorganisms is determined by the presence of growth of the test cult cheers around the colonies of the test culture.