RU2063631C1

RU2063631C1 - Method for diagnosing female sterility

Info

Publication number: RU2063631C1
Authority: RU
Inventors: В.Г. Скопичев; В.И. Скопичева; Г.А. Савицкий; М.Ю. Коршунов; С.Н. Петрова
Original assignee: Санкт-Петербургский государственный университет
Priority date: 1992-08-14
Filing date: 1992-08-14
Publication date: 1996-07-10

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: method involves performing microscopy analysis of endometrial cells taken from uterus cavity suction sample or from scrape imprint died with 2% solution of cation dye that is selected to be direct light proof turquoise. Its binding is evaluated with spectrophotometric method. The value of optical density equal to 1-1.5 optical units cell nidation is diagnosed. The value being equal to 2-2.5, primary sterility is diagnosed. EFFECT: reduced traumatic lesions; enhanced accuracy of diagnosis.

Description

Изобретение относится к клинической медицине, может быть использовано в диагностике женского бесплодия. The invention relates to clinical medicine, can be used in the diagnosis of female infertility.

Известно, что женское бесплодие обусловлено многими причинами: эндокринные факторы приводят к нарушению процесса овуляции, в результате чего возникает ановуляция, лютеиновая недостаточность, синдром лютеинизации неовулирующего фолликула; трубный фактор обусловлен анатомо-функциональным нарушением проходимости маточных труб. Причиной перитонеального бесплодия является спаечный процесс в малом тазу при проходимости одной или обеих маточных труб. Комплексное обследование женщины, страдающей бесплодием, многогранно и сложно, включает в себя гормональное исследование по тестам функциональной диагностики, определение гормонов и их метаболитов в крови и моче, функциональные пробы, эндоскопическое и ультразвуковое исследование. It is known that female infertility is caused by many reasons: endocrine factors lead to disruption of the ovulation process, resulting in anovulation, luteal insufficiency, luteinization syndrome of a neovulating follicle; the tube factor is due to the anatomical and functional violation of the patency of the fallopian tubes. The cause of peritoneal infertility is an adhesion process in the pelvis with patency of one or both fallopian tubes. A comprehensive examination of a woman suffering from infertility is multifaceted and complex, includes a hormonal test for functional diagnostics tests, determination of hormones and their metabolites in the blood and urine, functional tests, endoscopic and ultrasound examinations.

Известен способ диагностики бесплодия, который является наиболее близким к прелагаемому изобретению по решению технической задачи, которая заключается в оценке функционального состояния слизистой матки. Он основан на гистологическом исследовании соскобов эндометрия, по которым судят о принципиальной возможности (или невозможности) нидации плодного яйца [1] При этом возможна оценка динамики изменения эндометрия бесплодных женщин до и после проведенного лечения. Общим с предлагаемым изобретением является применение микроскопического исследования клеток эндометрия. A known method for the diagnosis of infertility, which is the closest to the proposed invention to solve the technical problem, which consists in assessing the functional state of the uterine mucosa. It is based on a histological examination of endometrial scrapings, which are used to judge the fundamental possibility (or impossibility) of nidulation of the ovum [1]. It is also possible to assess the dynamics of endometrial changes in infertile women before and after treatment. In common with the proposed invention is the use of microscopic examination of endometrial cells.

Недостатками известного способа является высокая трудоемкость, и значительная длительность процедуры, которая включает в себя фиксацию препарата, заливку в парафин или другие среды, окраску полученных срезов и последующее микроскопическое исследование состояния стромы, желез, сосудов, свободных клеток стромы эндометрия. Сама биопсия по сути является инвазивным методом исследования, требующим достаточной инструментальной и методической оснащенности. The disadvantages of this method is the high complexity, and the significant duration of the procedure, which includes fixing the drug, pouring it into paraffin or other media, staining the obtained sections and subsequent microscopic examination of the state of the stroma, glands, blood vessels, free cells of the endometrial stroma. The biopsy itself is essentially an invasive research method that requires sufficient instrumental and methodological equipment.

Целью предлагаемого изобретения является снижение травматичности при взятии проб и уменьшение трудоемкости, удешевление, ускорение диагностики бесплодия с одновременным увеличением объективности прогноза лечения. The aim of the invention is to reduce the morbidity during sampling and reduce the complexity, cheaper, accelerate the diagnosis of infertility while increasing the objectivity of the prognosis of treatment.

В связи вышеизложенным вполне основано и целесообразно изыскание новых, более простых и не требующих больших материальных затрат методом определения способности женщин к значению, учитывая достаточно большой контингент больных, обследующихся по поводу бесплодия и необходимость постоянного мониторинга за динамикой изменения состояния эндометрия в процессе терапии бесплодия. In connection with the foregoing, it is completely based and advisable to find new, simpler and not requiring large material costs by determining the ability of women to value, given the large enough contingent of patients being examined for infertility and the need for constant monitoring of the dynamics of changes in the endometrium during infertility therapy.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что клетки эндометрия из аспирата полости матки или из отпечатка соскоба окрашивается 2%-ным раствора катионного красителя в качестве которого выбирают бирюзовый прямой светопрочный, его связывание оценивают спектрофотометрических и при низких значениях оптической плотности (1 1,5 относительных единиц) судят о возможности нидации оплодотворенной яйцеклетки, а при высоких значениях оптической плотности (2 2,5 относительных единиц) диагностируют первичное бесплодие. The essence of the proposed method lies in the fact that endometrial cells from an uterine cavity aspirate or from a scraping imprint are stained with a 2% solution of a cationic dye, which is selected as turquoise direct light-resistant, its binding is evaluated spectrophotometrically and at low optical densities (1 1.5 relative units) they judge the possibility of nidation of a fertilized egg, and at high values of optical density (2 2.5 relative units), primary infertility is diagnosed.

Оплодотворение и культивирование человеческой яйцеклетки в настоящее время применяется все чаще, однако доля наступления беременности, которая следует за трансплантацией эмбриона в матку, низка. Из многих факторов, которые могли бы влиять на успех данного метода функциональное состояние эндометрия оказывается самым значительным. Fertilization and cultivation of the human egg is currently being used more and more often, however, the proportion of pregnancy that follows the transplantation of the embryo into the uterus is low. Of the many factors that could influence the success of this method, the functional state of the endometrium is the most significant.

Для нормального осуществления репродуктивной функции, матка должна быть готова к обеспечению двух альтернативных процессов: 1) готовности к половому акту и оплодотворению яйцеклетки; 2) обеспечению развития оплодотворенной яйцеклетки, отрицающему возможность дополнительного оплодотворения. На уровне всего организма это выражается в циклическом характере репродуктивного процесса, регуляция которого обеспечивается половыми гормонами. На ультраструктурном уровне это выражается в циклическом изменении рельефа клеток эндометрия и других реакциях, запущенных соответствующим гормон-рецепторным комплексом. For the normal reproductive function, the uterus should be ready to provide two alternative processes: 1) readiness for sexual intercourse and fertilization of the egg; 2) ensuring the development of a fertilized egg, which denies the possibility of additional fertilization. At the level of the whole organism, this is expressed in the cyclical nature of the reproductive process, the regulation of which is provided by sex hormones. At the ultrastructural level, this is expressed in a cyclical change in the relief of endometrial cells and other reactions triggered by the corresponding hormone-receptor complex.

Наряду с данными, полученными в экспериментальных условиях нами на клиническом материале проведен анализ рельефа клеточной поверхности при различных формах бесплодия женщин. Along with the data obtained in experimental conditions, we performed an analysis of the relief of the cell surface in various forms of female infertility on clinical material.

Принципиально важным оказалось сохранение микроворсинчатого рельефа апикальной поверхности эпителиоцитов при первичном бесплодии, которое характеризуется отсутствием имплантации яйцеклетки. Хорошо известно, что рельеф клеточной поверхности определяется состоянием цитоскелета, а изменения формы клеток во многом обеспечиваются соотношением и степенью полимеризации и распределением в клетке цитоскелетных белков. It was fundamentally important to preserve the microvilli relief of the apical surface of the epithelial cells in primary infertility, which is characterized by the absence of egg implantation. It is well known that the relief of the cell surface is determined by the state of the cytoskeleton, and changes in the shape of cells are largely provided by the ratio and degree of polymerization and the distribution of cytoskeletal proteins in the cell.

Применяемый нами катионный краситель бирюзовый прямой светопрочный связывается с белками мембраны и примембранного комплекса. Он тестирует положительно заряженные аминные группы мембранных и примембранных белков, по-видимому, аргинина, лизина и протонированного имидозола. Окрашивая данным красителем препараты клеток, чья апикальная поверхность обильно снабжена микроворсинками и соответственно сильно развитым примембранным комплексом мы получили значительное связывание красителя с клетками. При окрашивании же препаратов с клетками, лишенными микроворсинок, мы отвечаем существенное снижение количества цетров сорбции и регистрируем слабое связывание с красителем. The cationic dye used by us is turquoise direct, lightfast, and binds to the proteins of the membrane and the membrane complex. He tests positively charged amine groups of membrane and membrane proteins, apparently arginine, lysine, and protonated imidozole. By staining cell preparations with this dye whose apical surface is abundantly equipped with microvilli and a correspondingly well developed membrane complex, we obtained significant binding of the dye to cells. When staining preparations with cells devoid of microvilli, we respond to a significant decrease in the number of sorption centers and record weak binding to the dye.

Отпечатки с образца снимаются на заранее обезжиренные предметные стекла и, практически сразу начинается окрашивание. Время установления диффузионного равновесия, определенное с помощью методики цитофотометрии витально окрашенных образцов, описанной в работе Левина и Гольфанд при окрашивании в 2% -ном водном растворе бирюзового прямого составляет более 60 70 минут. The prints from the sample are removed on previously defatted glass slides and, almost immediately, staining begins. The time to establish diffusion equilibrium, determined using the cytophotometry technique of vitally stained samples described by Levin and Golfand when stained in a 2% aqueous solution of turquoise direct, is more than 60 70 minutes.

После окончания экспозиции препараты фиксируются в 70% спирте 10 минут и обезвоживаются в 96% спирте. Затем подсушенные стекла просматриваются под иммерсионным объективом (х100) и фото графируются. Определение содержания бирюзового прямого проводили на анализаторе изображения "Морфоквант" (Карл Цейс, ГДР) при монохроматическом света (длина волны 550 нм, диаметр зонда и шаг сканирования 0,4 мкм, объектив 50Х). Производили замеры оптической плотности окрашивания бирюзовым прямым, выраженную в относительных единицах. After exposure, the drugs are fixed in 70% alcohol for 10 minutes and dehydrated in 96% alcohol. Then the dried glass is viewed under an immersion lens (x100) and the photo is graphed. The content of the turquoise direct was determined on a Morphoquant image analyzer (Karl Zeiss, GDR) under monochromatic light (wavelength 550 nm, probe diameter and scanning step 0.4 μm, 50X objective). We measured the optical density of staining with a turquoise straight line, expressed in relative units.

Количественная оценка на анализаторе изображения "Морфоквант" показала существенные различия между этими группами больных в условных единицах оптической плотности на единицу площади измеряемой клетки. Полученные данные были подвергнуты статистической обработке с помощью пакета программного обеспечения "Stratigrafic programm". Результаты статической обработки экспериментальных данных, доказывающие, что произведенные измерения поддаются нормальному распределению по критерию с уровнем значимости а=0,05 приведены в таблице. A quantitative assessment using the Morphoquant image analyzer showed significant differences between these groups of patients in arbitrary units of optical density per unit area of the measured cell. The data obtained were subjected to statistical processing using the software package "Stratigrafic programm". The results of the static processing of experimental data, proving that the measurements are amenable to a normal distribution by criterion with a significance level of a = 0.05, are given in the table.

Данные статистического анализа позволяют утверждать, различия достоверны, причем они заметны при визуальном просмотре препаратов. The data of statistical analysis suggest that the differences are significant, and they are noticeable when viewing the drugs.

Эффективность предлагаемого способа заключается в снижении трудоемкости и ускорении исследования исключаются сложные и дорогостоящие гистологические исследования, требующие фиксации биопсий, заливки в среды, приготовление срезов и последующее микроскопирование. Следует отметить, что применяемое в настоящее время гистологическое исследование дает только общее представление о морфологической структуре эндометрия и ее соответствии фазам менструального цикла. Предлагаемый нами способ окраски клеток эндометрия позволяет судить о состоянии клеточной поверхности, что дает объективную информацию о возможности нидации оплодотворенной яйцеклетки. The effectiveness of the proposed method is to reduce the complexity and accelerate the study eliminates complex and expensive histological studies requiring fixation of biopsies, filling in the medium, preparation of sections and subsequent microscopy. It should be noted that the currently used histological examination gives only a general idea of the morphological structure of the endometrium and its correspondence to the phases of the menstrual cycle. Our proposed method for staining endometrial cells allows us to judge the state of the cell surface, which gives objective information about the possibility of nidation of a fertilized egg.

Снижается также и травматичность исследования, поскольку для получения необходимого количества клеток эндометрия достаточно одной капли аспирата из полости матки. The morbidity of the study is also reduced, since to obtain the required number of endometrial cells, one drop of aspirate from the uterine cavity is enough.

Кроме того, следует учитывать, что при лечении бесплодия наиболее важным является прогноз результатов лечебных мероприятий. Оценка перспектив нидации оплодотворенной яйцеклетки позволяет уменьшить количество безрезультативных операций по трансплантации эмбрионов. Это в свою очередь позволяет существенно снизить затраты на сложную и дорогостоящую клиническую работу и уменьшить степень воздействий на организм женщины. Важно отметить, что в комплексе клинических данных о состоянии репродуктивных органов женщин оценка состояния клеточной поверхности эпителия эндометрия несомненно имеет ведущее значение. ТТТ1 In addition, it should be borne in mind that in the treatment of infertility, the most important is the prognosis of the results of therapeutic measures. Evaluation of the prospects for nidation of a fertilized egg allows reducing the number of inconclusive embryo transplant operations. This in turn can significantly reduce the cost of complex and expensive clinical work and reduce the degree of impact on the woman's body. It is important to note that in the complex of clinical data on the state of the reproductive organs of women, the assessment of the state of the cell surface of the endometrial epithelium is undoubtedly of leading importance. TTT1

Claims

A method for diagnosing infertility in women, including microscopic analysis of the condition of endometrial cells, characterized in that the endometrial cells from the uterine cavity aspirate or from the scraping imprint are stained with a 2% solution of a cationic dye, which is selected as a light-colored turquoise direct, assess its binding spectrophotometrically and optical density 1 1.5 opt. diagnose the possibility of nidation of a fertilized egg, and with values of 2 2.5 opt. diagnose primary infertility.