RU2061033C1

RU2061033C1 - Single-use device for autonomous anaerobiosis of microorganisms

Info

Publication number: RU2061033C1
Application number: RU93055192A
Authority: RU
Inventors: Александр Владимирович Строков
Original assignee: Александр Владимирович Строков
Priority date: 1993-12-10
Filing date: 1993-12-10
Publication date: 1996-05-27

Abstract

FIELD: microbiology. SUBSTANCE: invention refers to anaerobic cultivation of microorganisms while studying them. Device for autonomous anaerobiosis includes sealed container manufactured in the form of two-chamber vertical cylinder with two branch pipes of different dimensions and sealing cups on them. Lower chamber communicates with clearance between branch pipes and is designed to hold bacteriological material and nutrient medium, upper chamber is 2/3 filled with chemical generator and limiting gaskets from beneath and remaing part of it communicates with clearance of one of branch pipes with the aid of technological window. Device is fabricated from polymer tubular materials stiffly joined in one microstructure providing for autonomy of anaerobiosis. EFFECT: maximal decrease of time of contact of bacteriological material with oxygen of air, simplified methodology of process with high sowing capability of anaerobic microorganisms. 1 dwg

Description

Изобретение относится к микробиологии, а именно к устройствам для работы с микроорганизмами. The invention relates to microbiology, and in particular to devices for working with microorganisms.

Анаэробные микроорганизмы (анаэробы) составляют подавляющее большинство нормальной микрофлоры человеческого тела. Изучение микроорганизмов этой группы трудоемкий в методическом и техническом плане раздел микробиологии, основным препятствием которого является быстрая гибель облигатных (обязательных) анаэробов при контакте с кислородом воздуха. Критическое время выживания у большинства анаэробных микроорганизмов не превышает 15-60 мин, именно поэтому высеваемость анаэробов непосредственно зависит от времени контакта бакматериала с воздухом и составляет по данным различных авторов от 1,5 до 93% Создание условий анаэробиоза (бескислородной среды) являлось основной задачей в эволюции методологии изучения анаэробов. Ранее применяемые устройства: трубки и мерные пипетки, камеры с покровными стеклянными и полимерными пластинами не получили распространения из-за контакта бакматериала с воздухом при пересевах, наличия глубинного роста колоний микроорганизмов. Не получили широкого распространения и устройства для посевов уколом в плотную питательную среду, дающие глубинный рост, слияние колоний, непригодные к использованию непрозрачных питательных сред. Лабораторные устройства типа перчаточных камер, представляющие собой герметичные газонаполняемые аппараты с возможностью манипулирования во внутpеннем объеме, отличаются сложностью, необходимостью дополнительного газообменного оборудования. Anaerobic microorganisms (anaerobes) make up the vast majority of the normal microflora of the human body. The study of microorganisms of this group is a methodically and technically difficult section of microbiology, the main obstacle of which is the rapid death of obligate (obligatory) anaerobes in contact with atmospheric oxygen. The critical survival time for most anaerobic microorganisms does not exceed 15-60 minutes, which is why the sowing rate of anaerobes directly depends on the contact time of the bacterial material with air and, according to various authors, ranges from 1.5 to 93%. Creating conditions for anaerobiosis (oxygen-free environment) was the main task in evolution of anaerobic research methodology. Previously used devices: tubes and measuring pipettes, chambers with glass and polymer coverslips were not widespread due to contact of the bacterial material with air during reseeding, and the presence of deep growth of microorganism colonies. Devices for sowing by injection into a dense nutrient medium that provide deep growth, fusion of colonies, unsuitable for use opaque nutrient media are not widely used. Laboratory devices such as glove chambers, which are sealed gas-filled apparatuses with the possibility of manipulation in the internal volume, are distinguished by complexity and the need for additional gas exchange equipment.

В настоящее время известны 3 группы устройств, применяемых в практике, принципиально различающиеся по способу создания условий анаэробиоза. Первую группу представляют контейнеры и микроконтейнеры жесткой конструкции, снабженные герметизирующими крышками, патрубками для откачки воздуха и введения газа. Устройствам этой группы полностью соответствует отечественный микроанаэростат МИ-752. Это устройство состоит из цилиндрического стакана и обода, насаженного на его открытый конец, резиновой прокладки, крышки. Крышка имеет патрубок с вентилем, вакуум-манометр, скобу и затяжной винт, прижимающий крышку к фланцу обода. Условия анаэробиоза в данном устройстве создаются путем вакуум-замещения воздуха на газ: водород, азот, CO₂ или смесь из них. Достоинством устройств данной группы является относительная доступность, возможность выделения чистых культур, использование для посевов чашек Петри и пробирок. Из недостатков необходимо указать следующие: контакт бакматериала с кислородом воздуха при пересевах, необходимость вакуумного и газонаполнительного оборудования, источников газа, тpудоемкость в обслуживании.Currently, there are 3 groups of devices used in practice, fundamentally different in the way the conditions of anaerobiosis are created. The first group consists of containers and microcontainers of rigid construction, equipped with sealing caps, nozzles for pumping air and introducing gas. The devices of this group are fully consistent with the domestic micro-aerostat MI-752. This device consists of a cylindrical cup and a rim mounted on its open end, a rubber gasket, a cover. The cover has a nozzle with a valve, a vacuum gauge, a bracket and a tightening screw that presses the cover to the rim flange. Anaerobiosis conditions in this device are created by vacuum substitution of air for gas: hydrogen, nitrogen, CO ₂ or a mixture of them. The advantage of devices of this group is relative accessibility, the possibility of isolating pure cultures, and the use of Petri dishes and test tubes for sowing. Among the shortcomings, it is necessary to indicate the following: contact of the material with air oxygen during reseeding, the need for vacuum and gas-filling equipment, gas sources, labor intensity in maintenance.

Устройства для анаэробиоза второй группы используют поглощение кислорода из камеры или контейнера активными химическими соединениями, например поглощающая кислород система для анаэробиоза, запатентованная в США. Данный подход к решению проблемы позволяет создать более компактные устройства, пригодные для хранения и транспортировки бакматериала. Devices for anaerobiosis of the second group use the absorption of oxygen from a chamber or container with active chemical compounds, for example, an oxygen-absorbing system for anaerobiosis, patented in the United States. This approach to solving the problem allows you to create more compact devices suitable for storage and transportation of bacterial material.

На этом принципе создано устройство, поддерживающее анаэробные микроорганизмы, представляющее собой стеклянный контейнер с горловиной, в котором размещены емкость с химическим поглотителем кислорода, пробирка для размещения бакматериала, проволочная петля с марлевым тампоном и жесткосвязанная с ними пробка. Химический поглотитель перед использованием активируется водой, пробирка, соответствующая диаметру горловины, временно герметизирует контейнер. Бакматериал забирают на тампон, петлей переносят в пробирку, последнюю опускают внутрь контейнера, окончательно герметизируя горловину пробкой. Данную конструкцию можно использовать как устройство для забора, временного хранения и транспортировки бакматериала. Based on this principle, a device supporting anaerobic microorganisms is created, which is a glass container with a neck, in which a container with a chemical oxygen scavenger, a test tube for placing the bacterial material, a wire loop with a gauze swab and a tightly connected tube are placed. Before use, the chemical absorber is activated by water, a test tube corresponding to the neck diameter temporarily seals the container. The bakmaterial is taken onto a tampon, looped into a test tube, the latter is lowered into the container, finally sealing the neck with a stopper. This design can be used as a device for the collection, temporary storage and transportation of bacterial material.

Однако данное устройство не обеспечивает анаэробиоза при пересевах, а газовая среда в контейнере представлена преимущественно азотом, в то время как углекислый газ необходим для жизнедеятельности многих анаэробов в количестве не менее 10% объема газовой среды. However, this device does not provide anaerobiosis during transfers, and the gas medium in the container is mainly nitrogen, while carbon dioxide is necessary for the life of many anaerobes in an amount of at least 10% of the volume of the gas medium.

Третья группа устройств для анаэробиоза используeт принцип вытеснения воздуха из рабочего объема контейнера посредством химического генератора газа, размещаемого в контейнере. Устройства такого типа называют Gaspak и используют в лабораторной системе изучения микроорганизмов, производимой фирмой BBL Microbiology". Она предлагает использование устройства, состоящего из прозрачного пластикового стакана с завинчивающейся крышкой, представляющего собой герметичный контейнер емкостью 100 дм³, условия анаэробиоза в котором создаются химическим генератором CO₂, размещенным в заменяемых пакетах. Каждый такой пакет содержит прессованную сухую навеску натрия бикарбоната и лимонной кислоты, систему капиллярных дорожек для заполнения водой и прокладку из фильтровальной бумаги, обеспечивающую длительность работы химического генератора. Активация химических компонентов достигается введением в пакет 10 мл дистиллированной воды после загрузки контейнера посевами непосредственно перед герметизацией.The third group of devices for anaerobiosis uses the principle of displacing air from the working volume of a container by means of a chemical gas generator placed in the container. This type of device is called Gaspak and is used in the BBL Microbiology laboratory microorganism study system. It proposes the use of a device consisting of a transparent plastic glass with a screw cap, which is an airtight container with a capacity of 100 dm ³ , in which anaerobiosis conditions are created by the chemical generator CO ₂ housed in replaceable bags, each containing a dry pressed sample of sodium bicarbonate and citric acid, a capillary path system for filling filling with water and laying out of filter paper, which ensures the duration of operation of the chemical generator Activation of chemical components is achieved by introducing into the bag 10 ml of distilled water after loading the container with crops immediately before sealing.

Данная система анаэробиоза привлекает внимание бактериологов, поскольку имеет значительные методологические преимущества перед ранее описанными: позволяет размещать в условиях анаэробиоза чашки Петри, штативы с пробирками, флаконы со средами, осуществлять визуальный контроль за состоянием посевов, обходиться без дополнительного газонаполнительного оборудования. This anaerobiosis system attracts the attention of bacteriologists because it has significant methodological advantages over the previously described: it allows you to place Petri dishes, racks with test tubes, bottles with media under conditions of anaerobiosis, carry out visual monitoring of the condition of crops, do without additional gas-filling equipment.

Однако с описанном устройстве не устранены контакт бакматериала с кислородом воздуха при пересевах, необходимость нарушения условий анаэробиоза при внесении или изъятии одного посева, необходимость сочетания с другими устройствами для забора и транспортировки бакматериала. However, the contact of the bacterial material with air oxygen during reseeding, the need to violate the conditions of anaerobiosis during the introduction or removal of one seeding, the need for combination with other devices for collecting and transporting the bacterial material, are not eliminated with the described device.

Предлагаемое устройство для автономного анаэробиоза, разового использования, отличается тем, что герметичный контейнер выполнен в виде двухкамерного вертикального цилиндра с двумя разновеликими патрубками и герметизирующими колпачками на них, нижняя камера которого сообщается с просветом патрубков и предназначена для размещения бакматериала и питательной среды, верхняя камера на 2/3 cнизу заполнена химическим генератором и ограничительными прокладками, а оставшаяся часть сообщается с просветом одного из патрубков посредством технологического окна. The proposed device for autonomous anaerobiosis, single use, is characterized in that the sealed container is made in the form of a two-chamber vertical cylinder with two different-sized pipes and sealing caps on them, the lower chamber of which communicates with the lumen of the pipes and is designed to accommodate bacterial material and nutrient medium, the upper chamber on 2/3 below is filled with a chemical generator and restrictive gaskets, and the remaining part communicates with the lumen of one of the pipes by means of techno ogicheskogo window.

На чертеже показано предлагаемое устройство. The drawing shows the proposed device.

Устройство выполнено из стандартных трубчатых материалов трех типоразмеров, диаметром 1,4; 2,0; 8,1 мм, соответствующих ТУ 64-3-123-78 и ТУ 64-3013-81, из пластиката медицинского, представляющего собой прозрачный и эластичный полимер. Все элементы жестко соединены в единую герметичную микроконструкцию. Двухкамерный вертикальный цилиндр 1 выполнен из отрезка трубки большего диаметра D длиной 15D, внутренний объем которого поперечно поделен на камеры в соотношении 3:1 снизу. Два разновеликих патрубка 2 выполнены из отрезков трубки наименьшего диаметра длиной 8D и 6D. Они служат для инокуляции (всасывания) бакматериала, введения питательной среды и отведения избытка газа, водяных паров соответственно. Различная длина патрубков введена для удобства при инокуляции бакматериала, для предотвращения прямого заброса бакматериала и питательной среды из патрубка в патрубок, а также с целью их маркировки. Герметизирующие колпачки 3, жестко связанные с вершинами патрубков, предназначены для восстановления герметичности устройства после забора бакматериала и выполнены из отрезков трубки среднего диаметра длиной 2D, при этом диаметр патрубка и просвет колпачка обеспечивают плотное соединение. Нижняя камера 4 служит для размещения бакматериала и питательной среды и сообщается с просветом обоих патрубков. Верхняя камера 5 заполнена на 2/3 объема снизу химическим генератором 6 CO₂, представляющим собой равномерно смешанные навески порошкообразных компонентов: натрия бикарбоната и лимонной кислоты в весовом соотношении 1,31:1 (соответственно молярной массе), и ограничительными прокладками 7, выполненными из хлопчатобумажной ваты. Ограничительные прокладки препятствуют распространению компонентов химического генератора по всему объему камеры, накапливают водяной конденсат, обеспечивая длительность работы генератора. Технологическое окно 8 выполнено в одном из патрубков, предпочтительно в коротком (различие несущественно), площадью не менее двух просветов патрубка. Окно сообщает свободный объем верхней камеры с просветом патрубка и необходимо для поступления водяных паров к химическому генератору. Жесткие и герметичные соединения полимерных деталей в устройстве выполнены за счет швов 9 термосварки. С целью сохранения просветов патрубков во время сварки использованы монолитные цилиндрические протекторы соответствующего диаметра. Возможно использование других типов жестких соединений: склейка, литье, герметизация компаундом, этапная горячая формовка. Предварительная стерилизация деталей производится в 6%-ном растворе перекиси водорода при 48-52^оС в течение 3 ч с последующей сушкой горячим воздухом при температуре 75-87^оС до полного исчезновения влаги. Окончательная стерилизация парами абсолютного этанола 90 с, перед окончательной герметизацией устройства после сборки производится продувка CO₂ 30 мл.The device is made of standard tubular materials of three sizes, with a diameter of 1.4; 2.0; 8.1 mm, corresponding to TU 64-3-123-78 and TU 64-3013-81, made of medical plastic compound, which is a transparent and elastic polymer. All elements are rigidly connected into a single sealed microstructure. The two-chamber vertical cylinder 1 is made of a segment of a tube of larger diameter D of length 15D, the internal volume of which is transversely divided into chambers in a ratio of 3: 1 from the bottom. Two different-sized nozzles 2 are made of segments of the smallest diameter tube length 8D and 6D. They serve for inoculation (absorption) of the bacterial material, the introduction of a nutrient medium and the removal of excess gas, water vapor, respectively. Different lengths of nozzles have been introduced for convenience in the inoculation of the bacterial material, to prevent direct reflux of the bacterial material and the nutrient medium from the nozzle to the nozzle, and also for the purpose of marking them. The sealing caps 3, rigidly connected to the tops of the nozzles, are designed to restore the tightness of the device after the intake of the material and are made of segments of a medium-diameter tube with a length of 2D, while the diameter of the nozzle and the lumen of the cap provide a tight connection. The lower chamber 4 serves to accommodate the bacterial material and the nutrient medium and communicates with the lumen of both nozzles. The upper chamber 5 is filled to 2/3 of the volume from below with a chemical generator 6 CO ₂ , which is a uniformly mixed sample of powdered components: sodium bicarbonate and citric acid in a weight ratio of 1.31: 1 (respectively, molar mass), and restrictive gaskets 7 made of cotton wool. Restrictive gaskets prevent the spread of the components of the chemical generator throughout the chamber, accumulate water condensate, ensuring the duration of the generator. Technological window 8 is made in one of the nozzles, preferably in a short (the difference is not significant), the area of at least two gaps of the nozzle. The window informs the free volume of the upper chamber with the clearance of the nozzle and is necessary for the flow of water vapor to the chemical generator. Rigid and tight joints of polymer parts in the device are made due to seams 9 of heat sealing. In order to preserve the gaps of the pipes during welding, monolithic cylindrical protectors of the corresponding diameter were used. It is possible to use other types of rigid joints: gluing, molding, compound sealing, step hot molding. Pre-sterilization of parts made in 6% solution of hydrogen peroxide at 48-52 ^{° C} for 3 hours, followed by drying with hot air at a temperature of 75-87 ^{° C} until complete disappearance of moisture. Final sterilization with absolute ethanol vapor for 90 s; before final sealing of the device after assembly, 30 ml of CO _{2 is} purged.

В устройстве использован принцип вытеснения воздушной среды углекислым газом с испарительно-конденсационным механизмом активации химического генератора, обеспечивающим автономность газонаполнения. Исходя из этого нижняя камера выполняет функции испарителя, патрубок с технологическим окном транспортирует водяные пары, верхняя же камера их конденсирует. Ограничительные прокладки накапливают водяной конденсат, предотвращая быстрое истощение химического генератора. Герметизирующие колпачки обеспечивают наличие малого избыточного давления газа в камерах и сброс его избытков. Пороговое значение сброса по давлению зависит от глубины посадки колпачка на патрубок. При работе с устройством возможно использование двух режимов газонаполнения: форсированого и поддерживающего. Форсированный режим достигается введением в нижнюю камера питательной среды, подогретой до 37^оС, или изолированным термостатированием нижней камеры при 37,0^оС на водяной бане. В этом случае конденсат образуется спустя 2-3 мин после загрузки нижней камеры. Поддерживающий режим газонаполнения достигается термостатированием всего устройства при 37,0^оС или хранением при температуре 20,5-25,0^оС и относительной влажности не более 70% Данный режим обеспечивает работу химического генератора не менее 56 ч.The device uses the principle of air displacement with carbon dioxide with an evaporation-condensation mechanism for activating a chemical generator, which ensures autonomy of gas filling. Based on this, the lower chamber performs the functions of an evaporator, a pipe with a technological window transports water vapor, and the upper chamber condenses them. Restrictive gaskets accumulate water condensate, preventing the rapid depletion of the chemical generator. Sealing caps provide a small excess pressure of the gas in the chambers and the discharge of its excess. The threshold pressure relief depends on the depth of the cap on the nozzle. When working with the device, it is possible to use two gas filling modes: forced and supporting. Forced mode achieved by introducing into the lower chamber of the nutrient medium, preheated to 37 ^{° C,} or lower chamber isolated by incubation at 37.0 ^{° C} in a water bath. In this case, condensate is formed 2-3 minutes after loading the lower chamber. Supporting gas filling mode is achieved by incubation of the whole device at ^about 37.0 C or storage at a temperature of 20,5-25,0 ^{° C} and a relative humidity of not more than 70% This mode provides the chemical operation of the generator is not less than 56 hours.

Контроль за условиями анаэробиоза в устройстве осуществляется при помощи цветного индикатора резазурина, который вводится в питательную среду из расчета 0,002 г на 1 л. При появлении кислорода в газовой среде индикатор окисляется, давая розовое окрашивание питательной среды. Порядок работы с устройством несложен, для его обеспечения требуется только общепринятое оборудование: этанол 96^о, спиртовая горелка, ножницы остроконечные, шприцы с иглами стерильные разового использования типа "Луер" емкостью 5 мл, зажим хирургический прямой типа "Бильрот", штатив для пробирок. Ножницы и зажим дополнительно стерилизуют в пламени горелки перед каждым использованием. Перед забором бакматериала патрубки и колпачки деконтаминируют этанолом 30 с. При вскрытии источника бакматериала длинный патрубок срезают по нижней границе колпачка, просвет патрубка погружают в бакматериал. Пальцевым давлением на нижнюю камеру вытесняют часть газа (2-3 пузырька), материал инокулируют в патрубок, устраняя давление на нижнюю камеру. Сразу за этим вскрывают ампулу с жидкой питательной средой для анаэробов, 1,0 мл которой забирают шприцем с иглой и вводят в длинный патрубок. Непосредственно перед введением срезают короткий патрубок по нижней границе колпачка. По окончании посева просвет колпачков вскрывается отсечением шва термосварки с одной стороны. Герметичность устройства восстанавливается плотной посадкой колпачков на вершины патрубков при помощи прямого хирургического зажима. Устройство с посевом помещали в вертикальном положении в штатив до перемещения в термостат.Monitoring the conditions of anaerobiosis in the device is carried out using a color indicator of resazurin, which is introduced into the nutrient medium at the rate of 0.002 g per 1 liter. When oxygen appears in the gaseous medium, the indicator oxidizes, giving a pink color to the nutrient medium. Working with the device is simple, to secure it only requires conventional equipment: ethanol 96 ^O alcohol burner pointed scissors, syringes with needles sterile disposable type "Luer" capacity of 5 ml, clamp surgical direct type "Billroth" rack for test tubes. The scissors and clamp are further sterilized in the burner flame before each use. Before sampling the bacterial material, the pipes and caps are decontaminated with ethanol for 30 s. When opening the source of the bakmaterial, a long pipe is cut off along the lower boundary of the cap, the lumen of the pipe is immersed in the bakmaterial. Finger pressure on the lower chamber displaces part of the gas (2-3 bubbles), the material is inoculated into the nozzle, eliminating pressure on the lower chamber. Immediately after this, open an ampoule with a liquid nutrient medium for anaerobes, 1.0 ml of which is taken with a syringe with a needle and injected into a long pipe. Immediately prior to administration, a short tube is cut off along the lower boundary of the cap. At the end of sowing, the lumen of the caps is opened by cutting off the heat seal seam on one side. The tightness of the device is restored by tightly fitting the caps to the tops of the nozzles using a direct surgical clamp. The sowing device was placed upright in a tripod before moving to the thermostat.

При отработке и испытании методики посевов использовали жидкую питательную среду для анаэробов следующего состава: "Питательная среда для контроля стерильности сухая" производства МНИИВС им. И.И.Мечникова 33 г, твин 80-1,0 г, крахмал растворимый 160 г, гемин 0,001%-ный раствор в 0,1NaOH 1,0 мл, лизированная кровь 1,0 мл, вода дистиллированная до 1000 мл. Питательную среду стерилизовали автоклавированием 15 мин при 1 атм, разливали в ампулы по 2,0 мл в горячем виде, ампулы герметизировали и хранили в холодильнике при -6^оС. Перед использованием питательную среду регенерировали на водяной бане при 80^оС 20 мин, давая остыть до 37,0^оС перед введением в устройство.When testing and testing the sowing method, we used a liquid nutrient medium for anaerobes of the following composition: “Nutrient medium for dry sterility control” manufactured by the Moscow Scientific and Research Institute for Advanced Medicine I.I. Mechnikova 33 g, tween 80-1.0 g, soluble starch 160 g, hemin 0.001% solution in 0.1NaOH 1.0 ml, lysed blood 1.0 ml, distilled water to 1000 ml. The culture medium was sterilized by autoclaving 15 min at 1 atm, dispensed into vials at 2.0 ml of hot, sealed vials and stored in a refrigerator at ^about -6 C. Before use, the nutrient medium is regenerated in a water bath at 80 ° ^C for 20 minutes, giving cool to 37.0 ^about C before introducing into the device.

При работе с устройством отмечены следующие положительные черты: время забора и пересева бакматериала не превышало 3 мин, порядок работы несложен и обеспечивается общепринятым оборудованием, а малый вес и габариты обеспечивают удобство при заборе, хранении, транспортировке и культивации в термостате. When working with the device, the following positive features were noted: the time of sampling and reseeding of the bakmaterial did not exceed 3 minutes, the operating procedure is simple and provided by generally accepted equipment, and its light weight and dimensions provide convenience during collection, storage, transportation and cultivation in a thermostat.

Таким образом, предлагаемое устройство для автономного анаэробиоза, разового использования обеспечивает максимальное сокращение времени контакта с кислородом воздуха, упрощение методологии высевания анаэробов. Thus, the proposed device for autonomous anaerobiosis, single use provides the maximum reduction in contact time with oxygen, simplification of the methodology for sowing anaerobes.

Claims

A device for autonomous anaerobiosis of single-use microorganisms, including a sealed container with a chemical generator CO ₂ , characterized in that the sealed container is made in the form of a two-chamber cylinder with the formation of the upper and lower chambers, equipped with different sized pipes with sealing caps on them, while the lower chamber is in communication with indicated by the nozzles and is designed to accommodate the bakmateriala and nutrient medium, and the upper chamber two thirds of the volume below is filled with a chemical generator CO ₂ restrictive gaskets, and the remaining part of the volume of the chamber communicates with a pipe through the process window for the admission of water vapor to a chemical generator.