RU2059972C1 - Мембрана для разделения компонентов иммунохимической реакции - Google Patents

Мембрана для разделения компонентов иммунохимической реакции Download PDF

Info

Publication number
RU2059972C1
RU2059972C1 RU93031150A RU93031150A RU2059972C1 RU 2059972 C1 RU2059972 C1 RU 2059972C1 RU 93031150 A RU93031150 A RU 93031150A RU 93031150 A RU93031150 A RU 93031150A RU 2059972 C1 RU2059972 C1 RU 2059972C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
membrane
analysis
kda
enzyme
components
Prior art date
Application number
RU93031150A
Other languages
English (en)
Other versions
RU93031150A (ru
Inventor
Б.Б. Дзантиев
А.Н. Блинцов
Н.К. Гапонова
А.Ф. Бобкова
Н.М. Нацвлишвили
М.И. Гольдштейн
И.Г. Атабеков
В.А. Изумрудов
А.Б. Зезин
А.А. Резчиков
А.П. Осипов
В.П. Князева
Л.Н. Трофимец
Original Assignee
Институт биохимии им.А.Н.Баха РАН
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Институт биохимии им.А.Н.Баха РАН filed Critical Институт биохимии им.А.Н.Баха РАН
Priority to RU93031150A priority Critical patent/RU2059972C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2059972C1 publication Critical patent/RU2059972C1/ru
Publication of RU93031150A publication Critical patent/RU93031150A/ru

Links

Landscapes

  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Назначение: изобретение относится к биотехнологии, а точнее к иммуноферментному анализу. Сущность изобретения: мембрана представляет собой мембранный фильтр из капрона или нейлона, или поливинилиденфторида, на поверхности которого иммобилизованы производные алкилированного поли-4-винилпиридина с мол.м. 1000 - 20000 КДа.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, точнее к иммуноферментному анализу, и представляет собой мембрану для разделения компонентов иммунологической реакции.
Известны различные способы проведения твердофазного иммуноферментного анализа ( ИФА), основанные на иммобилизации антител на твердых носителях, образовании специфических иммунокомплексов на носителе с определяемым антигеном и их выявлении с помощью ферментной метки [1]
Важным пунктом для проведения процедуры ИФА является стадия отделения меченых антител, не связанных в иммунокомплекс с определяемым антигеном, от меченых антител, связанных в иммунокомплекс. В процедурах ИФА гетерогенного типа для этого проводят иммобилизацию антител (антигена) на твердых нерастворимых носителях. Однако это приводит к значительному увеличению длительности анализа.
Можно также проводить разделение компонентов иммунохимической реакции путем фильтрации на пористых мембранах, что упрощает процедуру проведения анализа.
Известна мембрана для разделения компонентов иммунохимической реакции, выполненная из синтетического полимерного материала (поливинилхлорида), с иммобилизованным полиэлектролитом [2]
Сущность изобретения заключается в том, что в качестве полимерного материала используют мембранный фильтр из капрона или найлона или поливинилхлорида, а в качестве иммобилизованного полиэлектролита используют производные алкилированного поли-4-винилпиридина с молекулярной массой 1000-2000 кДа. В качестве поликатиона можно использовать поли-N-этил-4-винилпиридиний бромид (М.В.w1000-2000 кДа), а также различные его производные поликатионы, содержащие 2-20% С2Н4ОН-групп, 2-20% гидрофобных цитильных остатков и т.п.).
Иммобилизацию поликатиона на мембранном фильтре проводят следующим образом. Мембранный фильтр из синтетического материала помещают в водный раствор поликатиона с концентрацией 10 мкг/мл и инкубируют в нем 1-2 мин при комнатной температуре. Мембраны промывают в дистиллированной воде и высушивают на воздухе при комнатной температуре.
П р и м е р 1. Анализ НВs-антигена.
В качестве антител используют гамма-глобулиновую фракцию кроличьей антисыворотки против НВs-антигена (НBsAg) c титром 1 · 105.
В качестве антигена используют коммерческий препарат НВsAg.
Иммуносорбент на основе полиметакриловой кислоты (ПМАК) с молекулярной массой (МW) 200 кДа получают ковалентным связыванием антител с ПМАК, используя в качестве сшивающих агентов водорастворимые карбодиимиды: 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид гидрохлорид или 1-циклогексил-3-(2-морфолино-4-этил)-карбодиимид п-толуолсульфонат в присутствии N-оксисукцинимида.
В качестве фермента используют пероксидазу хрена с RZ=3,0 (Д403280).
Конъюгат иммуноглобулинов с пероксидазой (ПХ/ЕС 1.11.1.7) получают методом окисления углеводного компонента фермента периодатом натрия.
Нерастворимый заряженный полимер готовят следующим образом. Капроновые мембраны, изготовленные по технологии НИИМедполимер (г. Москва) инкубируют 1 мин. в водном растворе поликатиона поли-N-этил-4-винилпиридиний бромида (
Figure 00000001
2000 кДа) с концентрацией 10 мкг/мл при комнатной температуре. Затем мембраны промывают в дистиллированной воде и используют для разделения компонентов аналитической системы.
В серию инкубационных пробирок, содержащих по 0,1 мл раствора НВsAg в концентрациях, полученных двухкратным разведением исходного раствора: 320; 160; 80; 40; 20; 10; 5; 2.5 и 1,25 нг/мл в 0,01 М К-фосфатном буфере, рН 7,2 (0,15 М NaCL; 0,05% Твин-20) добавляют 0,1 мл раствора конъюгата меченных ферментом антител (1 · 10-9 м). Затем в пробирку приливают 0,1 мл раствора иммуносорбента (1 · 10-9 м по концентрации иммуноглобулинов) и инкубируют 5 мин при комнатной температуре.
Разделение компонентов раствора проводят пропусканием его через капроновый фильтр с иммобилизованным поликатионом.
Детекцию ферментной метки на фильтре осуществляют путем инкубации его в растворе субстратов, содержащем 3,3'-диаминобензидин (0,5 мг/мл), перекись водорода (10-3 м) и СоСl2 (0,2%).
Пересчет интенсивности окрашивания фильтра в концентрацию определяемого НВsAg проводят по калибровочному графику, полученному с использованием стандартов НВsАg в присутствии компонентов нормальной сыворотки крови.
Чувствительность метода составляет 1 нг/мл HBsAg. Время проведения анализа 10 мин.
П р и м е р 2. Анализ Х-вируса картофеля (ХВК).
В качестве антител используют гамма-глобулиновую фракцию кроличьей антисыворотки к ХВК с титром 1 · 105. Гамма-глобулиновую фракцию сыворотки крови выделяют двухкратным осаждением в 20%-ном водном растворе полиэтиленгликоля (МW 6 кДа) с последующим диализом против 0,01 М К-фосфатного буфера (0,1 М NaCl; pH 7,4).
В качестве фермента-маркера используют щелочную фосфатазу из кишечника теленка (1000-2500 IU/мг). Введение ферментной метки в молекулу антител проводят с помощью гетеробифункционального сшивающего агента 3-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида, который последовательно взаимодействует с аминогруппами фермента и SH-группами частично восстановленных молекул антител.
В качестве антигена используют высокоочищенный вирусный препарат ХВК. Препаративное выделение очищенных экстрактов ХВК, его очистку и концентрирование проводят по стандартной методике, используя несколько циклов дифференциального центрифугирования.
Растительный сок получают, растирая материал в фарфоровой ступке с добавлением 0,01 М К-фосфатного буфера (0,1 М NaCl; 0,1% тритон Х-100; pН 7,4) в соотношении 1: 5 (растительная масса/объем буфера). Полученные экстракты осветляют центрифугированием при 8000 об/мин 5 мин.
В серию инкубационных пробирок, содержащих 0,1 мл исследуемого образца (растительный сок, экстракт или очищенный препарат ХВК), добавляют 0,1 мл раствора меченных ферментом антител (10-9 м) и инкубируют 15 мин при комнатной температуре.
Разделение компонентов аналитической смеси проводят, пропуская ее через найлоновый фильтр (Эксперим. лаб. Р/К Хийу Калур, г. Таллинн) с иммобилизованным поликатионом, представляющий собой покрытую тонким слоем нерастворимого заряженного полимера полимерную матрицу, симметричную в сколе. Модифицированный поликатионом фильтр получают следующим образом. Найлоновые мембраны инкубируют 1 мин в водном растворе поликатионаалкилированного поли-4-винилпиридина (
Figure 00000002
2000 кДа), содержащего 80% N-этильных заместителей и 20% N-оксиэтильных заместителей, при комнатной температуре. Затем мембраны промывают дистиллированной водой и используют для разделения компонентов аналитической системы.
Детекцию ферментной метки на фильтре осуществляют после инкубации его в растворе субстратов, содержащем Fast Blue RR (1 мг/мл) и альфа-нафтилфосфат (1,25 мг/мл) в 0,1 М трис-НСl буфере, рН 9,0-9,3. Пересчет интенсивности окрашивания фильтра в концентрацию измеряемого ХВК проводят по калибровочному графику, полученному с использованием стандартных препаратов ХВК.
Чувствительность метода составляет 3-8 нг/мл ХВК. Время анализа не превышает 30 мин.
П р и м е р 3. Анализ У-вируса картофеля (УВК).
В качестве антител используют гамма-глобулиновую фракцию кроличьей антисыворотки к УВК с титром 1 · 105.
В качестве фермента-маркера используют щелочную фосфатазу из кишечника теленка (1000-2500 IU/мг).
В качестве антигена используют высокоочищенный вирусный препарат УВК. Препаративное выделение УВК проводят по стандартной методике.
Разделение компонентов аналитической смеси проводят на поливинилиденфторидной мембране (НИИМедполимер, г. Москва) с адсорбированным поликатионом поли-N-этил-4-винилпиридиний бромидом (
Figure 00000003
2000 кДа), содержащем в N-положении 10% цитильных групп. Предварительно мембрану инкубируют в водном растворе поликатиона (10 мг/мл) при комнатной температуре в течение 1 мин, промывают дистиллированной водой и используют для разделения компонентов аналитической системы.
Детекцию ферментной метки на фильтре осуществляют после инкубации его в растворе субстратов, содержащем Fast Blue RR (1 мг/мл) и альфа-нафтилфосфат (1,25 мг/мл) в 0,1 М трис -НСl буфере, рН 9,2.
Приготовление всех остальных растворов и проведение анализа осуществляют по описанию в примере 2.
Чувствительность метода составляет 5 нг/мл УВК, время анализа не превышает 30 мин.
П р и м е р 4. Анализ Х-вируса картофеля (ХВК).
В анализе ХВК используют поликатион поли-N-этил-4-винилпиридиний бромид с мол.м. 1000 кДа.
Приготовление остальных растворов и реагентов для анализа ХВК, а также проведение анализа осуществляют согласно примеру 2.
Чувствительность метода 5-10 нг/мл ХВК, время анализа не превышает 30 мин.
П р и м е р 5. Анализ Х-вируса картофеля (ХВК).
В анализе ХВК используют поликатион поли-N-этил-4-винилпиридиний бромид с молекулярной массой 1000 кДа, содержащий в N-положении 20% цитильных остатков.
Приготовление остальных растворов и реагентов для анализа ХВК, а также проведение анализа осуществляют согласно примеру 2.
Чувствительность метода 5-8 нг/мл ХВК, время анализа не превышает 30 мин.
Синтетические мембранные фильтры, изготовленные из капрона, найлона или поливинилиденфторида устойчивы в водных средах (рН 2-13), а также во многих органических растворителях. Фильтрационная и сорбционная способность таких мембранных фильтров не зависит от их расположения в фильтрующих устройствах. Предлагаемые мембранные фильтры гидрофильны, поэтому они смачиваются равномерно по всей поверхности сразу же при контакте с водой или другими водными растворами. Мембранные фильтры из капрона, найлона и поливинилиденфторида характеризуются высокой прочностью и эластичностью в сухом и смоченном состояниях, что позволяет сохранить целостность мембран при вложении их в фильтрующее устройство, а также гофрировать их с целью получения фильтров с большими фильтрационными и сорбционными свойствами. Технология производства предложенных синтетических фильтров проста и экономична, что делает возможным их применение для массовых аналитических определений.

Claims (1)

  1. МЕМБРАНА ДЛЯ РАЗДЕЛЕНИЯ КОМПОНЕНТОВ ИММУНОХИМИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ, выполненная из полимерного материала с иммобилизованным полиэлектролитом, отличающаяся тем, что в качестве полимерного материала использован мембранный фильтр из капрона, или найлона, или поливинилиденфторида, а в качестве иммобилизованного полиэлектролита использованы производные алкилированного поли-4-винилпиридина с мол.м. 1000 2000 КДа.
RU93031150A 1993-06-02 1993-06-02 Мембрана для разделения компонентов иммунохимической реакции RU2059972C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU93031150A RU2059972C1 (ru) 1993-06-02 1993-06-02 Мембрана для разделения компонентов иммунохимической реакции

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU93031150A RU2059972C1 (ru) 1993-06-02 1993-06-02 Мембрана для разделения компонентов иммунохимической реакции

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2059972C1 true RU2059972C1 (ru) 1996-05-10
RU93031150A RU93031150A (ru) 1996-06-10

Family

ID=20143181

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU93031150A RU2059972C1 (ru) 1993-06-02 1993-06-02 Мембрана для разделения компонентов иммунохимической реакции

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2059972C1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2182599C1 (ru) * 2000-11-10 2002-05-20 Государственное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Способ получения диагностикума для определения микроорганизмов семейства enterobacteriaceae
RU2200945C2 (ru) * 1997-12-31 2003-03-20 Стаго Энтернасьональ Устройство, способ и прибор для количественного анализа по меньшей мере одного конкретного компонента в пробе продукта

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
1. Егоров А.М. и др. Иммуноферментный анализ. Успехи биоорганического катализа. М.: МГУ, 1979, с.239-275. 2. Заявка Великобритании 1571418, G 01N 33/50, 1980. *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2200945C2 (ru) * 1997-12-31 2003-03-20 Стаго Энтернасьональ Устройство, способ и прибор для количественного анализа по меньшей мере одного конкретного компонента в пробе продукта
RU2182599C1 (ru) * 2000-11-10 2002-05-20 Государственное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Способ получения диагностикума для определения микроорганизмов семейства enterobacteriaceae

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4407943A (en) Immobilized antibody or antigen for immunoassay
US4960692A (en) Assay employing binding pair members on particles and on a filter or membrane
US4434236A (en) Immunoassay wherein labeled antibody is displaced from immobilized analyte-analogue
US4228237A (en) Methods for the detection and determination of ligands
US5164299A (en) Use of a mixture of conjugated and unconjugated solid phase binding reagent to enhance the performance of assays
JPH0312705B2 (ru)
FI89984B (fi) Enstegsimmuntest foer bestaemning av antigenspecifika antikroppar hoerande till immunoglobulingruppen a, m, d eller e och medel daerfoer
US4474878A (en) Sandwich EIA for antigen associated with hepatitis
US4157280A (en) Test set for detecting the presence of antigens associated with hepatitis
US4642285A (en) Sandwich EIA for antigen
US6203706B1 (en) Synthetic particles as agglutination reagents
EP0644950A4 (en) ASSAY FOR THE DETECTION OF HIV ANTIGEN AND HIV ANTIBODIES.
JPH04233461A (ja) 同時アッセイ法
EP0498352A2 (en) Assay for Lyme disease
AU619019B2 (en) An article for performing immunological assays utilizing organic dyes and methods for producing and utilizing same
US5641624A (en) Method for measuring anti-HIV-1 p24 antibody and use thereof
RU2059972C1 (ru) Мембрана для разделения компонентов иммунохимической реакции
CA1334825C (en) Solid phase indicator red blood cells and method
EP0217845B1 (fr) Procede de determination immunologique d'une substance biologique dans un echantillon
US5231004A (en) Use of heme-containing proteins as stabilizers for enzyme-labeled immunoreactants
GB1597345A (en) Diagnostic immunochemical test materials and procedure
US5166054A (en) Method for immunoassay using lactoperoxidase, starch and iodine
Hoffman [45] Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for immunoglobulin E and blocking antibodies
CA2047742A1 (en) Method and diagnostic test kit for detection of anti-cardiolipin
RU2038600C1 (ru) Мембрана для разделения компонентов иммунологической реакции