RU2057763C1 - Hydrophile polymer sorbent - Google Patents
Hydrophile polymer sorbent Download PDFInfo
- Publication number
- RU2057763C1 RU2057763C1 RU92009086/04A RU92009086A RU2057763C1 RU 2057763 C1 RU2057763 C1 RU 2057763C1 RU 92009086/04 A RU92009086/04 A RU 92009086/04A RU 92009086 A RU92009086 A RU 92009086A RU 2057763 C1 RU2057763 C1 RU 2057763C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sorbent
- copolymer
- weight
- parts
- activated
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Изобретение относится к органическим полимерным гидрофильным сорбентам для жидкостной хроматографии и может быть использовано для разделения биополимеров (белков, ферментов, аминокислот и их фрагментов, олиго- и полисахаридов и т.п.). The invention relates to organic polymer hydrophilic sorbents for liquid chromatography and can be used to separate biopolymers (proteins, enzymes, amino acids and their fragments, oligo - and polysaccharides, etc.).
Известен ряд полимерных сорбентов (носителей) для жидкостной хроматографии на основе (мет)акриловых мономеров и сшивающих агентов, которые легко модифицируются, удобны в приготовлении и эффективны для различных вариантов хроматографического применения [1-2]
Известен носитель для жидкостной хроматографии, представяляющий собой пористый гранулированный сополимер глицидилмоновиниловых простых или сложных эфиров с алкиленгликольдивиниловым эфиром, модифицированный алкиленгликолем, полиэтиленгликолем или триолом в результате раскрытия эпоксидного кольца [3]
Недостатком такого носителя является низкая гидрофильность из-за отсутствия гидроксильных групп в сополимере до модификации и их недостаточное количество после модификации, т.е. используемые модификаторы несут мало гидроксильных групп, а количество реактивных эпоксидных групп в сополимере также небольшое. Такие носители неэффективны для разделения высокомолекулярных белковых молекул.A number of polymer sorbents (carriers) for liquid chromatography based on (meth) acrylic monomers and crosslinking agents are known, which are easily modified, convenient to prepare, and effective for various chromatographic applications [1-2]
A carrier for liquid chromatography is known, which is a porous granular copolymer of glycidyl monovinyl ethers or esters with alkylene glycol divinyl ether, modified with alkylene glycol, polyethylene glycol or triol as a result of the opening of the epoxy ring [3]
The disadvantage of such a carrier is low hydrophilicity due to the absence of hydroxyl groups in the copolymer before modification and their insufficient amount after modification, i.e. the modifiers used carry little hydroxyl groups, and the amount of reactive epoxy groups in the copolymer is also small. Such carriers are ineffective for the separation of high molecular weight protein molecules.
Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является гидрофильный разделяющий носитель для жидкостной хроматографии, получаемый водно-суспензион- ной гомополимеризацией диметакрилата пентаэритрита или водно-суспензионной сополимеризацией диметакрилата пентаэритрита и метакрилатного мономера, имеющего гидрофильную и/или гидрофильно превращаемую группу и модифицированный гидрофильным эпоксидсодержащим соединением. Причем сополимер, содержащий эпоксидные группы, перед модификацией подвергается щелочному гидролизу для раскрытия эпоксидных колец. Этот носитель имеет достаточно высокую неспецифическую сорбцию белковых молекул вследствие недостаточной гидрофильности и сложен в получении [4]
Задачей изобретения является получение гидрофильного полимерного макропористого сорбента, обладающего высокой механической и химической устойчивостью, высокой разрешающей способностью и эффективностью в процессах разделения биополимеров.The closest to the invention in technical essence and the achieved result is a hydrophilic separating carrier for liquid chromatography obtained by water-suspension homopolymerization of pentaerythritol dimethacrylate or water-suspension copolymerization of pentaerythritol dimethacrylate and a methacrylate hydrophilic hydrophilic and / or hydrophilic-converted and / or connection. Moreover, the copolymer containing epoxy groups, before modification is subjected to alkaline hydrolysis to open the epoxy rings. This carrier has a sufficiently high non-specific sorption of protein molecules due to insufficient hydrophilicity and is difficult to obtain [4]
The objective of the invention is to obtain a hydrophilic polymer macroporous sorbent with high mechanical and chemical resistance, high resolution and efficiency in the separation of biopolymers.
Указанный результат достигается гидрофильным полимерным сорбентом, представляющим собой продукт взаимодействия эпокси(мет)акрилатного сополимера и органического гидроксилсодержащего модификатора. Эпокси(мет)акрилатным сополимером является сополимер эпоксиалкил(мет)-акрилата общей формулы
CH2= 
CH 2 =
Количество органического гидроксилсодержащего модификатора 1,1-9,8% от массы смеси модификатора и сополимера. The amount of organic hydroxyl-containing modifier is 1.1-9.8% by weight of the mixture of modifier and copolymer.
Органическим гидроксилсодержащим модификатором является соединение, выбранное из группы активированных эпихлоргидрином многоатомных спиртов или декстранов. An organic hydroxyl-containing modifier is a compound selected from the group of epichlorohydrin-activated polyhydric alcohols or dextrans.
Максимальная гидрофильность сорбентов достигается при использовании в качестве органического гидроксилсодержащего модификатора активированных многоатомных спиртов, выбранных из группы пептитов и гекситов (ксилит, D- и L-сорбит, маннит, дульцит и т.д.) поливиниловых спиртов или активированных декстранов. The maximum hydrophilicity of sorbents is achieved when activated polyhydric alcohols selected from the group of peptites and hexites (xylitol, D- and L-sorbitol, mannitol, dulcite, etc.) of polyvinyl alcohols or activated dextrans are used as an organic hydroxyl-containing modifier.
Сорбент получают водно-суспензионной сополимеризацией эпоксилалкил(мет)акрилата и сшивающего мономера, взятых в соотношении от 10:90 до 90: 10, предпочтительно от 40:60 до 60:40, в присутствии органических растворителей порообразо- вателей, не реагирующих с эпоксидным кольцом. Пригодными растворителями являются н-бутанол, бутилацетат, изо-амиловый спирт, циклогексанол, октанол, додеканол, монохлорбензол и их смеси. The sorbent is obtained by water-suspension copolymerization of epoxylalkyl (meth) acrylate and a crosslinking monomer, taken in the ratio from 10:90 to 90:10, preferably from 40:60 to 60:40, in the presence of organic solvents of pore former that do not react with the epoxy ring . Suitable solvents are n-butanol, butyl acetate, iso-amyl alcohol, cyclohexanol, octanol, dodecanol, monochlorobenzene and mixtures thereof.
В качестве инициатора радикальной полимеризации может использоваться динитрилазобисизомасляной кислоты (ДИНИЗ) или пероксидные инициаторы. As the initiator of radical polymerization, dinitrilazobisisobutyric acid (DINIZ) or peroxide initiators can be used.
В качестве стабилизаторов суспензии могут использоваться поливиниловые спирты, поливинилпирролидон, карбоксиметилцеллюлоза и/или другие органические и неорганичесие диспергаторы. As stabilizers for the suspension, polyvinyl alcohols, polyvinylpyrrolidone, carboxymethyl cellulose and / or other organic and inorganic dispersants can be used.
Полимеризацию проводят при непрерывном перемешивании в течение 5-10 ч при 70-80оС.The polymerization is carried out with continuous stirring for 5-10 hours at 70-80 about C.
Активирование многоатомных спиртов или декстранов проводится следующим образом. В реактор с мешалкой, термометром и обратным холодильником загружают 100 мас.ч. гидроксилсодержащего агента, 100 мас.ч. воды и 20 мас.ч. гидроксида натрия. Смесь перемешивают до растворения реагентов, затем к ней прибавляют 40 мас.ч. эпихлоргидрина и перемешивание продолжают еще 2 ч при 50оС с получением активированного многоатомного спирта или декстрана.The activation of polyhydric alcohols or dextrans is carried out as follows. 100 parts by weight are charged to a reactor with a stirrer, a thermometer and a reflux condenser. hydroxyl-containing agent, 100 parts by weight water and 20 parts by weight sodium hydroxide. The mixture is stirred until the reagents are dissolved, then 40 parts by weight are added to it. epichlorohydrin and stirring continued for a further 2 hours at 50 ° C to give a polyhydric alcohol or an activated dextran.
П р и м е р 1. Раствор, содержащий 52 мас.ч. глицидилоксиэтилметакрилата, 48 мас.ч технической смеси ди-, три- и тетраметакрилатов пентаэритрита, 3 мас.ч. ДИНИЗа, 65 мас.ч. бутилацетата и 65 мас.ч. изоамилового спирта, суспензируют в 1000 мл 1%-ного раствора поливинилового спирта в воде. При непрерывном перемешивании со скоростью 400 об/мин проводят сополимеризацию при 70оС в течение 6 ч. Гранульную суспензию фильтруют и промывают горячей водой и спиртом, получая сферические частицы с количеством поверхностных эпоксидных групп 2,8 мг-экв/г сух. сорбента (определено потенциометрическим титрованием избытка бромоводородной кислоты в ацетоне). Гранулы подвергают модификации активированным маннитом в массовом соотношении 1:1 при 70оС в течение 4 ч. После промывки водой получают гидрофильный сорбент с содержанием связанного маннита 5,7 мас. и неспецифической сорбцией белковых стандартов не более 2% Предел эксклюзии (предел исключаемой молекулярной массы) по декстранам от 10000 до 10000000 Дальтон. Сорбенты выдерживают давление до 100 атм.PRI me R 1. A solution containing 52 wt.h. glycidyloxyethyl methacrylate, 48 parts by weight of a technical mixture of pentaerythritol di-, tri- and tetramethacrylates, 3 parts by weight DYNIZA, 65 parts by weight butyl acetate and 65 parts by weight isoamyl alcohol, suspended in 1000 ml of a 1% solution of polyvinyl alcohol in water. With continuous stirring at a speed of 400 rev / min the copolymerization is carried out at 70 ° C for 6 hours. The pellet suspension was filtered and washed with hot water and alcohol, to give spherical particles having a number of surface epoxide groups of 2.8 meq / g dry. sorbent (determined by potentiometric titration of excess hydrobromic acid in acetone). The granules are subjected to modification with activated mannitol in a weight ratio of 1: 1. At 70 ° C for 4 hours After washing with water, hydrophilic adsorbent with bound mannitol content of 5.7 wt. and nonspecific sorption of protein standards of not more than 2%. The exclusion limit (the limit of excluded molecular weight) for dextrans from 10,000 to 10,000,000 Daltons. Sorbents withstand pressure up to 100 atm.
П р и м е р 2. Раствор, содержащий 48 мас.ч. глицидилоксиэтилакрилата, 52 мас.ч. диметакрилата пентаэритрита, 1 мас.ч. ДИНИЗа, 100 мас.ч. н-бутанола и 40 мас.ч. бутилацетата, суспендируют в 1000 мл 2%-ного раствора поливинилпирролидона в воде. Сополимеризацию проводят аналогично примеру 1. Получают сферические частицы, содержащие 2,3 мг-экв./г сух. сорбента эпоксидных групп. Полимерные гранулы модифицируют активированным ксилитом в массовом соотношении 1: 0,5 с получением сорбента, содержащего 1,1% связанного ксилита. Сорбент имеет неспецифическую сорбцию белковых стандартов до 5% и предел эксклюзии от 100-10000 Дальтон. Сорбент выдерживает давление до 30 атм. PRI me R 2. A solution containing 48 wt.h. glycidyloxyethyl acrylate, 52 parts by weight pentaerythritol dimethacrylate, 1 parts by weight DYNIZA, 100 parts by weight n-butanol and 40 parts by weight butyl acetate, suspended in 1000 ml of a 2% solution of polyvinylpyrrolidone in water. The copolymerization is carried out analogously to example 1. Get spherical particles containing 2.3 mEq. / G dry. sorbent of epoxy groups. The polymer granules are modified with activated xylitol in a mass ratio of 1: 0.5 to obtain a sorbent containing 1.1% bound xylitol. The sorbent has a non-specific sorption of protein standards of up to 5% and an exclusion limit of 100-10000 Daltons. Sorbent withstands pressure up to 30 atm.
П р и м е р 3. Раствор, содержащий 50 мас.ч. глицидилметакрилата, 50 мас.ч. технической смеси ди-, три- и тетраметакрилатов пентаэритрита, 2 мас. ч. ДИНИЗа, 60 мас.ч. бутилацетата, 60 мас.ч. изо-амилового спирта и 20 мас. ч. н-октанола, суспендируют в 1000 мл 1%-ного раствора поливинилового спирта в воде. Сополимеризацию проводят аналогично примеру 1. Получают сферические частицы, содержащие 2,8 мг-экв/г сух. сорбента эпоксидных групп, которые модифицируют активированным D-сорбитом в массовом соотношении 1:2 с получением сорбента, содержащего 7,2% связанного D-сорбита. Сорбент имеет неспецифическую сорбцию менее 3% и предел эксклюзии от 10000 до 2000000 Д. Сорбент выдерживает давление до 100 атм. PRI me R 3. A solution containing 50 wt.h. glycidyl methacrylate, 50 parts by weight technical mixture of di-, tri- and tetramethacrylates of pentaerythritol, 2 wt. hours of DYNIZA, 60 parts by weight of butyl acetate, 60 parts by weight iso-amyl alcohol and 20 wt. including n-octanol, suspended in 1000 ml of a 1% solution of polyvinyl alcohol in water. The copolymerization is carried out analogously to example 1. Get spherical particles containing 2.8 mEq / g dry. sorbent of epoxy groups, which are modified with activated D-sorbitol in a mass ratio of 1: 2 to obtain a sorbent containing 7.2% of bound D-sorbitol. The sorbent has nonspecific sorption of less than 3% and an exclusion limit of 10,000 to 2,000,000 D. The sorbent withstands pressure up to 100 atm.
П р и м е р 4. Все операции проводят аналогично примеру 1, кроме того, что в качестве сшивающего агента берут триметакрилат пентаэритрита, а активированный маннит берут в соотношении 1:3 к сополимеру. Получают сорбент, содержащий 9,8% связанного маннита, с неспецифической сорбцией белковых стандартов менее 2% Сорбент выдерживает давление до 70 атм и имеет предел эксклюзии от 10000-5000000 Дальтон. PRI me R 4. All operations are carried out analogously to example 1, except that as a cross-linking agent take pentaerythritol trimethacrylate, and activated mannitol is taken in a ratio of 1: 3 to the copolymer. A sorbent is obtained containing 9.8% bound mannitol with non-specific sorption of protein standards of less than 2%. The sorbent can withstand pressure up to 70 atm and has an exclusion limit of 10,000-5,000,000 Daltons.
П р и м е р 5. Раствор, содержащий 45 мас.ч. 10,11-эпоксиундецилметакрилата, 55 мас. ч. диметакрилата пентаэритрита, 2 мас.ч. ДИНИЗа, 60 мас.ч. бутилацетата, 60 мас.ч. циклогексанола и 20 мас.ч. додеканола, суспендируют в 100 мл 2% -ного раствора поливинилового спирта в воде. Сополимеризацию проводят аналогично примеру 1. Полученные сферические частицы, содержащие 1,7 мг-экв/г сухого сорбента эпоксидных групп модифицировали активированным поливиниловым спиртом (мол.м. 10000) в массовом соотношении 1:1 с получением сорбента, содержащего 1,7% связанного ПВС. Сорбент имеет неспецифическую сорбцию белковых молекул до 5% предел эксклюзии от 1000-100000 Дальтон. Сорбент выдерживает давление до 50 атм. PRI me R 5. A solution containing 45 wt.h. 10,11-epoxyundecylmethacrylate, 55 wt. including dimethacrylate pentaerythritol, 2 parts by weight DYNIZA, 60 parts by weight butyl acetate, 60 parts by weight cyclohexanol and 20 parts by weight dodecanol, suspended in 100 ml of a 2% solution of polyvinyl alcohol in water. The copolymerization is carried out analogously to example 1. The obtained spherical particles containing 1.7 mEq / g dry sorbent of epoxy groups were modified with activated polyvinyl alcohol (mol.m. 10000) in a mass ratio of 1: 1 to obtain a sorbent containing 1.7% bound PVA. The sorbent has non-specific sorption of protein molecules up to 5% exclusion limit from 1000-100000 Daltons. Sorbent withstands pressure up to 50 atm.
П р и м е р 6. Все операции проводят аналогично примеру 1, кроме того, что в качестве эпоксиалкил(мет)акрилатного мономера используют глицидилоксиэтилоксиэтилметакрилат и в качестве модификатора активированный декстран. До модификации сорбент содержит 2,2 мг-экв/г сух. сорбента эпоксидных групп. После модификации получают гидрофильный сорбент с содержанием связанного декстрана 5,2 мас. и неспецифической сорбцией белковых стандартов не более 2% Предел эксклюзии 1000-1000000 Дальтон. Сорбент выдерживает давление до 100 атм. PRI me R 6. All operations are carried out analogously to example 1, except that glycidyloxyethyloxyethyl methacrylate and activated dextran are used as the epoxyalkyl (meth) acrylate monomer. Before modification, the sorbent contains 2.2 mEq / g dry. sorbent of epoxy groups. After modification, a hydrophilic sorbent with a content of bound dextran of 5.2 wt. and nonspecific sorption of protein standards of not more than 2% Exclusion limit 1000-1000000 Daltons. Sorbent withstands pressure up to 100 atm.
Условия определения предела эксклюзии молекулярной массы одинаковы для всех носителей: колонка хроматографическая 0,9х12 см, элюент дистиллированая вода, скорость элюирования 0,3-0,4 см3/мин, концентрация декстранов в пробе 0,1% объем пробы 50·10-3 см, детектор проточный рефрактометр, температура 20оС, диаметр сферических частиц носителя 40-120 мкм.The conditions for determining the molecular weight exclusion limit are the same for all carriers: chromatographic column 0.9x12 cm, distilled water eluent, elution rate 0.3-0.4 cm 3 / min, dextran concentration in the sample 0.1% sample volume 50 · 10 - 3 cm, flow-through refractometer detector, temperature 20 о С, carrier spherical particles diameter 40-120 microns.
Условия определения неспецифической сорбции белковых молекул: колонка 0,9х12 см, элюент 0,1 н. фосфатный буфер рН 7, скорость элюирования 0,6 см3/мин, детектор спектрофотометр 280 нм и 410 нм, температура 20оС, диаметр носителя 10-40 мкм: белковые стандарты бычий сывороточный альбумин, цитохром С, ферритин, яичный алюбумин.Conditions for the determination of non-specific sorption of protein molecules: 0.9 x 12 cm column, 0.1 n eluent. pH 7 phosphate buffer, the elution rate of 0.6 cm 3 / min Detector Spectrophotometer 280 nm and 410 nm, temperature 20 C, medium diameter 10-40 microns: protein standard bovine serum albumin, cytochrome C, ferritin, egg alyubumin.
Определение поверхностных эпоксидных групп проводят потенциометрически на приборе И-120. The determination of surface epoxy groups is carried out potentiometrically on an I-120 device.
Условия выделения: колонка 90х2,5 см, элюент 0,02 М НСl буфер рН 6,8, скорость 0,6 мл/мин, температура 20оС, детектор UV 280 нм.Separation conditions: column 90h2,5 cm, eluent 0.02M HCl buffer pH 6.8, the rate of 0.6 ml / min, temperature 20 ° C, UV 280 nm detector.
Использование заявляемого сорбента позволяет достигнуть высокой эффективности в процессе разделения биополимеров. The use of the inventive sorbent allows to achieve high efficiency in the process of separation of biopolymers.
Claims (1)
где Q -(CHR2-)n, -CH2CH2OCHR2-, -CH2CH2OCH2CH2OCHR2-;
n 1 11;
R1 и R2 -H, -CH3,
и сшивающего мономера соединения, выбранного из группы, содержащей ди-, три-, тетра(мет)акрилаты пентаэритрита или их смеси с модификатором - активированным эпихлоргидрином многоатомным спиртом, выбранным из группы, содержащей пентиты, гекситы, поливиниловые спирты или декстраны, при соотношении модификатор сополимер 1,1 9,8 98,9 90,2 мас. при этом пористый продукт имеет предел эксклюзии 10000 10000000.HYDROPHILIC POLYMERIC SORBENT, which is a porous product of the interaction of an epoxy (meth) acrylate copolymer of the general formula
where Q is (CHR 2 -) n , -CH 2 CH 2 OCHR 2 -, -CH 2 CH 2 OCH 2 CH 2 OCHR 2 -;
n 1 11;
R 1 and R 2 —H, —CH 3 ,
and a crosslinking monomer of a compound selected from the group consisting of pentaerythritol di-, tri-, tetra (meth) acrylates, or a mixture thereof with a modifier — activated epichlorohydrin polyhydric alcohol selected from the group consisting of pentites, hexites, polyvinyl alcohols or dextrans, with a modifier ratio copolymer 1.1 9.8 98.9 90.2 wt. however, the porous product has an exclusion limit of 10,000 10,000,000.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU92009086/04A RU2057763C1 (en) | 1992-11-30 | 1992-11-30 | Hydrophile polymer sorbent |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU92009086/04A RU2057763C1 (en) | 1992-11-30 | 1992-11-30 | Hydrophile polymer sorbent |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2057763C1 true RU2057763C1 (en) | 1996-04-10 |
| RU92009086A RU92009086A (en) | 1996-04-27 |
Family
ID=20132824
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU92009086/04A RU2057763C1 (en) | 1992-11-30 | 1992-11-30 | Hydrophile polymer sorbent |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2057763C1 (en) |
-
1992
- 1992-11-30 RU RU92009086/04A patent/RU2057763C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Авторское свидетельство СССР N 1368773, кл. G 01N 30/06, опублик. 1988. * |
| Авторское свидетельство СССР N 1398902, кл. B 01J 20/26, опублик. 1988. * |
| Патент США N 4118347, кл. C 08J 9/16, опублик. 1978. * |
| Патент США N 4246362, кл. C 08J 9/00, опублик. 1981. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7132049B2 (en) | Negatively charged membrane | |
| US4747956A (en) | Method of adsorbing subtances | |
| US5476715A (en) | Particulate adsorbent for the removal of biomacromolecules such as LDL and endotoxins from whole blood in extracorporeal circuits | |
| EP0006199B1 (en) | Hydrophilic separating carrier and preparation thereof | |
| JPS5858026B2 (en) | Packing material for chromatography and its manufacturing method | |
| WO2000077081A1 (en) | Process for making fluorinated polymer adsorbent particles | |
| JP3583782B2 (en) | Gel permeation chromatography methods and supports | |
| RU2057763C1 (en) | Hydrophile polymer sorbent | |
| JPH04247236A (en) | Highly cross-linked pearl-like hydrophobic support material capable of being activated, method for modifying said support material and method for adsorbing biologically active substance from watery liouid or chromatograph- ing for removal of large amount of said substance | |
| RU2296137C2 (en) | Powdered hydrophobic polymer and column for high-performance reversed-phase liquid chromatography | |
| JPS6392627A (en) | Hydrophilic porous particle | |
| JP3263986B2 (en) | Adsorption carrier for chromatography | |
| JPS58165860A (en) | Carrier of adsorbing material for purifying body liquid | |
| JPH0142746B2 (en) | ||
| Chen et al. | Fluorometric study of the side-chain effect on protein adsorption character in cellulose-polymer composite ion exchangers | |
| JPS62151753A (en) | Carrier for chromatography | |
| JPS62153755A (en) | Adsorber carrier for chromatography | |
| JPH0141383B2 (en) | ||
| JPH0219902B2 (en) | ||
| JPH02251251A (en) | Hydrophilic anion exchange resin and preparation thereof | |
| JP6056230B2 (en) | Cation exchanger for liquid chromatography | |
| JPS63159756A (en) | Adsorbent carrier for chromatography | |
| JPS59145036A (en) | Hard hydrogel | |
| JPH0198964A (en) | Adsorptive carrier for chromatography | |
| JPH0198965A (en) | Adsorptive carrier for chromatography |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20051201 |