RU2052205C1

RU2052205C1 - Method for diagnosis of organism infection resistance

Info

Publication number: RU2052205C1
Authority: RU
Inventors: Светлана Анатольевна Гусева; Татьяна Григорьевна Волкова
Original assignee: Светлана Анатольевна Гусева; Татьяна Григорьевна Волкова
Priority date: 1992-07-28
Filing date: 1992-07-28
Publication date: 1996-01-10

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: method for diagnosis of organism infection resistance includes separation of blood lymphocytes, determination of lymphocytes proliferative ability in response to cultivation with mitogens, additional determination of lymphocyte ability to secrete lymphokine stimulating phagocytosis, calculation of total proliferative ability of lymphocytes, and if its value equals 1.4 or less, reduced infection resistance is diagnosticated. EFFECT: higher accuracy of diagnosis of organism infection resistance.

Description

Изобретение относится к медицине, в частности иммунологии, и может быть использовано в профильных учреждениях для диагностики инфекционной резистентности организма у больных. The invention relates to medicine, in particular immunology, and can be used in specialized institutions for the diagnosis of infectious resistance of the body in patients.

Известно, что защита от инфекции (инфекционная резистентность) складывается из функциональной активности нескольких систем организма: комплемента, фагоцитоза, гуморального и клеточного иммунитета. Большинство из опубликованных способов диагностики инфекционной резистентности основываются на измерении параметров сегментоядерных нейтрофилов, фагоцитарной реакции клеток. It is known that protection against infection (infectious resistance) consists of the functional activity of several body systems: complement, phagocytosis, humoral and cellular immunity. Most of the published methods for diagnosing infectious resistance are based on measuring the parameters of segmented neutrophils and the phagocytic reaction of cells.

Фагоцит, поглотивший микроорганизмы, содержащие собственную генетическую информацию, представляет собой частично чужеродную структуру антиген, против которого развивается Т-лимфоцитарный механизм иммунитета. Согласно современным данным, антиген модифицируется микрофагом и представляется антигенраспознающему Т-лимфоциту, в результате чего происходит активация и превращение Т-клеток из соответствующих предшественников в Т-хелперы, супрессоры и киллеры. Наиболее широко применяемым тестом, позволяющим количественно оценить взаимодействие между макрофагами (моноцитами) и Т-клетками в процессе пролиферации Т-лимфоцитов, в настоящее время является реакция бластной трансформации лимфоцитов, чаще всего проводимая с фитогемагглютинином и конканавалином А. A phagocyte that has absorbed microorganisms containing its own genetic information is a partially foreign structure of the antigen against which the T-lymphocytic immunity mechanism develops. According to current data, an antigen is modified by a microphage and appears to be an antigen-recognizing T-lymphocyte, as a result of which activation and transformation of T-cells from the corresponding precursors into T-helpers, suppressors and killers takes place. The most widely used test to quantify the interaction between macrophages (monocytes) and T cells during the proliferation of T lymphocytes, is currently the reaction of blast transformation of lymphocytes, most often carried out with phytohemagglutinin and concanavalin A.

Наиболее близким к заявляемому способу является определение пролиферативной способности лимфоцитов (реакция бластной трансформации лимфоцитов). В способе показано, что резкая ФГА-гипореактивность является четким признаком бактериальной инфекции. Closest to the claimed method is the determination of the proliferative ability of lymphocytes (reaction of blast transformation of lymphocytes). The method shows that a sharp PHA-hyporeactivity is a clear sign of a bacterial infection.

Недостатком способа-прототипа является установление гипореактивности лимфоцитов на фоне уже развившегося бактериального процесса. Кроме того, при использовании определения реакции бластной трансформации в ответ на митогены не учитывается активность лимфокинов, воздействующих на фагоцитарное звено. The disadvantage of the prototype method is the establishment of hyporeactivity of lymphocytes against the background of an already developed bacterial process. In addition, when using the definition of the blast transformation reaction in response to mitogens, the activity of lymphokines acting on the phagocytic link is not taken into account.

Цель изобретения повышение точности диагностики инфекционной резистентности за счет учета общей пролиферативной способности и способности лимфоцитов секретировать фактор, воздействующий на фагоцитарное звено. The purpose of the invention is to improve the accuracy of diagnosis of infectious resistance by taking into account the general proliferative ability and the ability of lymphocytes to secrete a factor affecting the phagocytic link.

Поставленная цель достигается тем, что выделяют лимфоциты крови, определяют их пролиферативную способность в ответ на культивирование с митогенами, дополнительно определяют способность лимфоцитов секретировать лимфокин, стимулирующий фагоцитоз, рассчитывают суммарную пролиферативную способность лимфоцитов и при величине ее 1,4 и ниже диагностируют снижение инфекционной резистентности. This goal is achieved by isolating blood lymphocytes, determining their proliferative ability in response to cultivation with mitogens, additionally determining the ability of lymphocytes to secrete lymphokine stimulating phagocytosis, calculate the total proliferative ability of lymphocytes and diagnose a decrease in infectious resistance if it is 1.4 or lower.

Способ осуществляют следующим образом. The method is as follows.

При поступлении больного в клинику проводят забор венозной гепаринизированной крови. Далее проводили выделение лимфоцитов в градиенте плотности фиколл-урографина (d 1,076), дважды отмывали в забуференном физиологическом растворе (рН 7,4), разводили средой РРМ1-1640 до концентрации 3 · 10⁶ клеток/мл. В качестве стимулятора использовали конканавалин А (КонА) в концентрации 5 мкг/мл. Контролем служили нестимулированные лимфоциты крови. Культивирование проводили с раствором митогена (КонА) в течение 72 ч. Супернатанты культур получали центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин.Upon admission to the clinic, venous heparinized blood is sampled. Then, lymphocytes were isolated in a density gradient of ficoll-urographin (d 1.076), washed twice in buffered saline (pH 7.4), and diluted with PPM1-1640 medium to a concentration of 3 × 10 ⁶ cells / ml. Concanavalin A (ConA) at a concentration of 5 μg / ml was used as a stimulant. Unstimulated blood lymphocytes served as a control. The cultivation was carried out with a solution of mitogen (ConA) for 72 hours. Culture supernatants were obtained by centrifugation at 6000 rpm for 20 minutes.

I. После получения супернатанта осадок лимфоцитов осторожно ресуспендировали, из взвеси клеток готовили мазки, высушивали, затем окрашивали их и подсчитывали число бласттрансформированных на 100 клеток лимфоцитов. Результат выражали в условных единицах. Например, после культивировании лимфоцитов с раствором митогена в мазках крови обнаружили 40 трансформированных лимфоцитов на 100 подсчитанных клеток. Следовательно, пролиферативная способность лимфоцитов в данном случае составляла 40:100 0,4. I. After receiving the supernatant, the lymphocyte pellet was carefully resuspended, smears were prepared from the suspension of cells, dried, then stained, and the number of blast transformed per 100 lymphocyte cells was counted. The result was expressed in arbitrary units. For example, after culturing lymphocytes with a mitogen solution in blood smears, 40 transformed lymphocytes per 100 counted cells were found. Therefore, the proliferative ability of lymphocytes in this case was 40: 100 0.4.

II. Активность секретируемых лимфокинов в супернатантах культур тестировали по степени стимуляции НСТ-теста в лейкоконцентратах гепаринизированной крови здоровых лиц. На предметном стекле смешивали по 20 мкл лейкоконцентрата, 0,2%-ный раствор нитросинего тетразолия (НСТ) и тестируемого цельного супернатанта. Стекла инкубировали во влажной камере 60 мин при 37^оС, из капли делали на этом же предметном стекле мазок, который после просушивания и фиксации метанолом докрашивали 0,2% -ным водным раствором нейтрального красного. При микроскопировании учитывали процент стимулированных нейтрофилов, содержащих в цитоплазме гранулы диформазана. Величину стимулирующего эффекта (индекс стимуляции (ИС)) рассчитывали по формуле
ИС

где А показатель со стимулированными пробами;
В с контрольными супернатантами.II. The activity of secreted lymphokines in culture supernatants was tested by the degree of stimulation of the HCT test in heparinized blood leukoconcentrates of healthy individuals. On a glass slide, 20 μl of leukoconcentrate, 0.2% solution of nitro-blue tetrazolium (HCT) and the tested whole supernatant were mixed. Slides were incubated in a humid chamber for 60 min at 37 ^{° C,} made from the drop in the same smear slide which, after drying and fixing with methanol dokrashivali 0.2% aqueous solution of neutral red. Microscopy took into account the percentage of stimulated neutrophils containing diformazan granules in the cytoplasm. The magnitude of the stimulating effect (stimulation index (IP)) was calculated by the formula
IP

where A is an indicator with stimulated samples;
In with control supernatants.

Например, процент нейтрофилов в контроле, содержащих гранулы диформазана, в контрольных мазках составлял 15% после стимуляции опытными супернатантами 40% Следовательно, индекс стимуляции в данном случае составлял

1,66
Суммарная пролиферативная активность составила 0,4+1,66 2,06 колебалась от 2,78 до 3,15.For example, the percentage of neutrophils in the control containing diformazan granules in control smears was 15% after stimulation with experimental supernatants 40% Therefore, the stimulation index in this case was

1.66
The total proliferative activity was 0.4 + 1.66 2.06 ranged from 2.78 to 3.15.

Примерами конкретного осуществления способа могут служить выписки из историй болезни. Examples of a specific implementation of the method are extracts from medical records.

П р и м е р 1. Больная О-к поступила в гематологическое отделение по поводу хронического миелолейкоза в стадии выраженных клинических проявлений с типичными для этого заболевания клинико-гематологическими проявлениями. При поступлении проведено исследование функционального состояния лимфоцитов:
Пролиферативная способность лимфоцитов составила 0,27
Способность лимфоцитов
секретировать лимфокины, стимулирующие фагоцитоз 1,11
Суммарная пролиферативная активность лимфоцитов 1,38.PRI me R 1. Patient OK entered the hematology department for chronic myelogenous leukemia in the stage of pronounced clinical manifestations with clinical and hematological manifestations typical for this disease. Upon admission, a study of the functional state of lymphocytes was carried out:
The proliferative ability of lymphocytes was 0.27
Lymphocyte ability
secrete lymphokines stimulating phagocytosis 1.11
The total proliferative activity of lymphocytes is 1.38.

Таким образом, у данной больной можно сделать заключение о снижении инфекционной резистентности организма. Через неделю после лечения у больной на фоне снижения инфекционной резистентности развилась бронхопневмония. Следовательно, клиническое течение подтвердило данные, полученные при использовании функционального состояния лимфоцитов. Thus, in this patient we can conclude that the infectious resistance of the body is reduced. A week after treatment, the patient developed bronchopneumonia against the background of a decrease in infectious resistance. Therefore, the clinical course confirmed the data obtained using the functional state of the lymphocytes.

П р и м е р 2. Больной Х-ко поступил в гематологическое отделение с типичными клинико-гематологическими проявлениями хронического миелолейкоза в стадии развернутых клинических проявлений. При исследовании функциональной активности лимфоцитов получены следующие данные:
Пролиферативная активность лимфоцитов 0,38
Способность лимфоцитов
секретировать лимфокин, стимулирующий фагоцитоз 1,5
Суммарная пролиферативная активность лимфоцитов 1,88
Таким образом, можно сделать заключение, что у данного больного инфекционная резистентность организма сохранена. Клиническое течение заболевания подтвердило полученные экспериментальные данные: признаков инфекционно-воспалительных процессов не наблюдалось.PRI me R 2. Patient X-ko entered the hematology department with typical clinical and hematological manifestations of chronic myelogenous leukemia in the stage of detailed clinical manifestations. In the study of the functional activity of lymphocytes, the following data were obtained:
Lymphocyte proliferative activity 0.38
Lymphocyte ability
secrete lymphokine stimulating phagocytosis 1.5
Total proliferative activity of lymphocytes 1.88
Thus, we can conclude that in this patient the infectious resistance of the body is preserved. The clinical course of the disease confirmed the obtained experimental data: signs of infectious and inflammatory processes were not observed.

Апробация способа проведена на 74 больных хроническим миелолейкозом (как модель нарушения инфекционной резистентности организма вследствие лейкозного процесса) и 30 практически здоровых лицах (доноры). The method was tested on 74 patients with chronic myeloid leukemia (as a model of impaired infectious resistance of the body due to the leukemia process) and 30 practically healthy individuals (donors).

Проведен сравнительный анализ точности диагностики инфекционной резистентности с использованием способа-прототипа и заявляемого способа. Так, при применении способа-прототипа ошибка в прогнозировании возникновения инфекционных процессов (т.е. в диагностики состояния инфекционной резистентности) наблюдалась у 22 (29,72%) больных, тогда как при использовании заявляемого способа ошибка наблюдалась у 10 (13,5%). Таким образом, точность заявляемого способа диагностики инфекционной резистентности организма была повышена в 2,2 раза. A comparative analysis of the accuracy of diagnosis of infectious resistance using the prototype method and the proposed method. So, when applying the prototype method, an error in predicting the occurrence of infectious processes (i.e., in diagnosing the state of infectious resistance) was observed in 22 (29.72%) patients, while when using the proposed method, an error was observed in 10 (13.5% ) Thus, the accuracy of the proposed method for the diagnosis of infectious resistance of the body was increased by 2.2 times.

Claims

METHOD FOR DIAGNOSTIC OF INFECTIOUS RESISTANCE OF THE ORGANISM by isolating blood lymphocytes, determining their proliferative ability, characterized in that they additionally determine the ability of lymphocytes to secrete lymphokine stimulating phagocytosis, calculate the total polyperative ability of lymphocytes and diagnose a decrease in their infectious resistance at a value of 1.4 or less.