RU2052187C1 - Способ определения цитотоксической активности клеток - Google Patents
Способ определения цитотоксической активности клеток Download PDFInfo
- Publication number
- RU2052187C1 RU2052187C1 SU5005183A RU2052187C1 RU 2052187 C1 RU2052187 C1 RU 2052187C1 SU 5005183 A SU5005183 A SU 5005183A RU 2052187 C1 RU2052187 C1 RU 2052187C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- lymphocytes
- antigen
- cytotoxic activity
- sample
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Использование: в медицине, а именно в иммунологии, и может применяться в различных областях клинической и экспериментальной иммунологии для выявления повышенной чувствительности к инфекционным и неинфекционным антигенам. Сущность: из крови больного выделяют лимфоциты и нейтрофилы, а киллерную активность лимфоцитов предварительно стимулируют путем обработки клеток - эффекторов антигеном в течение одного часа при 37oС с последующим отмыванием от него, после чего в опытной пробе взвесь гранулоцитов смешивают с обработанными антигеном лимфоцитами в соотношении 1 : 10, в к контрольной пробе - с необработанными антигеном лимфоцитами, инкубируют пробы 18 ч при 37oС в термостате. Регистрацию разрушения клеток - мишений определяют по выходу калия в кондиционную среду с помощью пламенного фотометра. Результаты реакции расчитывают по формуле: цитотоксическая активность клеток
где Ко - содержание калия в опытной пробе (показание шкалы прибора), Кк - содержание калия в контрольной пробе. Способ прост в исполнении при сохранении точности определения цитотоксической активности клеток. 2 табл.
где Ко - содержание калия в опытной пробе (показание шкалы прибора), Кк - содержание калия в контрольной пробе. Способ прост в исполнении при сохранении точности определения цитотоксической активности клеток. 2 табл.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано в различных областях клинической и экспериментальной иммунологии для выявления повышенной чувствительности к инфекционным и неинфекционным аллергенам.
Цель изобретения упрощение способа.
Известен способ определения цитотоксического действия лимфоцитов путем инкубации лимфоцитов с клетками-мишенями, нагруженными антигеном. В качестве клеток-мишеней используют эритроциты барана либо аутогранулоциты крови (Лабораторное дело. 1980, N 9, с. 543-547).
Регистрация разрушения клеток осуществляется по выходу калия из клеток-мишеней. Этот способ выбран нами за прототип.
Однако способ-прототип достаточно трудоемок, так как требует получения взвеси эритроцитов барана, подготовки (сенсибилизации) клеток-мишеней путем двухчасовой инкубации их с антигеном с последующим отмыванием клеток, подсчетом и доведением до нужной концентрации. Кроме того с помощью способа-прототипа выявляется активность лишь части киллерных клеток, а именно тех киллеров, которые действуют на нагруженные антигеном клетки-мишени, в то время, как в крови имеются и другие популяции киллерных клеток (например, естественные киллеры), активирующиеся при реакциях замедленной гиперчувствительности.
Цель изобретения упрощение способа. Эта цель достигается тем, что производится инкубация лимфоцитов (клеток-эффекторов) в течение 60 мин с антигеном, после чего лимфоциты смешивают с собственными гранулоцитами больного, инкубируют 18 ч и определяют степень лизиса клеток-мишеней по выходу каля из поврежденных клеток.
В предлагаемом способе в отличие от прототипа антигеном обрабатывают не клетки-мишени, а клетки-эффекторы (лимфоциты). В результате отпадает этап сенсибилизации клеток-мишеней. Положитель- ным моментом является и то, что мы используем меньшую концентрацию клеток-эффекторов, а следовательно, уменьшается необходимое количество крови для исследования: 2-3 мл в заявляемом способе против 5-7 мл в прототипе. Инкубация клеток-эффекторов с антигеном приводит к активации различных популяций киллерных клеток, усиленному синтезу лимфоцитов и это позволяет относительно просто и с высокой точностью определять цитотоксическую активность мононуклеарных клеток. Кроме того, исключается влияние ксеногенного антигена клеток-мишеней на результаты реакции.
Эти существенные отличия заявляемого способа от способа-прототипа позволяют сделать вывод, что заявляемый способ соответствует критерию "новизна". В просмотренной нами литературе мы не встретили технических решений, в которых бы использовали предварительную антигенную стимуляцию киллерной активности клеток-эффекторов перед инкубацией их с клетками-мишенями, следовательно, можно сделать вывод о соответствии заявляемого способа критерию "существенные отличия".
Способ испытан при диагностике острой дизентерии и при выявлении аутоаллергии у больных острыми вирусными и хроническими гепатитами. В табл.1 и 2 приведены данные наших исследований.
Представленные данные свидетельствуют о том, что с помощью предлагаемого метода четко регистрируется наличие повышенной чувствительности к микробному (дизентерийному) антигену и наличие аутоаллергии при острых и хронических гепатитах.
Нами было проведено сопоставление чувствительности предлагаемого метода и метода-прототипа.
Приведенные результаты свидетельствуют о том, что чувствительность данного способа не ниже, а даже несколько выше, чем у прототипа.
Способ осуществляют следующим образом. К 2 мл гепаринизированной крови прибавляли 0,3 мл полиглюкина или 6%-ного раствора декстрана для быстрого осаждения эритроцитов, кровь отстаивается в термостате 30 мин. Плазму, обогащенную лейкоцитами, помещали на фиколл-верографиновый градиент и выделяли лимфоциты путем центрифугирования. Затирали лимфоцитарное кольцо и клетки дважды отмывали средой 199 с антибиотиками (пенициллин и стрептомицин по 100 Ед/мл). Параллельно получали гранулоциты из осадка, лизируя эритроциты дистиллированной водой 25-30 сек, после чего восстанавливают изотоничность, добавляя 8,9% -ный раствор хлористого натрия. Клетки дважды отмывают средой 199 с антибиотиками. Производят подсчет клеток и доводят концентрацию лимфоцитов до 106/мл и гранулоцитов до 105/мл. Проводят обработку лимфоцитов антигеном путем 60-минутной инкубации 0,5 мл взвеси клеток с 50 мкл антигена в заранее оттитрованной концентрации. В предварительных экспериментах было показано, что инкубация в течение 1 ч и 2 ч дает аналогичные результаты, а обработка клеток эффекторов 30 мин недостаточна, так как данное время инкубации не дает возможности проявления максимального цитотоксического эффекта. В контрольной пробе лимфоциты инкубируют со средой 199. Затем все клетки отмывают дважды средой 199 с антибиотиками и 10%-ной инактивированной сывороткой крупного рогатого скота и восстанавливают до прежней концентрации.
В опытной пробе 0,1 мл взвеси аутогранулоцитов смешивают с равным объемом обработанных антигеном лимфоцитов. В контрольной пробе нейротрофилы смешивают с лимфоцитами, не обработанными антигеном. Все пробы проводят в трех повторах. Пробирки инкубируют в термостате 18 ч при 37оС. Затем во все пробирки добавляют 0,8 мл изотонического раствора хлористого натрия и центрифугируют 10 мин при 400 g. Надосадочную жидкость отсасывают и определяют в ней содержание калия с помощью атомно-абсорбционного фотометра в соответствии с инструкцией к прибору. Результаты реакции рассчитывают по формуле:
• 100% где Ко содержание калия в опытной пробе, Кк содержание калия в контрольной пробе.
• 100% где Ко содержание калия в опытной пробе, Кк содержание калия в контрольной пробе.
П р и м е р 1. Больной Ч. 40 лет. Диагноз: Хронический активный гепатит, фаза стихающего обострения.
В пробирку с гепарином получили 2 мл венозной крови, добавили 0,5 мл полиглюкина (1: 4), кровь поместили в термостат при 37оС. Плазму с лейкоцитами отобрали и наслоили на 2 мл фиколл-верографина плотностью 1,077, процентрифугировали 30 мин при 400 g. Отобрали лимфоцитарное кольцо. Надосадок удалили и путем гемолиза получили гранулоциты: для этого к осадку прибавляли 0,9 мл дистиллированной воды, ресуспендировали 30 сек, затем для восстановления изотоничности добавляли 0,1 мл 8,9%-ный раствор хлористого натрия. Все клетки отмывали дважды средой 199 с антибиотиками. Затем провели подсчет клеток и довели концентрацию лимфоцитов до 1·106 клеток/мл и гранулоцитов до 1·105/мл. Обработку антигеном лимфоцитов больного проводили и в трех режимах: 2 ч, 1 ч, 30 мин в термостате при 37оС. Для этого пробирки маркировали и в каждую пробирку к 0,5 мл взвеси лимфоцитов прибавляли 50 мкл антигена (препарат липопротеида печени человека Рижского медицинского института). В контрольных пробах лимфоциты инкубировали со средой 199 также в трех режимах. Затем все клетки отмывали дважды средой 199 с антибиотиками и 10%-ной сывороткой крупного рогатого скота. В опытной пробе 0,1 мл взвеси гранулоцитов смешивали с равным объемом обработанных антигеном лимфоцитов. В контрольной пробе гранулоциты смешивают с лимфоцитами, не обработанными антигеном. Пробы проводили в двух повторах. Все пробирки инкубировали в термостате 18 ч при 37оС. Затем во все пробы добавляли 0,8 мл физиологического раствора и центрифугировали 10 мин при 400 g. Надосадочную жидкость забирали и определяли в ней содержание калия с помощью пламенного фотометра. Результаты определения: I режим 2 ч предварительной обработки лимфоцитов перед инкубацией с клетками-мишенями, опытные пробы Ко1 26, 27, среднее значение 26,5 контрольные пробы Кк1 23, 24, среднее значение 23,5. Цитотоксическая активность клеток •100% 12,77% II режим 60-минутная обработка лимфоцитов, опытные пробы Ко2 25, 27, среднее значение 26, контрольные пробы Кк2 22, 24, среднее значение 23. Цитотоксическая активность клеток •100% 13,04% III режим 30-минутная обработка лимфоцитов, опытные пробы Ко3 24, 25, среднее значение 24,5, контрольные пробы Кк3 22, 24, среднее 23, цитотоксическая активность клеток •100% 6,52%
От того же больного получили 5 мл венозной крови в другую пробирку с гепарином. Аналогичным способом были получены и отмыты лимфоциты, получили взвесь клеток в среде 199 с антибиотиками в концентрации 4·106клеток/мл. Консервированные эритроциты барана трижды отмыли физиологическим раствором хлористого натрия и к 1 мл 5% взвеси клеток добавили 50 мкл печеночного антигена. Параллельно приготовили эритроциты барана без антигена и обе пробирки инкубировали 2 ч при 37оС. Затем эритроциты барана отмыли и довели до концентрации 2 ·105 клеток/мл средой 199 с антибиотиками и 10%-ной инактивированной сывороткой крупного рогатого скота, 0,1 мл взвеси лимфоцитов смешали с 0,1 мл сенсибилизированных эритроцитов барана (две пробы опытных пробирок) и 0,1 мл несенсибилизированных эритроцитов барана (контрольные пробирки). Пробирки выдерживали 18 ч в термостате при 37оС, после чего во все пробы добавляли по 0,8 мл физиологического раствора хлористого натрия и определяли калий аналогичным способом в надосадочной жидкости.
От того же больного получили 5 мл венозной крови в другую пробирку с гепарином. Аналогичным способом были получены и отмыты лимфоциты, получили взвесь клеток в среде 199 с антибиотиками в концентрации 4·106клеток/мл. Консервированные эритроциты барана трижды отмыли физиологическим раствором хлористого натрия и к 1 мл 5% взвеси клеток добавили 50 мкл печеночного антигена. Параллельно приготовили эритроциты барана без антигена и обе пробирки инкубировали 2 ч при 37оС. Затем эритроциты барана отмыли и довели до концентрации 2 ·105 клеток/мл средой 199 с антибиотиками и 10%-ной инактивированной сывороткой крупного рогатого скота, 0,1 мл взвеси лимфоцитов смешали с 0,1 мл сенсибилизированных эритроцитов барана (две пробы опытных пробирок) и 0,1 мл несенсибилизированных эритроцитов барана (контрольные пробирки). Пробирки выдерживали 18 ч в термостате при 37оС, после чего во все пробы добавляли по 0,8 мл физиологического раствора хлористого натрия и определяли калий аналогичным способом в надосадочной жидкости.
Результаты определения: контрольные пробы 24, 26, среднее значение 25, опытные пробы 26, 28. Цитотоксическая активность клеток •100% 8%
Таким образом показано, что предлагаемый способ определения цитотоксической активности клеток более прост в исполнении, имеет меньшие временные затраты, достоверен, не требует сложного оборудования, обладает хорошей воспроизводимостью в условиях стандартной клинико-иммунологической лаборатории, может быть использован для решения различных диагностических вопросов в практической медицине.
Таким образом показано, что предлагаемый способ определения цитотоксической активности клеток более прост в исполнении, имеет меньшие временные затраты, достоверен, не требует сложного оборудования, обладает хорошей воспроизводимостью в условиях стандартной клинико-иммунологической лаборатории, может быть использован для решения различных диагностических вопросов в практической медицине.
Claims (1)
- СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК путем инкубации лимфоцитов с клетками-мишенями по выходу калия из разрушенных клеток, отличающийся тем, что инкубируют 0,5 • 106 клеток-эффекторов в течение 60 мин при 37oС в опытной пробе с печеночным или Шигелл-Флекснера антигеном, взятым в оттированной концентрации в объеме 550 мкл и в контрольной пробе с равным количеством среды 199, а ннкубацию лимфоцитов, полученных в опытной и контрольной пробах с клетками-мишенями, взятыми в соотношении 0,1 • 106 лимфоцитов и 0,1 • 105 клеток-мишеней, проводят в течение 18 ч при 30oС, после чего определяют цитотоксическую активность (ЦА) по формуле
где Kо - содержание калия в опытной пробе;
Kк - содержание калия в контрольной пробе.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU5005183 RU2052187C1 (ru) | 1991-08-08 | 1991-08-08 | Способ определения цитотоксической активности клеток |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU5005183 RU2052187C1 (ru) | 1991-08-08 | 1991-08-08 | Способ определения цитотоксической активности клеток |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2052187C1 true RU2052187C1 (ru) | 1996-01-10 |
Family
ID=21586758
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU5005183 RU2052187C1 (ru) | 1991-08-08 | 1991-08-08 | Способ определения цитотоксической активности клеток |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2052187C1 (ru) |
-
1991
- 1991-08-08 RU SU5005183 patent/RU2052187C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
В.Л.Морозов и др. Модель цитотоксического эффекта для выявления гиперчувствительности замедленного типа "ин витро". Лабораторное дело. 1980, N 9, с.543-547. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Miescher et al. | New serological methods for the detection of the LE factor | |
Barker et al. | Transmission of serum hepatitis | |
Ceska et al. | Radioimmunosorbent assay of allergens | |
Truedsson et al. | Screening for deficiencies in the classical and alternative pathways of complement by hemolysis in gel | |
Sutnick et al. | Australia antigen (a hepatitis-associated antigen) in leukemia | |
Rosenfield et al. | Nonuniform distribution of occult blood in feces | |
Fritz et al. | Hepatitis-associated antigen: detection by antibody-sensitized latex particles | |
Kabakĉi et al. | The lysis of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria red cells by serum and cobra factor | |
US3900558A (en) | Method of measuring histamine release from mast cells | |
RU2052187C1 (ru) | Способ определения цитотоксической активности клеток | |
Steward et al. | Circulating antigen-antibody complexes in onchocerciasis. | |
Vierucci et al. | Australia antigen and antibody in transfused children with thalassaemia | |
Dulaney et al. | The complement content of human sera with especial reference to malaria | |
Weinstein | Hypocomplementemia in hydralazine-associated systemic lupus erythematosus | |
Krupp | Modification of the indirect haemagglutination test for amoebiasis | |
Moses et al. | Laboratory criteria for a diagnosis of systemic lupus erythematosus | |
US4474876A (en) | Flow cytometric analysis of histamine receptors | |
CA2433768A1 (en) | Method for detecting in/vitro food antigen intolerance | |
Wolf et al. | Autoimmune hemolytic anemia with predominance of IgA autoantibody | |
Hansson et al. | A simple routine method for detecting hidden rheumatoid factors | |
Driessen et al. | Haemadsorption in vaccinia-infected tube tissue cultures | |
JPS6022295B2 (ja) | 赤血球凝集試験用水性溶媒 | |
Kline | Plasminogen and proactivator concentration in human plasma. | |
McLeod et al. | 'Hypocryoglobulins': Enhanced Cryoprecipitation From Hypotonic Serum in Patients With Vasculitis | |
JPH07502123A (ja) | 抗原及び核酸の検出 |