RU2041462C1

RU2041462C1 - Fraction separation system for determining the contents of a substance in a sample

Info

Publication number: RU2041462C1
Application number: RU94003623A
Authority: RU
Inventors: Наталья Сергеевна Герасимова
Original assignee: Наталья Сергеевна Герасимова
Priority date: 1994-02-02
Filing date: 1994-02-02
Publication date: 1995-08-09

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: system has multi-hole base, lining with capillary pores and a cover located in centrifuge. EFFECT: enhanced effectiveness in separating substances in small quantities; lower reagents usage. 1 dwg

Description

Изобретение относится к медицине и предназначено для проведения разнообразных исследований, преимущественно в неонаталогии или в иммунологии. The invention relates to medicine and is intended for a variety of studies, mainly in neonatology or in immunology.

Известен способ проведения количественного определения концентрации фенилаланина в пробирках, например метод MoCaman. A known method for the quantitative determination of the concentration of phenylalanine in test tubes, for example, the MoCaman method.

Более совершенным способом, впервые использованным в практике неонатальных исследований, является способ, сущность которого состоит в определении концентрации фенилаланина в водных элюатах из сухих пятен крови, в условиях проведения реакции в многолуночном микропланшете и последующем измерении флюоресцентных сигналов на флюориметре в течение одной минуты. A more advanced method, first used in the practice of neonatal studies, is a method the essence of which is to determine the concentration of phenylalanine in aqueous eluates from dry blood stains, under the conditions of a reaction in a multi-well microplate and subsequent measurement of fluorescence signals on a fluorimeter for one minute.

Известно также применение центрифугирования микропланшетов (например с помощью центрифуги GS-15 ротор S-20-96, Beckman USA), однако в этих случаях происходит обыкновенное осаждение раствора внутри каждой лунки, не разделяя фракции в разные емкости. The use of centrifugation of microplates is also known (for example, using a GS-15 centrifuge, S-20-96 rotor, Beckman USA), however, in these cases, the solution is usually precipitated inside each well without separating the fractions into different containers.

Известно также устройство для фильтрования растворов из одного микропланшета с фильтром вместо дна в другой, находящийся под ним, с применением вакуумного устройства, но в этом случае фракционирование ведется не полностью и просачивающаяся жидкость размазывается по всем стенкам, что не позволяет проводить реакцию на дне лунки. Это устройство позволяет собрать материал на фильтр-дно для последующего его вырезания и исследования (MultiSoreen Assay System, Millipore). Кроме того, велик коэффициент вариации проходящего через фильтр количества раствора, так как в задачу этого устройства не входит полноценный сбор отфильтрованной жидкости. A device is also known for filtering solutions from one microplate with a filter instead of the bottom to another, located below it, using a vacuum device, but in this case fractionation is not carried out completely and the leaking liquid is smeared along all walls, which does not allow the reaction to be carried out at the bottom of the well. This device allows you to collect material on the filter bottom for subsequent cutting and research (MultiSoreen Assay System, Millipore). In addition, the coefficient of variation of the amount of solution passing through the filter is large, since the task of this device is not to fully collect the filtered liquid.

В количестве прототипа выбрано устройство (96 Well Filter Strip Spacer Catalоg No 8585 фирмы Costar nuclepore), включающее 96-луночную прокладку c отверстиями, расположенную между микропланшетами, где дно верхнего выполнено в виде фильтров, располагаемых в центрифуге, что позволяет фильтрат из верхнего микропланшета собирать в лунки нижнего. A device (96 Well Filter Strip Spacer Catalogue No. 8585 from Costar nuclepore) was selected in the amount of the prototype, including a 96-hole gasket with holes located between the microplates, where the bottom of the top is made in the form of filters placed in a centrifuge, which allows the filtrate to be collected from the top microplate to the bottom holes.

Однако все эти способы обладают существенными недостатками: при исследовании определения в нем содержания вещества от кровяного диска, из которого проводилась элюация, происходит либо переносом элюата в другой микропланшет, что вносит дополнительные ошибки дозирования, либо изъятие кровяных дисков после элюации вручную из каждой лунки микропланшета, при этом часть элюата теряется вместе с отбрасываемым диском. При этом возникает необходимость проводить элюацию в большом количестве раствора, что существенно разбавляет исследуемую пробу и снижает качество исследования. Прокладки фирмы Castar nuclepore имеют некапиллярные отверстия и малое углубление, что не позволяет препятствовать произвольному вытеканию жидкости из верхнего микропланшета в лунки нижнего до прохождения необходимой реакции. However, all these methods have significant drawbacks: when studying the determination of the substance content from the blood disk from which the elution was carried out, it occurs either by transferring the eluate to another microplate, which introduces additional dosing errors, or the removal of blood disks after elution manually from each well of the microplate, however, part of the eluate is lost along with the disc being discarded. In this case, there is a need to elute in a large amount of solution, which significantly dilutes the test sample and reduces the quality of the study. Castar corepore gaskets have non-capillary openings and a small recess, which does not prevent the arbitrary flow of liquid from the upper microplate into the lower wells until the necessary reaction has passed.

Суть предлагаемого устройства состоит в том, что диски выполняют диаметром 3-4 мм в емкости прокладки, каждая из которых имеет капиллярное отверстие, помещают прокладку на многолуночное основание так, чтобы каждая емкость располагалась над соответствующей лункой основания, проводят элюацию в емкостях прокладки, после чего многолуночное основание, крышку и прокладку между ними размещают в центрифуге, где под действием центробежной силы элюат через капиллярные отверстия в емкостях прокладки перемещается в соответствующие лунки микропланшета и используется для исследования. The essence of the proposed device is that the disks are made with a diameter of 3-4 mm in the gasket containers, each of which has a capillary hole, place the gasket on a multi-hole base so that each container is located above the corresponding hole of the base, elute in the gasket containers, and then the multi-well base, the lid and the gasket between them are placed in a centrifuge, where, under the action of centrifugal force, the eluate through the capillary holes in the gasket containers moves to the corresponding microwell wells Sheth and used for research.

Целью изобретения является преодоление невозможности проведения реакции в описанных выше устройствах и полноценного отделения фракции, содержащей максимальное количество концентрированного элюата для исследования, от кровяных дисков, не подлежащих исследованию. The aim of the invention is to overcome the impossibility of carrying out the reaction in the above devices and the full separation of the fraction containing the maximum amount of concentrated eluate for research, from blood disks that are not subject to research.

На чертеже представлена схема системы для разделения фракций при определении содержания вещества в пробе. The drawing shows a diagram of a system for separating fractions when determining the content of a substance in a sample.

Система состоит из многолуночного основания 1, прокладки 2 и крышки 3. The system consists of a multi-hole base 1, gasket 2 and cover 3.

Устройство используется следующим образом. Кровяные диски диаметром 3 мм помещают в предварительно смоченные обводненные этанолом емкости прокладки 2, помещенные на белое многолуночное основание 1, после чего в эти же емкости доливают по 35 мл 80%-ного этанола, закрывают плотной крышкой 3 и помещают на ночь при 4-8^оС, затем добавляют в каждую емкость прокладки 2 по 30 мкл 80% -ного этанола; помещают под крышкой 3 на встряхиватель на 5 мин для элюации, затем центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин, после чего прокладку 2 с дисками отбрасывают, а в лунки многолуночного основания 1 с отделенным элюатом добавляют инкубационную смесь, состоящую из 0,6М натрий сукцинатного буфера рН 5,9, водного раствора нингидрина (10 мг/мл) и водного раствора L-лейцил-L-аланина (2,5 мг/мл) в пропорции 5:2:1. После 1-минутного встряхивания многолуночное основание 1 с крышкой 3 помещают в термостат на 80 мин для инкубации при 60^оС. По окончании инкубации многолуночное основание 1 без крышки 3 охлаждают при температуре -12-18^оС в течение 5 мин, затем останавливают реакцию медным реактивом и встряхивают при комнатной температуре 10-15 мин, после чего проводят измерение уровня флюоресценции во флюориметре и расчет концентраций фенилаланина исследуемых проб по отношению к калибраторам.The device is used as follows. Blood disks with a diameter of 3 mm are placed in pre-moistened containers filled with ethanol pad 2 placed on a white multi-well base 1, after which 35 ml of 80% ethanol are added to these containers, closed with a tight lid 3 and placed overnight at 4-8 ^about C, then 30 µl of 80% ethanol are added to each pad gasket 2; placed under cover 3 on a shaker for 5 minutes to elute, then centrifuged for 5 minutes at 3000 rpm, after which the pad 2 with discs is discarded, and the incubation mixture consisting of 0.6 M sodium succinate is added to the wells of multi-well base 1 with separated eluate buffer pH 5.9, an aqueous solution of ninhydrin (10 mg / ml) and an aqueous solution of L-leucyl-L-alanine (2.5 mg / ml) in a ratio of 5: 2: 1. After a 1 minute shaking multiwell base 1 with the lid 3 is placed in a thermostat at 80 min incubation at 60 ^C. After incubation multiwell base 1 without the cover 3 is cooled at a temperature of -12-18 ^{° C} for 5 min, then quenched shake with a copper reagent and shake at room temperature for 10-15 minutes, after which they measure the level of fluorescence in the fluorimeter and calculate the concentrations of phenylalanine in the test samples in relation to the calibrators.

Полученные результаты имеют коэффициент корреляции 0,98 по отношению к результатам измерения альтернативными методами (измерения концентрации фенилаланина в сыворотке тех же пациентов, проводимые под контролем контрольного материала фенилаланина производства фирмы Sigma США). The results obtained have a correlation coefficient of 0.98 with respect to the results of measurements by alternative methods (measuring the concentration of phenylalanine in the serum of the same patients, carried out under the control of control material phenylalanine manufactured by Sigma USA).

Claims

SYSTEM FOR SEPARATION OF FRACTIONS WHEN DETERMINING THE SUBSTANCE OF MATTER IN THE SAMPLE, comprising a lid, a multi-well base, a gasket with holes located above the corresponding wells of the base, the lid, multi-well base and the gasket between them are placed in a centrifuge, characterized in that the containers are made in the gasket with capillary holes.