RU2038600C1 - Мембрана для разделения компонентов иммунологической реакции - Google Patents
Мембрана для разделения компонентов иммунологической реакции Download PDFInfo
- Publication number
- RU2038600C1 RU2038600C1 SU5033495A RU2038600C1 RU 2038600 C1 RU2038600 C1 RU 2038600C1 SU 5033495 A SU5033495 A SU 5033495A RU 2038600 C1 RU2038600 C1 RU 2038600C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- membrane
- enzyme
- antigen
- solution
- antibodies
- Prior art date
Links
- 239000012528 membrane Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 title 1
- 230000036647 reaction Effects 0.000 title 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims abstract description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims abstract 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims abstract 3
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 claims description 3
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 abstract description 3
- KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 4-ethenylpyridine Chemical compound C=CC1=CC=NC=C1 KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 229920002845 Poly(methacrylic acid) Polymers 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 4
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-O 4-ethenylpyridine;hydron Chemical compound C=CC1=CC=[NH+]C=C1 KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 2
- 150000001868 cobalt Chemical class 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 208000004554 Leishmaniasis Diseases 0.000 description 1
- JCXJVPUVTGWSNB-UHFFFAOYSA-N Nitrogen dioxide Chemical class O=[N]=O JCXJVPUVTGWSNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N toluene Substances CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Использование: биотехнология. Сущность: мембрана состоит из подложки из ацетатцеллюлозы или из нитроцеллюлозы, на которой адсорбирован поликатион, например поли-4-винил-пиридинийбромид или полиэтиленимин.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к иммуноферментному анализу, и представляет собой мембрану для разделения компонентов иммунологической реакции.
Известны различные способы, проведения твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), основанные на иммобилизации антител на твердых носителях, образовании специфических иммунокомплексов на носителе с определяемым антигеном и их выявлении с помощью ферментной метки.
Важным пунктом при проведении процедуры ИФА является стадия отделения меченых антител (антигена), не связанных в иммунокомплекс, от меченых антител (антигенов), связанных в иммунокомплекс. В процедурах ИФА гетерогенного типа для этого проводят иммобилизацию антител (антигена) на твердых нерастворимых носителях. Это, однако, приводит к значительному увеличению времени анализа.
Также известны способы разделения компонентов иммунохимической реакции с использованием фильтрации на пористых нитроцеллюлозных мембранах, что упрощает процедуру и исключает необходимость иммобилизации одного из компонентов в том случае, когда размер анализируемого соединения превышает диаметр пор.
В качестве прототипа предлагается микропланшет с фильтрующим дном, изготовленным из нитроцеллюлозной мембраны (диаметр пор 0,54 мкм), используемый в методе определения висцерального лейшманиоза человека [1] Образец паразитов инкубировали с формалином, наносили на микропланшеты, далее инкубировали с анализируемой пробой. Разделение в данном случае осуществлялось вследствие большого размера антигена.
Данная мембрана не позволяет осуществлять разделения компонентов в нижеописанном методе.
Известен способ проведения иммуноферментного анализа биологически активных веществ, осуществляемый следующим образом. К исследуемому образцу добавляют антитела, ковалентно иммобилизованные на водорастворимом поликатионе или полианионе, например полиметакриловой кислоте (ПМАК), и конъюгат антител (антигенов), меченых ферментом, при этом в растворе одновременно протекают реакции: связывания иммобилизованных антител с антигеном и мечеными антигенами (антителами). После образования растворимых иммунокомплексов раствор приводят в контакт с нерастворимым положительно заряженным носителем (полимером), вследствие чего компоненты, связанные с иммобилизованными антителами, адсорбируются на носителе в результате кооперативных ионных взаимодействий между молекулами отрицательно заряженного полианиона, содержащего иммунокомплекс антигена с мечеными ферментом антителами, и положительно заряженным носителем. После промывания носителя с целью удаления неспецифически связавшегося конъюгата антител с ферментом на него наносят раствор субстрата фермента и количественно измеряют концентрацию продукта, которая пропорциональна концентрации определяемого антигена и служит характеристикой его содержания в исследуемом растворе. Концентрацию антигена в исследуемом образце определяют с помощью калибровочного графика, полученного при использовании стандартных препаратов.
Для разделения компонентов иммунологической реакции, в результате которой образуется отрицательно заряженный комплекс полианиона и антигена, связанного с антителом, меченым ферментом, предлагается использовать мембрану, которая представляет собой подложку из ацетат- или нитроцеллюлозы, на которой адсорбирован поликатион. В качестве поликатиона можно использовать поли-4-винил-пиридинийбромид (ПВП), хитозан, полиэтиленимин и др.
Если в качестве носителя используют положительно заряженную мембрану, а продукт ферментативной реакции является нерастворимым и удерживается на мембране, то детекцию можно проводить визуально.
Заряженные мембраны получают следующим образом. Нитро- или ацетатцеллюлозные фильтры помещают в раствор поликатиона и инкубируют в нем в течение 1-2 ч при комнатной температуре.
П р и м е р 1. Анализ иммуноглобулинов G (IgG) человека.
В качестве антител использовали γ -глобулиновую фракцию кроличьей антисыворотки против IgG человека, дополнительно очищенную ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-Sephacel.
Иммуносорбенты на основе ПМАК по- лучали ковалентным связыванием антигенов или антител с ПМАК, используя в качестве сшивающих агентов водорастворимые карбодиимиды (1-этил-3(3-диметил-аминопропил)-карбодиимид гидрохлорид или 1-циклогексил-3-(2-морфолино-4-этил)-карбо- диимид n-толуол-фосфат) совместно с N-оксисукцинимидом.
В качестве антигена использовали коммерческий препарат IgG человека.
В качестве фермента использовали пероксидазу хрена с RZ=3,0 (ПХ).
Конъюгат IgG человека с пероксидазой (ПХ/ЕС1.11.1.7) получали методом окисления углеводного компонента фермента периодатом натрия.
Нерастворимый заряженный полимер готовили следующим образом.
Нитроцеллюлозные фильтры производства фирмы "Синпор" инкубировали в растворе 1˙10-7 М поли-4-винил-пиридинийбромида с молекулярной массой 80000 в калий-фосфатном буфере рН 7,2 (КФБ) в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем фильтры блокировали в 3%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина в КФБ в течение 1 ч при комнатной температуре.
В серию инкубационных пробирок, содержащих IgG человека в концентрациях 1˙10-9, 5˙10-10, 2˙10-10, 1˙10-10, 5˙10-11, 2˙10-11 М в 0,01 калий-фосфатном буфере рН 7,2, 0,05% Твин-20, 0,15М NaCl, добавляли 0,1 мл раствора конъюгата IgG-пероксидаза (1˙10-11 М). Затем в пробирку добавляли 0,1 мл раствора иммуносорбента (1˙10-10 М), инкубировали 5 мин при комнатной температуре.
Разделяли компоненты раствора пропуская его через нитроцеллюлозный фильтр с иммобилизованным ПВП. Детекцию ферментной метки на фильтре вели инкубацией его в растворе субстратов, содержащем 3,3'-диаминобензидин (0,5 мг/мл), перекись водорода 1˙10-3 М и добавки солей кобальта (0,2%).
Пересчет интенсивности окрашивания фильтра в концентрацию измеряемого IgG производили по калибровочному графику, полученному со стандартными препаратами IgG. Чувствительность метода составила 5˙10-11 М.
П р и м е р 2. Анализ HBS-антигена.
В качестве антител использовали γ -глобулиновую фракцию кроличьей антисыворотки против НBS-антигена.
Иммуносорбенты на основе ПМАК по- лучали как в примере 1.
В качестве антигена использовали коммерческий препарат HBS-антигена.
В качестве фермента использовали пероксидазу хрена с RZ=3,0 (ПХ).
Конъюгат IgG, специфичных к HBS-антигену, с пероксидазой (ПХ/ЕС1.11.1.7) получали методом окисления углеводного компонента фермента периодатом натрия.
Нерастворимый заряженный полимер готовили следующим образом.
Ацетатцеллюлозные мембраны производства фирмы "Полимерсинтез" (Владимир) инкубировали в 1˙10-7 М растворе полиэтиленимина с молекулярной массой 50000 в калий-фосфатном буфере рН 7,2 (КФБ) в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем фильтры блокировали в 3%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина в КФБ в течение 1 ч при комнатной температуре.
В серию инкубационных пробирок, содержащих HBS-антиген в концентрациях 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2,5 и 1,25 нг/мл в 0,01 калий-фосфатном буфере рН 7,2, 0,05% Твин-20, 0,15М NaCl, добавляли 0,1 мл раствора конъюгата IgG-пероксидаза (1˙10-11 М). Затем в пробирку добавляли 0,1 мл раствора иммуносорбента (1˙10-10 М) и инкубировали 5 мин при комнатной температуре.
Разделение компонентов раствора проводили пропуская его через нитроцеллюлозный фильтр с иммобилизованным поликатионом. Детекцию ферментной метки на фильтре вели инкубацией его в растворе субстратов, содержащем 3,3'-диаминобензидин (0,5 мг/мл), перекись водорода 1˙10-3 М и добавки солей кобальта (0,2%).
Пересчет интенсивности окрашивания фильтра в концентрацию измеряемого НBS-антигена производили по калибровочному графику, полученному со стандартными препаратами HBS. Чувствительность метода составляет 2,5 нг/мл.
Таким образом, предлагаемая мембрана позволяет значительно упростить и ускорить процесс иммуноферментного анализа.
Claims (1)
- МЕМБРАНА ДЛЯ РАЗДЕЛЕНИЯ КОМПОНЕНТОВ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ, представляющая собой целлюлозную основу, отличающаяся тем, что в качестве целлюлозной основы используют ацетат- или нитроцеллюлозу, на которой адсорбирован поликатион.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU4855423/14 | 1990-07-31 | ||
| SU5542314 | 1990-07-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2038600C1 true RU2038600C1 (ru) | 1995-06-27 |
Family
ID=21616246
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU5033495 RU2038600C1 (ru) | 1990-07-31 | 1992-03-23 | Мембрана для разделения компонентов иммунологической реакции |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2038600C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000004385A1 (fr) * | 1998-07-17 | 2000-01-27 | Igor Jurievich Malyshev | Procede de detection de proteines |
-
1992
- 1992-03-23 RU SU5033495 patent/RU2038600C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Pappas M.G. et al. Trans Roy. Soc. Med. Hyg, v.79, p.136, 1985. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000004385A1 (fr) * | 1998-07-17 | 2000-01-27 | Igor Jurievich Malyshev | Procede de detection de proteines |
| RU2167425C2 (ru) * | 1998-07-17 | 2001-05-20 | Малышев Игорь Юрьевич | Способ определения белков |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4960692A (en) | Assay employing binding pair members on particles and on a filter or membrane | |
| US4407943A (en) | Immobilized antibody or antigen for immunoassay | |
| US4332783A (en) | Process for immunologic determination tests | |
| CA1336884C (en) | Visual discrimination qualitative enzyme assay | |
| US4870007A (en) | Immobilized biotinylated receptor in test device, kit and method for determining a ligand | |
| JPH0312705B2 (ru) | ||
| US5169757A (en) | Antibodies or antigens bound to a macroporous hydrophobic synthetic polymer cloth for immunological techniques | |
| US4474878A (en) | Sandwich EIA for antigen associated with hepatitis | |
| US6203706B1 (en) | Synthetic particles as agglutination reagents | |
| US5122452A (en) | Enzyme immunoassay with a macroporous hydrophobic synthetic polymer cloth containing an immobilized antibody or antigen | |
| EP0585346A1 (en) | Hla typing | |
| US5641624A (en) | Method for measuring anti-HIV-1 p24 antibody and use thereof | |
| JP3327488B2 (ja) | 被検体の免疫化学的測定方法 | |
| CA1104927A (en) | Diagnostic immunochemical test material and procedure | |
| EP0350233A2 (en) | An article for performing immunological assays utilizing organic dyes and methods for producing and utilizing same | |
| EP0217845B1 (fr) | Procede de determination immunologique d'une substance biologique dans un echantillon | |
| US7919331B2 (en) | Chromatographic test strips for one or more analytes | |
| JP2579972B2 (ja) | 膜親和濃縮免疫測定方法 | |
| RU2038600C1 (ru) | Мембрана для разделения компонентов иммунологической реакции | |
| EP0456309A1 (en) | Use of heme-containing proteins as stabilizers for enzyme-labeled immunoreactants | |
| US5589344A (en) | Test kit and method for competitive specific binding assay | |
| RU2059972C1 (ru) | Мембрана для разделения компонентов иммунохимической реакции | |
| EP0152254A2 (en) | Chromogenic support immunoassay utilizing labeled complement components | |
| RU1801214C (ru) | Способ иммуноанализа биологически активных веществ | |
| CA2019048C (en) | Cloth enzyme immunoassay |