Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к генетике чумного микроба. The invention relates to medical microbiology, in particular to the genetics of the plague microbe.
Аналогов и прототипов изобретения, относящегося к штаммам обратного лизиннезависимого мутанта чумного микроба и продуцирующего повышенное количество фракции 1, в литературе не имеется. Analogues and prototypes of the invention relating to strains of the reverse lysine-independent mutant of the plague microbe and producing an increased amount of fraction 1 are not available in the literature.
Целью изобретения является селекция из лизинзависимого штамма чумного микроба А-1435-30 lys- обратного лизиннезависимого мутанта, продуцирующего повышенное количество фракции I.The aim of the invention is the selection of a lysine-dependent strain of plague microbe A-1435-30 lys , the inverse lysine-independent mutant producing an increased amount of fraction I.
Сущностью изобретения является выявление штамма мутанта чумного микроба, обладающего повышенной продукцией фракции 1. Такой мутант выявлен у обратного лизиннезависимого мутанта чумного микроба А-1435-30 lys-, который ранее был ауксотрофен по лизину.The essence of the invention is the identification of a strain of the plague microbe mutant having increased production of fraction 1. Such a mutant was detected in the reverse lysine-independent plague microbe mutant A-1435-30 lys - , which was previously auxotrofen for lysine.
Штамм А-1435-30 имеет типичные для возбудителя чумы культурально-морфологические и другие свойства. Он растет в форме на обычных питательных средах (бульон и агар Хоттингера, среда Мартена, обычный питательный агар, среда Эндо, дрожжевая среда, гидролизаты казеина и желатина). Оптимальная температура роста 27-28oC, минимальная (еле заметный рост на 3 сутки) +2oC, максимальная +40oC. Диаметр колоний при изолированном росте на среде Хоттингера на 2-3 cутки - 2-3 мм, на пятые - 4-8 мм (при 28oC выращивания). В мазках грамотрицательные, биполярные палочки. Высокочувствителен к диагностическому чумному и псевдотуберкулезному фагам и фагу Л/413. Штамм ферментирует с образованием кислоты без газа, глицерин, глюкозу, мальтозу, маннит, арабинозу, маннозу, ксилозу; не ферментирует лактозу, сахарозу, рамнозу, дульцит, эритрит, мелибиозу, целлобинозу. Дает отрицательную реакцию нитрификации и положительную денитрификации. Имеет β -налактозидазу, реакция Фогес-Проскауэра положительная, не имеет фермента уреазы, оксидазы, редуктазы, амилазы, декарбоксилазы лизина и дегидролазы аргинина. Желатин не разжижает, не расщепляет малоната и тартрата натрия. На среде Джексона-Бэрроуза растет в виде популяций, состоящих из 100% непигментированных (pgm-) колоний. Состоит из 0,5% кальций-независимых клеток. Имеет обычные для возбудителя чумы три плазмиды: р(Саd(pVir), pPst, pFra/Тoх). Каких-либо дополнительных плазмид не имеет. Растет при 28oC на среде следующего химического состава, г: глюкоза 3, двузамещенный фосфорнокислый калий 7, однозамещенный фосфорнокислый калий 2, цитрат натрия 0,5, сернокислая магнезия 0,1, сульфит натрия 0,5, цистеин 0,05, фенилаланин 0,05, метионин 0,05, треонин 0,05, триптофан 0,05 (аминокислоты в ДЛ и Л-форме), дистиллированная вода - 1 л (в случае приготовления плотных питательных сред добавляется 30 г агар-агара). Штамм А-1435-30 авирулентен для лабораторных животных - морские свинки не погибают от 108, а белые мыши - от 105 микробных клеток при подкожном методе заражения.Strain A-1435-30 has cultural-morphological and other properties typical of the plague pathogen. It grows in form on ordinary nutrient media (Hottinger broth and agar, Marten medium, ordinary nutrient agar, Endo medium, yeast medium, casein and gelatin hydrolysates). The optimum growth temperature is 27-28 o C, the minimum (barely noticeable growth on the 3rd day) +2 o C, the maximum +40 o C. The diameter of the colonies with isolated growth on the Hottinger medium for 2-3 days is 2-3 mm, for the fifth - 4-8 mm (at 28 o C cultivation). In smears, gram-negative, bipolar sticks. Highly sensitive to diagnostic plague and pseudotuberculosis phages and phage L / 413. The strain ferments to produce acid without gas, glycerin, glucose, maltose, mannitol, arabinose, mannose, xylose; does not ferment lactose, sucrose, rhamnose, dulcite, erythritol, melibiosis, cellobinoza. It gives a negative nitrification reaction and a positive denitrification. It has β-nalactosidase, the Voges-Proskauer reaction is positive, it does not have the enzyme urease, oxidase, reductase, amylase, lysine decarboxylase and arginine dehydrolase. Gelatin does not thin, does not break down malonate and sodium tartrate. On the Jackson-Burrows environment, it grows in the form of populations consisting of 100% unpigmented (pgm - ) colonies. Consists of 0.5% calcium-independent cells. It has three plasmids common for the causative agent of the plague: p (Cad (pVir), pPst, pFra / Tox). It has no additional plasmids. Grows at 28 o C on a medium of the following chemical composition, g: glucose 3, disubstituted potassium phosphate 7, monosubstituted potassium phosphate 2, sodium citrate 0.5, magnesium sulfate 0.1, sodium sulfite 0.5, cysteine 0.05, phenylalanine 0.05, methionine 0.05, threonine 0.05, tryptophan 0.05 (amino acids in DL and L-form), distilled water - 1 l (in the case of preparing solid nutrient media, 30 g of agar-agar is added). Strain A-1435-30 is avirulent for laboratory animals - guinea pigs do not die from 10 8 , and white mice - from 10 5 microbial cells with a subcutaneous infection method.
Экспериментальную проверку повышенной продукции фракции I у штамма А-1435-30 проводили в сравнительном аспекте с эталонным вакцинным штаммом ЕV. Штаммы выращивали при 37oC на агаре Хоттингера на протяжении трех дней. Затем готовили взвесь бактерий на физрастворе, содержащих 109 микробных клеток для постановки реакции прямой гемагглютинации (РПГА) с антителами к фракции I. Опыты повторяли трижды с пятью сериями чумного эритроцитарного диагностикума, изготовляемого САНИПЧИ. Во всех опытах штамм А-1435-30 продуцировал фракции в 2-5 раза более, чем штамм EV, т.е. наличие фракции I выявлялось у первого штамма при наличии 2-3 тыс. в 0,1 мл, а у второго - 7-15 тыс. и более м.к.The experimental verification of the increased production of fraction I in strain A-1435-30 was carried out in a comparative aspect with the reference vaccine strain EV. The strains were grown at 37 ° C. on Hottinger agar for three days. Then, a suspension of bacteria was prepared in saline containing 10 9 microbial cells for the direct hemagglutination reaction (RPHA) with antibodies to fraction I. The experiments were repeated three times with five series of plague erythrocyte diagnosticum manufactured by SANIPCHI. In all experiments, strain A-1435-30 produced fractions 2-5 times more than strain EV, i.e. the presence of fraction I was detected in the first strain in the presence of 2-3 thousand in 0.1 ml, and in the second - 7-15 thousand or more m.
Наличие повышенной продукции фракции I у штамма А-1435-30 приводит к экономии питательных сред и реактивов при получении фракции I для приготовления чумных диагностикумов, а именно питательные среды и реактивы используются в 2-5 раза менее, чем при получении фракции I у штамма ЕV. The presence of increased production of fraction I in strain A-1435-30 leads to a saving in nutrient media and reagents when preparing fraction I for the preparation of plague diagnosticums, namely, nutrient media and reagents are used 2-5 times less than in obtaining fraction I in strain EV .