RU2030393C1

RU2030393C1 - Ambene ethyl ester glutamate showing antiviral activity against influenza viruses of serotype a and b

Info

Publication number: RU2030393C1
Authority: RU
Inventors: Л.И. Шевченко; В.П. Лозицкий; Т.А. Татарова; Л.Н. Кулаева; А.С. Федчук; М.О. Лозинский; Ю.И. Гирля
Original assignee: Институт органической химии АН Украины
Priority date: 1990-01-23
Filing date: 1990-01-23
Publication date: 1995-03-10

Abstract

FIELD: organic chemistry. SUBSTANCE: synthesis is carried out by reaction of ambene ethyl ester with glutamic acid in water medium at boiling. Yield is 98%, m. p. is 179-181 C, empirical formula is C₁₅H₂₂N₂O₆, toxicity LD₅₀ = 3080 mg/kg. Activity with respect to influenza viruses A and B is by 30 and 7.5-fold more as compared with that of ambene hydrazide glutamate. EFFECT: synthesis of substance of class indicated above showing increased activity. 2 tbl

Description

Изобретение относится к новому химическому соединению, а именно к глутамату этилового эфира амбена
HOOC-

CH₂-CH₂-CO

H

CH₂-C₆H₄-COOC₂H₅
(I) обладающему противовирусным действием, что предполагает его применение в медицинской практике.The invention relates to a new chemical compound, namely to the glutamate of ethyl ambene
HOOC-

CH ₂ -CH ₂ -CO

H

CH ₂ -C ₆ H ₄ -COOC ₂ H ₅
(I) possessing an antiviral effect, which suggests its use in medical practice.

Заявляемое соединение в литературе не описано. The inventive compound is not described in the literature.

Глутамат амбена обладает антифибринолитическим, противовоспалительным и антимикробным действием /1/, глутаминовая кислота и ее соли используются в медицине при заболеваниях центральной нервной системы /2/. Glutamate Ambena has antifibrinolytic, anti-inflammatory and antimicrobial effects / 1 /, glutamic acid and its salts are used in medicine for diseases of the central nervous system / 2 /.

В литературе описаны синтезы солей глутаминовой кислоты с некоторыми алифатическими, ароматическими и гетероциклическими аминами /3/. Известен глутамат гидразида амбена, обладающий противовирусной активностью /4/. The literature describes the synthesis of salts of glutamic acid with some aliphatic, aromatic and heterocyclic amines / 3 /. Known glutamate hydride of Amben, with antiviral activity / 4 /.

Наиболее близким структурным аналогом к заявляемому соединению является глутамат гидразида амбена, обладающий противовирусной активностью. В качестве базового объекта сравнения взят антивирусный препарат ремантадин, который обладает противовирусной активностью только в отношении вирусов гриппа серотипа А. The closest structural analogue to the claimed compound is glutamate amben hydrazide glutamate having antiviral activity. The antiviral drug rimantadine, which has antiviral activity only against serotype A influenza viruses, was taken as the basic object of comparison.

Общим признаком заявляемой соли и структурного аналога является наличие фрагментов п-аминометилбензойной и глутаминовой кислот. Существенным и определяющим отличием предлагаемого соединения является наличие этоксигруппы вместо гидразидной. A common feature of the claimed salt and structural analogue is the presence of fragments of p-aminomethylbenzoic and glutamic acids. An essential and defining difference of the proposed compound is the presence of an ethoxy group instead of a hydrazide one.

Цель изобретения - поиск новых производных амбена, обладающих более эффективным антивирусным действием в отношении вирусов гриппа серотипов А и В. The purpose of the invention is the search for new derivatives of Amben, with a more effective antiviral effect against influenza viruses of serotypes A and B.

Поставленная цель достигается синтезом нового соединения формулы I, обладающего противовирусной активностью (см. табл. 1 и табл. 2), которое получают взаимодействием этилового эфира амбена с глутаминовой кислотой в водной среде. This goal is achieved by the synthesis of a new compound of formula I with antiviral activity (see table. 1 and table. 2), which is obtained by the interaction of ethyl ambene with glutamic acid in an aqueous medium.

П р и м е р 1. Получение глутамата этилового эфира амбена. PRI me R 1. Obtaining glutamate ethyl ambene.

Смесь из 17,9 г (0,1 моль) этилового эфира амбена, 14,7 г (0,1 моль) глутаминовой кислоты и 100 мл воды кипятят 0,5 ч. К горячей реакционной массе добавляют 5 г активированного угля, раствор фильтруют горячим и охлаждают льдом. A mixture of 17.9 g (0.1 mol) of ambene ethyl ester, 14.7 g (0.1 mol) of glutamic acid and 100 ml of water is boiled for 0.5 h. 5 g of activated carbon are added to the hot reaction mass, the solution is filtered hot and chilled with ice.

Выпавший осадок соединения I отфильтровывают, промывают охлажденной водой, сушат. Получают 32 г (98%) белого кристаллического глутамата этилового эфира амбена с т.пл. 179-181^оС.The precipitated precipitate of compound I is filtered off, washed with chilled water, and dried. Obtain 32 g (98%) of white crystalline glutamate ethyl ambene ester with so pl. 179-181 ^about S.

Найдено, %: C 54,99; H 6,49; N 8,26. Found,%: C 54.99; H 6.49; N, 8.26.

C₁₅H₂₂N₂O_6.
Вычислено, %: C 55,21; H 6,74; N 8,59.C ₁₅ H ₂₂ N ₂ O _6.
Calculated,%: C 55.21; H 6.74; N, 8.59.

В ИК-спектре глутамата этилового эфира амбена имеется полоса поглощения валентных колебаний группы H₃N 3070 см^-1 и поглощение аминокислотной полосы 11 1530 см^-1
В УФ-спектрах (в спирте) имеется максимум поглощения при λ 231 ± 2 нм (lgε 2,71), характерный для производных п-аминометилбензойной кислоты.In the infrared spectrum of glutamate ethyl ambene ether there is an absorption band of stretching vibrations of the group H ₃ N 3070 cm ^-1 and an absorption of the amino acid band 11 1530 cm ^-1
In the UV spectra (in alcohol) there is a maximum absorption at λ 231 ± 2 nm (log ε 2.71), characteristic of derivatives of p-aminomethylbenzoic acid.

П р и м е р 2. Противовирусная активность глутамата этилового эфира амбена в отношении вируса гриппа серотипа А. PRI me R 2. Antiviral activity of glutamate ethyl ambene ether against influenza virus serotype A.

Исследование проведено на эталонном штамме вируса гриппа А(Гонконг/1/68(H3N2), который вызвал пандемию гриппа в 1968-1969 гг. и является родоначальником штаммов с антигенной формулой H3N2, актуальных и в настоящее время. The study was conducted on the reference strain of influenza A virus (Hong Kong / 1/68 (H3N2), which caused the pandemic of influenza in 1968-1969 and is the ancestor of strains with the antigenic formula H3N2, which are still relevant today.

При определении у препарата противовирусного действия его в стерильных условиях растворяли в поддерживающей среде состава: NaCl 8,0 г; KCl 0,6 г; CaCl₂ 0,8 г; MgCl₂ 0,05 г; глюкоза 0,3 г; желатин 2,0 г; левомицитин 0,1 г; фенол-рот 25 мл 0,01%-ного раствора на 1 л дистиллированной воды. рН - 7,0 (среду стерилизуют при 115^оС в течение 30 мин). На среде, содержащей препарат (опыт) и не содержащей его (контроль) разводили аллантоисный вирус А/Гонконг/1/68(H3N2) до концентрации вируса порядка 100 ЭИД₅₀ мл и 10 контрольных, и 10 опытных проб инкубировали 24 ч при 36^оС с фрагментами хорионаллантоисных оболочек (ХАО) 12-14-дневных куриных эмбрионов. Затем культуральную жидкость из опытных и отдельно контрольных проб объединяли и концентрацию инфекционного вируса в них определяли титрованием десятикратных разведений на новой культуре ХАО. Концентрацию инфекционного вируса рассчитывали методом Кербера в модификации И.П.Ашмарина и выражали в ТИД₅₀.When determining the antiviral effect of a preparation under sterile conditions, it was dissolved in a support medium of the composition: NaCl 8.0 g; KCl 0.6 g; CaCl ₂ 0.8 g; MgCl ₂ 0.05 g; glucose 0.3 g; gelatin 2.0 g; chloramphenicol 0.1 g; phenol-mouth 25 ml of a 0.01% solution per 1 liter of distilled water. pH - 7.0 (the medium is sterilized at 115 ^{° C} for 30 min). On medium containing formulation (experiment) and not containing it (control) diluted allantoic virus A / Hong Kong / 1/68 (H3N2) to a virus concentration of 100 EID ₅₀ ml, and 10 control and 10 test samples were incubated for 24 hours at 36 ^on C with fragments of chorionallantoic membranes (HAO) of 12-14-day-old chicken embryos. Then, the culture fluid from the experimental and separately control samples was combined and the concentration of the infectious virus in them was determined by titration of ten-fold dilutions in a new culture of HAO. The concentration of the infectious virus was calculated by the Kerber method in the modification of I.P. Ashmarin and expressed in TID ₅₀ .

Поскольку во всех экспериментах каждому опыту соответствовал свой контроль, т.е. имел место случай связанных выборок, то о статистической достоверности воздействия судили по непараметрическому критерию знаков (КЗ), что диктовало необходимость проведения не менее 5 опытов в серии. Одновременно исследовали прямое вирулицидное воздействие препарата на внеклеточный вирус и их влияние на чувствительность культуры к заражению после предварительной в течение 1 сут обработки ее с удалением препарата перед инфицированием клеток. Since in all experiments each experiment had its own control, i.e. Since there was a case of related samples, the statistical significance of the impact was judged by the nonparametric criterion of signs (SC), which dictated the need for at least 5 experiments in a series. At the same time, the direct virucidal effect of the drug on the extracellular virus and their effect on the sensitivity of the culture to infection after preliminary treatment for 1 day with removal of the drug before infection of the cells were investigated.

Результаты изучения противовирусного действия глутамата этилового эфира амбена на вирус гриппа А представлены в табл. 1. The results of a study of the antiviral effect of glutamate ethyl ambene on influenza A virus are presented in table. 1.

Как следует из табл. 1 глутамат этилового эфира амбена проявляет антивирусную активность в отношении вируса гриппа А в концентрации 100 мкг/мл при репродукции вируса в его присутствии. При предварительной обработке ткани препаратом, а также изучении вирулицидного его действия в указанной концентрации статистически достоверного эффекта не обнаружено. Следовательно, противовирусное действие глутамата этилового эфира амбена в отношении возбудителя гриппа А связано с непосредственным его вмешательством в процесс вирусной репродукции. В меньшей дозе противовирусное действие препарата не проявлялось. As follows from the table. 1 glutamate ethyl ambene displays antiviral activity against influenza A virus at a concentration of 100 μg / ml when the virus is reproduced in its presence. When pretreating tissue with the drug, as well as studying its virucidal effect in the indicated concentration, no statistically significant effect was found. Consequently, the antiviral effect of glutamate ethyl ambene ether against the pathogen of influenza A is associated with its direct intervention in the process of viral reproduction. In a lower dose, the antiviral effect of the drug was not manifested.

Глутамат гидразида амбена, выбранный в качестве референс-препарата, поскольку он близок по структуре и также обладает противогриппозным действием, тормозит репродукцию вируса гриппа А в дозе 3 мг/мл /4/, т.е. в 30 раз большей, чем эффективная концентрация испытуемого глутамата этилового эфира амбена. Заявляемое соединение проявляет антивирусное действие в отношении вируса гриппа серотипа А в 100 раз меньшей дозе, чем глутамат п-аминометилбензойной кислоты, обладающий антифибринолитической, противовоспалительной и антимикробной активностью /1/. Однако данные литературы свидетельствуют, что известный противогриппозный препарат ремантадин проявляет антивирусное действие в культуре ткани в отношении вирусов гриппа серотипа А при его концентрации 25-50 мкг/мл. Glutamate of Amben hydrazide, chosen as a reference drug, since it is similar in structure and also has an anti-influenza effect, inhibits the reproduction of influenza A virus at a dose of 3 mg / ml / 4 /, i.e. 30 times greater than the effective concentration of the tested glutamate ethyl ambene. The inventive compound exhibits an antiviral effect against influenza virus serotype A in a 100 times lower dose than glutamate p-aminomethylbenzoic acid, which has antifibrinolytic, anti-inflammatory and antimicrobial activity / 1 /. However, literature data indicate that the well-known anti-influenza drug remantadine exhibits an antiviral effect in tissue culture against serotype A influenza viruses at a concentration of 25-50 μg / ml.

Таким образом, глутамат этилового эфира амбена в отношении вирусов гриппа серотипа А проявляет более выраженное антивирусное действие, чем глутамат гидразида амбена и глутамат амбена, но менее выраженное, чем ремантадин. Thus, glutamate ethyl ambene ethyl ester against serotype A influenza viruses exhibits a more pronounced antiviral effect than glutamate hydrazide amben and glutamate amben, but less pronounced than remantadine.

П р и м е р 3. Противовирусная активность этилового эфира амбена в отношении вируса гриппа серотипа В. PRI me R 3. Antiviral activity of ethyl ambene ether against influenza virus serotype B.

Исследование проведено на штамме В/Ленинград/17/86, выделенном в г. Ленинграде в 1986 г. При определении антивирусного действия глутамата этилового эфира амбена, его предварительно растворяли в спецсреде описанного в примере 2 состава. Затем определяли снижение инфекционной активности вируса В при титровании ее на фрагментах ХАО в присутствии препарата (опыт) по сравнению с инфекционной активностью вируса, определенной в отсутствие препарата (контроль). Одновременно исследовали прямое вирулицидное действие препарата на внеклеточный вирус и их влияние на чувствительность культуры к заражению после предварительной в течение 1 суток обработки ее с удалением препарата перед инфицированием клеток. Инкубация вируса гриппа В при заражении им фрагментов ХАО во всех вариантах опытов продолжалась 72 ч при 34^оС. Расчет ТИД₅₀ и статистическая обработка проводились, как в примере 2.The study was conducted on strain B / Leningrad / 17/86, isolated in Leningrad in 1986. When determining the antiviral effect of glutamate ethyl ambene, it was previously dissolved in a special environment described in example 2 composition. Then, the decrease in the infectious activity of virus B was determined by titrating it on HAO fragments in the presence of the drug (experiment) compared with the infectious activity of the virus determined in the absence of the drug (control). At the same time, the direct virucidal effect of the drug on the extracellular virus and their effect on the sensitivity of the culture to infection after preliminary treatment for 1 day with removal of the drug before infection of the cells were investigated. Incubation influenza virus when infecting them HAO fragments in all embodiments experiments lasted 72 hours at 34 ^o C. The calculation TID ₅₀ and the statistical processing is carried out as in Example 2.

Результаты изучения противовирусного действия глутамата этилового эфира амбена на вирус гриппа В представлены в табл. 2. The results of a study of the antiviral effect of glutamate ethyl ambene on ester of influenza B are presented in table. 2.

Как следует из табл. 2, глутамат этилового эфира амбена проявляет антивирусную активность в отношении вируса гриппа В в концентрации 400 мкг/мл при репродукции вируса в его присутствии. При предварительной обработке ткани препаратом, а также изучении вирулицидного его действия статистически достоверного эффекта не обнаружено. Следовательно, противовирусное действие глутамата этилового эфира амбена в отношении возбудителя гриппа В связано с непосредственным его вмешательством в процесс вирусной репродукции. Референс-препарат - глутамат гидразида амбена проявляет противовирусное действие в отношении вируса гриппа В в дозе 5 мг/мл, т.е. в дозе в 7,5 раз большей, чем эффективная концентрация испытуемого глутамата этилового эфира амбена. Глутамат этилового эфира амбена проявляет антивирусное действие в отношении вируса гриппа серотипа В в 25 раз меньшей дозе, чем глутамат амбена /1/. As follows from the table. 2, glutamate ethyl ambene displays antiviral activity against influenza B virus at a concentration of 400 μg / ml when the virus is reproduced in its presence. When pretreating tissue with the drug, as well as studying its virucidal effect, no statistically significant effect was found. Consequently, the antiviral effect of glutamate ethyl ambene ether against the causative agent of influenza B is due to its direct intervention in the process of viral reproduction. The reference drug, glutamate of Amben hydrazide, exhibits an antiviral effect against influenza B virus at a dose of 5 mg / ml, i.e. at a dose 7.5 times greater than the effective concentration of the tested glutamate ethyl ambene. Amben glutamate ethyl ester exhibits an antiviral effect against influenza virus serotype B in a 25 times lower dose than glutamate amben / 1 /.

По литературным данным известный противогриппозный препарат ремантадин проявляет антивирусное действие только в отношении штаммов вируса гриппа серотипа А, но не В. According to the literature, the well-known anti-influenza drug remantadine exhibits an antiviral effect only against influenza virus strains of serotype A, but not B.

П р и м е р 4. Токсичность глутамата этилового эфира амбена проверена на половозрелых белых мышах (масса 19-21 г) согласно общепринятой методике. При внутримышечном введении результаты опытов показали, что соединение 1 согласно ГОСТ 12.1.007-76 "Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности" относится к малотоксичным веществам. Его ЛД₅₀=3080 (2970-3190) мг на 1 кг массы тела животного. При пероральном введении ЛД₅₀= 6490 (6350-6630) мг на 1 кг массы тела животного.PRI me R 4. The toxicity of glutamate ethyl ambene tested on sexually mature white mice (weight 19-21 g) according to standard methods. When administered intramuscularly, the results of the experiments showed that compound 1 according to GOST 12.1.007-76 "Harmful substances. Classification and general safety requirements" refers to low-toxic substances. Its LD ₅₀ = 3080 (2970-3190) mg per 1 kg of animal body weight. When administered orally, LD ₅₀ = 6490 (6350-6630) mg per 1 kg of animal body weight.

Как видно из табл. 1 и 2 глутамат этилового эфира амбена обладает противовирусной активностью не только в отношении вирусов гриппа серотипа А, но в отличие от ремантадина, и в отношении вирусов гриппа серотипа В, причем это воздействие проявляется в отношении вируса гриппа А в 30, а в отношении вируса гриппа В в 7,5 раз меньшей дозе, чем у глутамата гидразида амбена, соответственно в 100 и 25 раз меньшей дозе, чем у глутамата амбена. Этим определяется его преимущество как перед ремантадином, так и глутаматами амбена и гидразида амбена. Кроме того, заявляемое соединение в 10 раз менее токсично, чем ремантадин. As can be seen from the table. 1 and 2, glutamate ethyl ambene has antiviral activity not only against influenza viruses of serotype A, but unlike remantadine, and against influenza viruses of serotype B, and this effect is manifested in relation to influenza A virus in 30, and in relation to influenza virus 7.5 times smaller dose than glutamate of Amben hydrazide, respectively 100 and 25 times less than glutamate of Amben. This determines its advantage both over remantadine and glutamates of Amben and Amben hydrazide. In addition, the claimed compound is 10 times less toxic than remantadine.

Claims

GLATAMATE ETHYL ETHER AMBENE WITH ANTIVIRAL ACTIVITY AGAINST INFLUENZA VIRUSES, SEROTYPES A AND B.

Ambene Ethyl Glutamate

possessing antiviral activity against influenza viruses of serotypes A and B.