RU2027763C1

RU2027763C1 - Method of preparing of bacterial extracellular lectin

Info

Publication number: RU2027763C1
Authority: RU
Inventors: В.А. Кудря; И.А. Симоненко; И.Я. Захарова; В.С. Подгорский; Э.А. Коваленко
Original assignee: Институт микробиологии и вирусологии им.Д.К.Заболотного АН Украины
Priority date: 1991-05-20
Filing date: 1991-05-20
Publication date: 1995-01-27

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: method of preparing of bacterial extracellular lectin from cultural fluid Bacillus medentericus 316M is proposed. Method involves lectin isolation in the process of technological stage of enzyme preparation of elastolytic action. Preparation is prepared from a mixture of cultural fluid flows after sorption of elastoterase on carboxylic cationite by precipitation with ammonium sulfate. EFFECT: improved method of lectin preparing. 3 dwg, 2 tbl

Description

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения бактериальных лектинов. The invention relates to the microbiological industry, and in particular to methods for producing bacterial lectins.

Известны способы получения бактериальных внеклеточных лектинов, включающие выращивание продуцента лектина глубинным методом, отделение биомассы, концентрирование лектина осаждением органическими растворителями или солями и, при необходимости, его дальнейшему очистку. Known methods for producing bacterial extracellular lectins, including the cultivation of a lectin producer by the deep method, the separation of biomass, the concentration of lectin by precipitation with organic solvents or salts, and, if necessary, its further purification.

Недостатком известных способов получения бактериальных лектинов является необходимость наработки больших объемов культуральной жидкости, что обусловлено относительно низким уровнем биосинтеза этих биологически активных веществ микроорганизмами. A disadvantage of the known methods for producing bacterial lectins is the need to produce large volumes of culture fluid, due to the relatively low level of biosynthesis of these biologically active substances by microorganisms.

Известен способ получения бактериального лектина, специфичного к сиаловым кислотам из штамма - продуцента Bacillus mesentericus 316 M (авт. св. N 1622397). Cпособ включает выращивание продуцента глубинным методом на полусинтетической питательной среде, отделение биомассы центрифугированием, концентрирование лектина осаждением сернокислым аммонием при 60-70%-ном насыщении, отделение осадка, содержащего лектин, центрифугированием, диализ против воды, повторное центрифугирование и замораживание или сушку лектина. Данный способ позволяет получить выход целевого продукта по активности до 47-60%. A known method of producing bacterial lectin specific for sialic acids from a strain producer Bacillus mesentericus 316 M (ed. St. N 1622397). The method includes growing the producer by the in-depth method on a semisynthetic nutrient medium, separating the biomass by centrifugation, concentrating the lectin by precipitation with ammonium sulfate at 60-70% saturation, separating the precipitate containing lectin, centrifuging, dialysis against water, re-centrifuging and freezing or drying the lectin. This method allows to obtain the yield of the target product in activity up to 47-60%.

Недостатком приведенного способа получения внеклеточного лектина является низкий выход по активности, т.е. его низкая производительность, заключающаяся в необходимости наработки больших объемов культуральной жидкости, что обусловливает высокую себестоимость вещества и загрязнение окружающей среды продуктами микробиологического синтеза, а также низкая степень чистоты получаемого внеклеточного лектина. The disadvantage of this method of obtaining extracellular lectin is a low yield in activity, i.e. its low productivity, consisting in the need to produce large volumes of culture fluid, which leads to a high cost of the substance and environmental pollution by microbiological synthesis products, as well as a low degree of purity of the obtained extracellular lectin.

Известен способ получения фермента эластолитического действия (эластотеразы) из Bacillus mesentericus 316 M (авт.св. N 1314673), включающий выращивание продуцента на полусинтетической питательной среде, отделение биомассы от культуральной жидкости, очистку эластотеразы методом ионообменной хроматографии (пропусканием культуральной жидкости через колонку с карбоксильным катионитом КМ-2П или СГ-1М в Са²⁺ или Ва²⁺-форме, отмывку сорбента от балластных белков водой, десорбцию эластотеразы 0,5-1,0 М раствором аммонийно-ацетатного буфера при рН 10,3-10,6) и последующую лиофильную сушку высокоочищенного ферментного препарата.A known method of producing an enzyme of elastolytic action (elastoterase) from Bacillus mesentericus 316 M (ed. St. N 1314673), including growing the producer on a semi-synthetic nutrient medium, separating the biomass from the culture fluid, purifying the elastoterase by ion exchange chromatography (passing the culture fluid through a column with a carboxylic KM-2P or SG-1M cation exchanger in Ca ²⁺ or Ba ²⁺ form, washing the sorbent from ballast proteins with water, desorption of elastoterase with 0.5-1.0 M solution of ammonium acetate buffer at pH 10.3-10.6 ) and I will follow freeze drying of a highly purified enzyme preparation.

Особенностью вышеприведенных способов получения сиалоспецифичного лектина и фермента эластолитического действия является то, что для получения указанных продуктов были использованы питательные среды, близкие по качественному составу компонентов, но различные по их количественному содержанию. Причем оптимизация состава сред проводилась в каждом конкретном случае по максимальному накоплению одного из целевых продуктов без учета другого. A feature of the above methods for producing a sialospecific lectin and an enzyme with an elastolytic effect is that to obtain these products, nutrient media were used that were similar in the qualitative composition of the components, but different in their quantitative content. Moreover, the optimization of the composition of the media was carried out in each case according to the maximum accumulation of one of the target products without taking into account the other.

Целью изобретения является увеличение выхода по активности внеклеточного лектина, повышение степени его чистоты, стабильности при хранении, а также снижение себестоимости продукта и уменьшение загрязнения окружающей среды продуктами микробиологического производства. The aim of the invention is to increase the yield of extracellular lectin activity, increase its purity, storage stability, as well as reduce the cost of the product and reduce environmental pollution by products of microbiological production.

Поставленная цель достигается тем, что выделение бактериального внеклеточного лектина осуществляется на одном из этапов технологического процесса получения фермента эластолитического действия (эластотеразы) путем использования не культуральной жидкости Bacillus mesentericus 316M, а стоков, образующихся после извлечения фермента эластотеразы ионообменной хроматографией, что значительно упрощает процесс получения внеклеточного лектина, не требует проведения культивирования продуцента лектина и снижает себестоимость продукта почти в три раза. This goal is achieved by the fact that the isolation of bacterial extracellular lectin is carried out at one of the stages of the technological process for the production of an enzyme of elastolytic action (elastoterase) by using not the Bacillus mesentericus 316M culture fluid, but the effluents formed after extraction of the elastoterase enzyme by ion-exchange chromatography, which greatly simplifies the process of obtaining extracellular lectin, does not require cultivation of the producer of lectin and reduces the cost of the product by almost three times.

По предлагаемому способу на полусинтетической питательной среде глубинным методом выращивают продуцент фермента эластолитического действия и внеклеточного лектина - B.mesentericus 316M. По окончании ферментации биомассу отделяют центрифугированием или сепарированием. Культуральную жидкость подкисляют до рН 5,7-6,5 0,5 М раствором соляной или уксусной кислоты и пропускают через колонку с карбоксильным катионитом КМ-2П или СГ-1М в Са²⁺ или Ва²⁺-форме для селективной сорбции эластотеразы. После отмывки сорбента водой производят десорбцию эластотеразы 0,5-1,0 М аммонийно-ацетатным буфером и, при необходимости, сушку полученного препарата.According to the proposed method, a producer of an enzyme of elastolytic action and extracellular lectin, B.mesentericus 316M, is grown by a deep method on a semi-synthetic nutrient medium. After fermentation, the biomass is separated by centrifugation or separation. The culture fluid is acidified to pH 5.7-6.5 with a 0.5 M solution of hydrochloric or acetic acid and passed through a column of carboxyl cation exchange resin KM-2P or SG-1M in a Ca ²⁺ or Ba ²⁺ form for selective sorption of elastoterase. After washing the sorbent with water, the elastoterase is desorbed with 0.5-1.0 M ammonium acetate buffer and, if necessary, the resulting preparation is dried.

За счет того, что при ионообменной хроматографии идет высокоизбирательная сорбция эластотеразы, жидкость, вытекающая с колонки (стоки), представляет собой бесклеточную культуральную жидкость, содержащую 50-53% исходных белков, но без фермента эластолитического действия и некоторых минорных белков - пигментов. Эти стоки, а также промывные воды, вытекающие с колонки при промывке сорбента водой по окончании сорбции эластотеразы, являются исходным сырьем для получения лектина. Выделение лектина осуществляют осаждением его из смеси стоков и промывных вод сернокислым аммонием при 40-60%-ном насыщении. Образовавшийся осадок отделяют сепарированием или центрифугированием и диализируют против воды, затем повторно центрифугируют и полученный осадок замораживают или высушивают. Схематически предлагаемый способ получения внеклеточного лектина приведен на чертеже. Выход препарата внеклеточного лектина по активности составляет до 83,6%. Due to the fact that highly selective sorption of elastoterase occurs during ion exchange chromatography, the liquid flowing out of the column (drains) is a cell-free culture fluid containing 50-53% of the original proteins, but without the enzyme of elastolytic action and some minor proteins - pigments. These effluents, as well as the wash water flowing from the column when washing the sorbent with water at the end of sorption of elastoterase, are the feedstock for lectin. The selection of lectin is carried out by precipitation from a mixture of effluents and washings with ammonium sulfate at 40-60% saturation. The precipitate formed is separated by separation or centrifugation and dialyzed against water, then centrifuged again and the resulting precipitate is frozen or dried. A schematically proposed method for producing extracellular lectin is shown in the drawing. The yield of extracellular lectin in activity is up to 83.6%.

Как видно из представленной схемы, получение внеклеточного лектина по предлагаемому способу позволяет утилизировать технологические стоки, богатые микробным белком, и исключить следующие энерго- и материалоемкие процессы:
ТП 2. Приготовление посевного материала (выращивание от 1 до 3 сут. при 37 ±2^оС).As can be seen from the presented scheme, the production of extracellular lectin by the proposed method allows to utilize technological effluents rich in microbial protein, and to exclude the following energy and material-intensive processes:
TP 2. Preparation of inoculum (growing from 1 to 3 days. At 37 ± 2 ° ^C).

ТП 3. Выращивание культуры в ферментере при постоянных перемешивании, аэрации и температуре 37±2^оС в течение 16-20 ч. (в лаборатории - на микробиологической качалке при частоте оборотов 160-200 мин^-1 и температуре 37± 2^оС в течение 16-20 ч - получение культуральной жидкости и затем ее охлаждение до 8-10^оС.TP 3. Cultivation in a fermenter with constant stirring, aeration and a temperature of 37 ± 2 ^о С for 16-20 hours (in the laboratory - on a microbiological shaker at a speed of 160-200 min ^-1 and a temperature of 37 ± 2 ^о С for 16-20 hours - getting the culture fluid and then cooling it to 8-10 ^about C.

ТП 4. Отделение культуральной жидкости от биомассы сепарированием (центрифугированием при 5000-6000 об/мин). TP 4. Separation of culture fluid from biomass by separation (centrifugation at 5000-6000 rpm).

Затраты на эти этапы составляют около 60% от всех затрат на технологический процесс получения внеклеточного лектина из B.mesentericus 316М. The costs of these stages account for about 60% of the total cost of the process for obtaining extracellular lectin from B.mesentericus 316M.

Применение предлагаемого способа наряду с улучшением экономических показателей позволяет получить препарат внеклеточного лектина со степенью чистоты, в 16 раз превышающей степень чистоты известного препарата, увеличить выход лектина на 23% и уменьшить примесь протеолитического фермента в 250 раз, что способствует более полному сохранению активности лектина при последующей очистке и хранении. Сравнительная характеристика препаратов внеклеточного лектина, полученных по способу-прототипу и предлагаемому способу, а также данные по стабильности их при хранении приведены в табл.1 и 2. The application of the proposed method along with the improvement of economic indicators allows to obtain an extracellular lectin preparation with a degree of purity 16 times higher than the purity of the known drug, increase the lectin yield by 23% and reduce the impurity of the proteolytic enzyme by 250 times, which contributes to a more complete preservation of lectin activity during subsequent cleaning and storage. Comparative characteristics of extracellular lectin preparations obtained by the prototype method and the proposed method, as well as data on their storage stability are shown in tables 1 and 2.

П р и м е р 1. Культуру-продуцент фермента эластолитического действия и внеклеточного лектина выращивают глубинным способом на полусинтетической питательной среде в колбах Эрленмейера на качалках при 160 об/мин и температуре 37^оС в течение 22±2 ч. По окончании культивированию биомассу отделяют центрифугированием при 5000-6000 об/мин, супернатант в количестве 3,0 л с рН 8,0-8,2 и активностью 1500-3000 ПЕ/мл подкисляют 0,5 г соляной кислоты до рН 6,6 и пропускают через колонку диаметром 5,5±0,5 см, высотой 25± 5 см, содержащую 110± 10 мл суспензии пористого карбоксильного катионита КМ-2П, предварительно переведенного в Са²⁺-форму. Скорость протекания культуральной жидкости через колонку составляет 100 мл/см² ч. После окончания сорбции колонку с сорбентом промывают водой со скоростью 50 мл/см² ч до прозрачных промывных вод.EXAMPLE EXAMPLE 1 The culture of the enzyme-producing elastolytic action and the extracellular lectin grown in deep method semisynthetic medium in Erlenmeyer flasks on a shaker at 160 rev / min and ³⁷ ° C for 22 ± 2 hours. After cultivation biomass separated by centrifugation at 5000-6000 rpm, the supernatant in an amount of 3.0 l with a pH of 8.0-8.2 and activity of 1500-3000 PE / ml acidified with 0.5 g of hydrochloric acid to pH 6.6 and passed through a column with a diameter of 5.5 ± 0.5 cm, a height of 25 ± 5 cm, containing 110 ± 10 ml of a suspension of porous carboxyl second cation exchanger KM-2P, previously converted to Ca ²⁺ form. The flow rate of the culture fluid through the column is 100 ml / cm ² h. After sorption is completed, the column with the sorbent is washed with water at a speed of 50 ml / cm ² h to clear wash water.

Культуральную жидкость без эластотеразы, вытекающую с колонки (3 л) и промывные воды (около 0,5 л) собирают в одну емкость, куда вносят сернокислый аммоний из расчета 304 г/л (40% насыщения), перемешивают до полного растворения. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при 5000-6000 об/мин в течение 20 мин, затем растворяют в минимальном количестве дистиллированной воды и диализуют 8-12 ч против проточной водопроводной воды. Затем повторно центрифугируют и супернатант - препарат внеклеточного лектина - замораживают или высушивают. Одновременно с выделением внеклеточного лектина из стоков культуральной жидкости и промывных вод проводят десорбцию эластотеразы с карбоксильного катионита. Удельная лектиновая активность составляет 213 титр^-1/мг белка, выход препарата внеклеточного лектина по активности - 32%, степень очистки 57,6 раз.The culture fluid without elastoterase flowing from the column (3 L) and washings (about 0.5 L) are collected in one container, where ammonium sulfate is added at a rate of 304 g / l (40% saturation), and mixed until completely dissolved. The precipitate is separated by centrifugation at 5000-6000 rpm for 20 minutes, then dissolved in a minimum amount of distilled water and dialyzed for 8-12 hours against running tap water. Then, the supernatant, the extracellular lectin preparation, is centrifuged again and frozen or dried. Simultaneously with the release of extracellular lectin from the effluent of the culture fluid and washings, the elastoterase is desorbed from the carboxyl cation exchanger. The specific lectin activity is 213 titer ^-1 / mg protein, the output of the extracellular lectin preparation by activity is 32%, the degree of purification is 57.6 times.

П р и м е р 2. Условия выращивания и схема выделения фермента эластолитического действия и внеклеточного лектина те же, что и в примере 1, но осаждение лектина проводят сернокислым аммонием из расчета 380 г/л (50% насыщения). PRI me R 2. The growing conditions and the allocation scheme of the enzyme elastolytic action and extracellular lectin are the same as in example 1, but the precipitation of the lectin is carried out with ammonium sulfate at a rate of 380 g / l (50% saturation).

Удельная лектиновая активность составляет 320 титр^-1/мг белка, выход препарата внеклеточного лектина по активности - 84%, а степень очистки 86,4 раз.The specific lectin activity is 320 titer ^-1 / mg protein, the output of the extracellular lectin preparation by activity is 84%, and the degree of purification is 86.4 times.

П р и м е р 3. Условия выращивания продуцента и схема выделения фермента эластолитического действия и внеклеточного лектина те же, что и в примере 1, но осаждение лектина из остатков культуральной жидкости после сорбции эластотеразы и промывных вод проводят из расчета 456 г сернокислого аммония на 1 л стоков (60% насыщения). PRI me R 3. The producer growing conditions and the allocation scheme of the elastolytic enzyme and extracellular lectin are the same as in example 1, but the lectin is precipitated from the residues of the culture fluid after sorption of elastoterase and washings at the rate of 456 g of ammonium sulfate per 1 liter of effluent (60% saturation).

Удельная лектиновая активность составляет 100 титр^-1/мг белка, выход препарата внеклеточного лектина по активности - 48%, степень очистки 27 раз.The specific lectin activity is 100 titer ^-1 / mg protein, the output of the extracellular lectin preparation by activity is 48%, the degree of purification is 27 times.

П р и м е р 4. Культуру - продуцент эластолитического действия внеклеточного лектина выращивают глубинным способом в аппарате объемом 0,75 м³, коэффициент заполнения 0,5; при температуре 37± 2^оС, аэрации 0,5-1,0 м³ О₂/м³ мин, оборотах мешалки 170± 20 мин^-1 в течение 20± 2 ч. По окончании процесса культивирования культуральную жидкость с активностью 2000-3000 ПЕ/л с рН 8,2-8,6 захолаживают до 10-15^оС подачей рассола в рубашку ферментера и сжатым воздухом передают на сепарацию. Биомассу отделяют сепарированием, культуральную жидкость подкисляют 0,5 М соляной кислотой до рН 6,5 и пропускают через колонку (диаметр 10 ±0,5 см и высота 55± 10 см) с карбоксильным катионитом СГ-1М (1,2 л), предварительно переведенного в Са²⁺-форму. Скорость протекания культуральной жидкости через колонку составляет 5 л/ч.PRI me R 4. Culture - producer of the elastolytic action of extracellular lectin is grown in a deep way in an apparatus with a volume of 0.75 m ³ , the fill factor of 0.5; at a temperature of 37 ± 2 ^{° C,} aeration of 0,5-1,0 m ³ O ₂ / m ³ min, impeller speed of 170 ± 20 min ^-1 for 20 ± 2 hours. After completion of the cultivation process with culture broth activity 2000- 3000 CFU / l pH 8,2-8,6 quenched to 10-15 ^C. brine jacketed fermenter and compressed air is transmitted to the separation. The biomass is separated by separation, the culture fluid is acidified with 0.5 M hydrochloric acid to pH 6.5 and passed through a column (diameter 10 ± 0.5 cm and height 55 ± 10 cm) with carboxylic cation exchanger SG-1M (1.2 L), previously converted to Ca ²⁺ form. The flow rate of the culture fluid through the column is 5 l / h.

После окончания сорбции эластотеразы колонку с сорбентом промывают дистиллированной водой со скоростью 2,5-3,0 л/ч до отсутствия поглощения по белку в промывных водах. Промывные воды также сливают в емкость, где собраны стоки с колонки. Общий объем стоков составляет 317-320 л. По окончании промывки колонки проводят десорбцию эластотеразы аммонийно-ацетатным буфером (1,0 М; рН 10,5). After the end of sorption of elastoterase, the column with the sorbent is washed with distilled water at a rate of 2.5-3.0 l / h until protein is absorbed in the washings. Wash water is also poured into the tank, where wastewater from the column is collected. The total volume of effluents is 317-320 liters. At the end of the column washing, the elastoterase is desorbed with ammonium acetate buffer (1.0 M; pH 10.5).

В смесь стоков культуральной жидкости после сорбции эластотеразы на карбоксильном катионите в промывных водах при перемешивании вносят сернокислый аммоний в количестве 114 кг на 315-320 л (50% насыщения) и образовавшийся осадок отделяют сепарированием, затем растворяют в 3-5 л воды, диализируют и центрифугируют. Полученный осадок - препарат внеклеточного лектина - замораживают или высушивают. Ammonium sulfate in the amount of 114 kg per 315-320 l (50% saturation) is added to the mixture of culture liquid effluents after sorption of elastoterase on a carboxylic cation exchange resin in wash water with stirring and the precipitate formed is separated by separation, then dissolved in 3-5 l of water, dialyzed and centrifuged. The resulting pellet — an extracellular lectin preparation — is frozen or dried.

Удельная лектиновая активность составляет 320 титр^-1 мг белка, выход препарата лектинов по активности - 84%, а степень очистки 86 раз.The specific lectin activity is 320 titer ^-1 mg of protein, the yield of lectin preparation by activity is 84%, and the degree of purification is 86 times.

П р и м е р 5. Условия выращивания продуцента и схема выделения фермента эластолитического действия и внеклеточного лектина те же, что и в примере 4, но осаждение лектина из стоков культуральной жидкости после сорбции эластотеразы и промывных вод проводят из расчета 70% насыщения аммонием, т. е. в количестве 160 кг соли на 317-320 л стоков. PRI me R 5. The producer growing conditions and the allocation scheme of the elastolytic enzyme and extracellular lectin are the same as in example 4, but the lectin precipitation from the effluent of the culture fluid after sorption of elastoterase and wash water is carried out at a rate of 70% saturation with ammonium, i.e., in the amount of 160 kg of salt per 317-320 liters of effluent.

Удельная лектиновая активность препарата составляет 74 титр^-1/мг белка, выход по активности - 45%, степень очистки 20 раз.The specific lectin activity of the drug is 74 titer ^-1 / mg protein, the activity yield is 45%, the degree of purification is 20 times.

Таким образом, для выделения внеклеточного лектина по предлагаемому способу оптимальная степень насыщения сернокислым аммонием составляет 40-60%. При более низких концентрациях сернокислого аммония (менее 40%) осаждение белков вообще и лектинов в частности не происходит. При степени насыщения сернокислым аммонием, равной 70%, отмечается снижение удельной лектиновой активности без увеличения выхода по активности. Thus, for the allocation of extracellular lectin according to the proposed method, the optimal degree of saturation with ammonium sulfate is 40-60%. At lower concentrations of ammonium sulfate (less than 40%), precipitation of proteins in general and lectins in particular does not occur. With a degree of saturation with ammonium sulfate equal to 70%, a decrease in specific lectin activity is noted without increasing the yield in activity.

Claims

METHOD FOR PRODUCING BACTERIAL EXTRACELLULAR LECTIN, including the cultivation of producer Bacillus mesentericus 316M by the deep method on a semisynthetic nutrient medium, the separation of biomass and the extraction of extracellular lectin by precipitation with ammonium sulfate and subsequent dialysis, which increases its yield so that stability upon receipt and storage, as well as cost reduction and environmental pollution by microbiological synthesis products , the lectin is isolated after the elastolytic enzyme is isolated from the culture fluid by ion-exchange chromatography on carboxylic cation exchanger, moreover, a mixture of culture liquid effluents and washings after sorption of elastoterase on carboxylic cationite is used as raw material for lectin extraction, and lectin is precipitated with ammonium sulfate at 40 - 60%