RU2026347C1

RU2026347C1 - Strain of bacterium alteromonas haloplanktis - a producer of polyuridyl-endoribonuclease

Info

Publication number: RU2026347C1
Authority: RU
Inventors: Л.А. Романенко; Е.Ю. Плисова; Ю.В. Федосов; В.В. Михайлов; В.А. Рассказов; Г.Б. Еляков
Original assignee: Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН
Priority date: 1992-07-10
Filing date: 1992-07-10
Publication date: 1995-01-09

Abstract

FIELD: biotechnology, molecular biology. SUBSTANCE: strain Alteronomas haloplanktis is deposited in All-Union Collection of industrial microorganisms at number B-3906. Strain does not show pathogenicity and toxicity for human and animals. Strain A. haloplanktis is a producer of polyuridyl-endoribonuclease which specifically splits polyuridylic acid that can be used as a tool for structural-functional investigation of ribonucleic acids investigation. The yield of enzyme is 0.1 mg per 1 g of crude biomass, enzyme activity is 3000 U/mg. EFFECT: enhanced yield of enzyme. 1 tbl

Description

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии и представляет собой штамм, продуцирующий эндорибонуклеазу, специфически расщепляющую полиуридиловую кислоту. Данная эндорибонуклеаза может быть использована в качестве инструмента исследования структурно-функциональной организации рибонуклеиновых кислот. The invention relates to biotechnology and molecular biology, and is a strain producing endoribonuclease, specifically cleaving polyuridilic acid. This endoribonuclease can be used as a tool for studying the structural and functional organization of ribonucleic acids.

Описаны эндорибонуклеазы эукариотического и микробного происхождения, проявляющие специфичность к полиуридиловой кислоте, выделенные из личинок средиземноморской плодовой мухи Ceratitis capitata [1], из тимуса теленка [2] , а также из культуральной жидкости миксомицета Physarum polycephalum [3]. Из высокоспецифичных нуклеаз описаны пиримидинспецифичные эндорибонуклеазы, выделенные из личинок ракообразных Artemia salina [4] и из крови больных системной красной волчанкой [5]. Endoribonuclease of eukaryotic and microbial origin, which are specific for polyuridylic acid, isolated from larvae of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata [1], from the thymus of a calf [2], and also from the culture fluid of myxomycete Physarum polycephalum [3] are described. Pyrimidine-specific endoribonuclease isolated from the larvae of crustaceans Artemia salina [4] and from the blood of patients with systemic lupus erythematosus have been described among highly specific nucleases [5].

Большую группу эндонуклеаз составляют эндонуклеазы микроорганизмов. Микроорганизмы из различных таксономических групп могут образовывать эндонуклеазы, аналогичные по биохимическим свойствам. Большое число эндорибонуклеаз, продуцируемых микроорганизмами, не имеет определенной специфичности. Среди них найден только один тип рибонуклеаз, обладающих высокой специфичностью, это гуанилрибонуклеазы. Ферменты такого типа выделены из разных источников, например бактерии Bacillus pumilus, некоторых видов актиномицетов. A large group of endonucleases are the endonucleases of microorganisms. Microorganisms from various taxonomic groups can form endonucleases that are similar in biochemical properties. A large number of endoribonucleases produced by microorganisms does not have a specific specificity. Among them, only one type of ribonuclease with high specificity was found, it is guanyl ribonuclease. Enzymes of this type were isolated from various sources, for example, bacteria Bacillus pumilus, some types of actinomycetes.

Не обнаружено микроорганизмов, в частности штаммов бактерий, продуцирующих пиримидинспецифичные эндорибонуклеазы. No microorganisms were found, in particular bacterial strains producing pyrimidine-specific endoribonuclease.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, сводилась к поиску штамма, продуцирующего эндорибонуклеазу, расщепляющую полиуридиловую кислоту. The problem to which the invention is directed, was to search for a strain producing endoribonuclease that breaks down polyuridyl acid.

Известно, что микроорганизмы, выделенные из морской среды (свободноживущие и ассоциированные с животными), способны синтезировать различные ферменты, в том числе нуклеазы. В процессе исследования нуклеазной активности глубоководных морских микроорганизмов выделен штамм бактерии Alteromonas haloplanktis, продуцирующий эндорибонуклеазу, специфически расщепляющую полиуридиловую кислоту. It is known that microorganisms isolated from the marine environment (free-living and associated with animals) are able to synthesize various enzymes, including nucleases. In the process of studying the nuclease activity of deep-sea marine microorganisms, a strain of the bacterium Alteromonas haloplanktis was isolated that produces endoribonuclease that specifically cleaves polyuridylic acid.

Штамм изолирован из морской воды путем прямого посева на среду Горбенко 0,1 мл морской воды. Пробы отбирали на глубине 1950 м в северо-западной части Тихого океана. The strain is isolated from sea water by direct seeding on Gorbenko’s medium with 0.1 ml of sea water. Samples were taken at a depth of 1950 m in the northwestern part of the Pacific Ocean.

Штамм Alteromonas haloplanktis депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером В-3906. Хранится в Тихоокеанском институте биоорганической химии под номером КММ 223. The strain Alteromonas haloplanktis is deposited in the All-Union Collection of Industrial Microorganisms under the number B-3906. It is stored in the Pacific Institute of Bioorganic Chemistry under the number KMM 223.

Штамм выбран по признаку наибольшей удельной активности по отношению к полиуридиловой кислоте и идентифицирован как штамм бактерии вида Alteromonas haloplanktis. The strain was selected based on the highest specific activity with respect to polyuridyl acid and identified as a strain of the bacterium of the species Alteromonas haloplanktis.

Культуру хранят в пробирках на агаризованной среде следующего состава, г/л: глюкоза 1,0; пептон 5,0; дрожжевой экстракт 2,5; К₂НРО₄ 0,2; MgSO₄ 0,05; агар-агар 2,0, морская вода 750 мл; вода дистиллированная 250 мл; рН 7,2-7,8 под вазелиновым маслом, а также в лиофилизированном состоянии на обезжиренном молоке при 4^оС.The culture is stored in test tubes on an agar medium of the following composition, g / l: glucose 1.0; peptone 5.0; 2.5 yeast extract; K ₂ NRA ₄ 0.2; MgSO ₄ 0.05; agar-agar 2.0, seawater 750 ml; distilled water 250 ml; pH 7.2-7.8 under paraffin oil, as well as in a lyophilized state on skim milk at 4 ° ^C.

Культурально-морфологические признаки. Клетки палочковидные, прямые, одиночные, размеры клеток 0,6-0,8 в диаметре и 1,5-1,7 мкм в длину. Спор и капсул не образуют. Подвижные с помощью одного полярного жгутика. На плотных питательных средах образуют круглые, выпуклые, блестящие, полупрозрачные колонии слизистой консистенции. Пигмента не образуют. При росте в жидкой среде образуют однородное, постоянное и умеренное помутнение. Cultural and morphological characters. The cells are rod-shaped, straight, single, cell sizes 0.6-0.8 in diameter and 1.5-1.7 μm in length. Spore and capsules do not form. Movable with a single polar flagellum. On dense nutrient media form round, convex, shiny, translucent colonies of mucous consistency. They do not form pigment. When growing in a liquid medium, they form a uniform, constant and moderate turbidity.

Физиолого-биохимические признаки. Грамотрицателен, аэроб. Реакции на оксидазу и каталазу положительны. Имеет дыхательный тип метаболизма. Гемоорганотроф. Утилизирует глюкозу, маннозу, сахарозу, ацетат натрия в качестве единственного источника углерода. Гидролизует твин-80. Амилазу и хитиназу не образует. Не растет на средах, не содержащих хлористый натрий. Хорошо растет на средах с добавлением морской воды в интервале рН 7,2-7,8. Температурный оптимум роста 20-25^оС.Physiological and biochemical characteristics. Gram-negative, aerobic. Reactions to oxidase and catalase are positive. Has a respiratory type of metabolism. Hemoorganotroph. It utilizes glucose, mannose, sucrose, sodium acetate as the sole carbon source. Hydrolyzes tween-80. Amylase and chitinase does not form. It does not grow on media that do not contain sodium chloride. It grows well on environments with the addition of sea water in the range of pH 7.2-7.8. The temperature optimum of growth is 20-25 ^o C.

Генотаксономические признаки. Молярный процент содержания Г + Ц пар в ДНК составляет 42,1. Genotaxonomic signs. The molar percentage of the content of G + C pairs in DNA is 42.1.

Штамм A. haloplanktis КММ 223 непатогенен и нетоксичен для человека и животных. Штамм A.haloplanktis культивируют на модифицированной среде Youshimizu-Kimura следующего состава г/л; пептон 5,0; дрожжевой экстракт 2,5; глюкоза 1,0; К₂НРО₄ 0,2; MgSO₄ 0,05; морская вода 750 мл, дистиллированная вода 250 мл, рН 7,2-7,5. Выращивают при качании 120 об/мин в течение 48 ч. Бактериальные клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 5000 об/мин. Выход сырой клеточной биомассы составляет 5 г/л.Strain A. haloplanktis KMM 223 is non-pathogenic and non-toxic to humans and animals. The A. haloplanktis strain is cultured on Youshimizu-Kimura modified medium of the following composition g / l; peptone 5.0; 2.5 yeast extract; glucose 1.0; K ₂ NRA ₄ 0.2; MgSO ₄ 0.05; seawater 750 ml, distilled water 250 ml, pH 7.2-7.5. They are grown by rocking at 120 rpm for 48 hours. Bacterial cells are separated from the culture fluid by centrifugation at 5000 rpm. The yield of crude cell biomass is 5 g / L.

Штамм A.haloplantkis КММ 223 продуцирует эндорибонуклеазу, расщепляющую полиуридиловую кислоту. Выход фермента составляет 0,1 мг на 1 г сырой биомассы, активность фермента 3000 ед/мг. The A. haloplantkis KMM 223 strain produces an endoribonuclease that cleaves polyuridylic acid. The yield of the enzyme is 0.1 mg per 1 g of crude biomass, the activity of the enzyme is 3000 u / mg.

Способ выделения эндорибонуклеазы, специфически расщепляющую полиуридиловую кислоту, иллюстрируется примером. A method for isolating endoribonuclease specifically cleaving polyuridylic acid is illustrated by an example.

120 г полученной биомассы клеток бактерии A.haloplanktis суспендируют в 3,6 л буфера А (0,01 М трис HCl, 0,005 M MgCl₂ 0,02% NaN₃; рН 8,0), обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе при 22 кГц в течение 36 с пятикратно порциями по 80 мл, охлаждая во льду. Полученный гомогенат центрифугируют при 5000 об/мин и температуре 0^оС в течение 30 мин. Супернатант фракционируют сульфатом аммония. Фракцию, осажденную между 35,0 и 65,0% насыщения, разбавляют буфером Б (0,01 М трис HCl, 0,005 М MgCl₂; 0,02% NaN₃; 1,5 MGA; рН 8,0) до концентрации белка 4-5 мг/мл и экстракт наносят на колонку с гидрофобным сорбентом (бензоиламиногептиламиносефароза - 4 В), уравновешенную тем же буфером. Колонку промывают буфером Б и элюируют буфером А. Активную фракцию диализуют против буфера А и наносят на уравновешенную тем же буфером колонку с анионообменником (TSK-gel DEAE-Toyopearl). Колонку промывают буфером А и проводят элюцию градиентом NaCl (0-0,5 М) в буфере А. Активную фракцию, элюируемую при 0,3 М NaCl, концентрируют методом ультрафильтрации.120 g of the obtained biomass of A.haloplanktis bacteria cells are suspended in 3.6 L of buffer A (0.01 M Tris HCl, 0.005 M MgCl ₂ 0.02% NaN ₃ ; pH 8.0), sonicated at a disintegrator at 22 kHz in for 36 s five times in 80 ml portions, cooling in ice. The homogenate is centrifuged at 5000 rev / min and at 0 ^{° C} for 30 min. The supernatant is fractionated with ammonium sulfate. The fraction precipitated between 35.0 and 65.0% saturation was diluted with buffer B (0.01 M Tris HCl, 0.005 M MgCl ₂ ; 0.02% NaN ₃ ; 1.5 MGA; pH 8.0) to protein concentration 4-5 mg / ml and the extract is applied to a column with a hydrophobic sorbent (benzoylaminoheptylaminosepharose - 4 V), balanced with the same buffer. The column is washed with buffer B and eluted with buffer A. The active fraction is dialyzed against buffer A and applied to an anion exchanger column (TSK-gel DEAE-Toyopearl) balanced with the same buffer. The column was washed with buffer A and eluted with a NaCl gradient (0-0.5 M) in buffer A. The active fraction eluted with 0.3 M NaCl was concentrated by ultrafiltration.

Схема очистки фермента представлена в таблице. The enzyme purification scheme is presented in the table.

Свойства эндорибонуклеазы. Фермент представляет собой белок субъединичного строения с мол.м. 52 кДа, состоящей из двух идентичных полипептидных цепей с мол.м. 26 кДа каждая. Оптимум рН 8,2-8,5. Активность стимулируется катионами Mg⁺⁺ и высокой концентрацией NaCl (0,2-0,5 М).Properties of endoribonuclease. The enzyme is a subunit protein with a mol.m. 52 kDa, consisting of two identical polypeptide chains with a mol.m. 26 kDa each. The optimum pH is 8.2-8.5. The activity is stimulated by Mg ⁺⁺ cations and a high concentration of NaCl (0.2-0.5 M).

В результате исследования специфичности по отношению к синтетическим полирибонуклеотидам и РНК показано, что РНКаза штамма КММ 223 A.haloplanktis с высокой скоростью гидролизует полиуридиловую кислоту. Гидролиз осуществляется по эндонуклеазному механизму с образованием конечных продуктов - пентануклеотидов с 5'-фосфатными концевыми группами. Фермент также гидролизует альтернирующие гомополирибонуклеотиды - поли (АУ) 4:6 и поли (АУ) 9: 1. Относительная скорость ферментного гидролиза этих субстратов уменьшается в следующем порядке:
поли У > поли (АУ) 4:6 > поли (АУ) 9:1. Другие синтетические гомополирибонуклеотиды и природные РНК до кислоторастворимых продуктов выделенный фермент не расщепляет.As a result of the study of specificity with respect to synthetic polyribonucleotides and RNA, it was shown that the RNase of A. khaloplanktis strain KMM 223 hydrolyzes polyuridyl acid with high speed. Hydrolysis is carried out by the endonuclease mechanism with the formation of end products - pentanucleotides with 5'-phosphate end groups. The enzyme also hydrolyzes alternating homopolyribonucleotides - poly (AC) 4: 6 and poly (AC) 9: 1. The relative rate of enzymatic hydrolysis of these substrates decreases in the following order:
poly Y> poly (AU) 4: 6> poly (AU) 9: 1. Other synthetic homopolyribonucleotides and natural RNAs do not cleave the isolated enzyme to acid-soluble products.

Claims

STRAIN OF BACTERIA ALTEROMONAS HALOPLANKTIS - PRODUCER OF POLYURIDYL-ENDORIBONUCLEASE.

The bacterial strain Alteromonas haloplanktis VKPM B-3906 is a producer of polyuridyl endoribonuclease.