Claims (44)
1. Способ получения популяции клеток молочной железы, включающий:1. A method for obtaining a population of mammary gland cells, including:
i) культивирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток млекопитающих (miPSC) в культуральной среде, содержащей костный морфогенетический белок 4 (BMP4), для получения эмбриоидных телец (ЭТ), и i) culturing mammalian induced pluripotent stem cells (miPSCs) in a culture medium containing bone morphogenetic protein 4 (BMP4) to produce embryoid bodies (EBs), and
ii) выращивание ЭТ с получением популяции клеток молочной железы.ii) growing EBs to obtain a population of mammary gland cells.
2. Способ по п. 1, в котором стадия культивирования i) включает в себя культивирование miPSC в среде MammoCult и BMP4, в системе культивирования в 3D-суспензии, например в условиях 3D-суспензии, таким образом направляя iPSC так, чтобы они дифференцировались в неневральные эктодермальные клетки, необязательно в течение по меньшей мере 12 дней.2. The method of claim 1, wherein culture step i) comprises culturing the miPSCs in MammoCult medium and BMP4, in a 3D suspension culture system, for example under 3D suspension conditions, thereby directing the iPSCs to differentiate into non-neural ectodermal cells, optionally for at least 12 days.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором стадия выращивания ii) включает в себя выращивание сформированных ЭТ в 3D-системе для встраивания, например в смешанном плавающем геле, состоящем из матриксного белка, такого как Matrigel и/или Collagen I, в течение по меньшей мере 30 дней, например в течение 32 дней, для получения лактоцитов.3. The method according to claim 1 or 2, in which the growth step ii) includes growing the formed EBs in a 3D embedding system, for example in a mixed floating gel consisting of a matrix protein, such as Matrigel and/or Collagen I, in for at least 30 days, for example 32 days, to obtain lactocytes.
4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором клетки молочной железы представляют собой клетки молочной железы человека.4. Method according to any one of paragraphs. 1-3, in which the mammary cells are human mammary cells.
5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором BMP4 добавляют в культуральную среду между днем 0 и днем 10, предпочтительно между днем 0 и днем 3, где день 0 представляет собой момент времени, когда индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) были первоначально добавлены в культуральную среду.5. Method according to any one of paragraphs. 1-4, wherein BMP4 is added to the culture medium between day 0 and day 10, preferably between day 0 and day 3, where day 0 represents the time point when the induced pluripotent stem cells (iPSCs) were initially added to the culture medium.
6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором BMP4 добавляют в культуральную среду в течение 3 дней.6. Method according to any one of paragraphs. 1-5, in which BMP4 is added to the culture medium for 3 days.
7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором BMP4 добавляют в культуральную среду в концентрации от 5 до 20 нг/мл, предпочтительно 5 нг/мл, 10 нг/мл или 20 нг/мл.7. Method according to any one of paragraphs. 1-6, wherein BMP4 is added to the culture medium at a concentration of 5 to 20 ng/ml, preferably 5 ng/ml, 10 ng/ml or 20 ng/ml.
8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором ЭТ экспрессируют один или более положительных в отношении молочной железы маркеров клеток-предшественников, необязательно выбранных из адгезивной молекулы эпителиальных клеток (EpCAM), CD49f, муцина-1 (MUC1) и GATA3.8. Method according to any one of paragraphs. 1-7, in which the EBs express one or more mammary positive progenitor cell markers, optionally selected from epithelial cell adhesion molecule (EpCAM), CD49f, mucin-1 (MUC1) and GATA3.
9. Способ по любому из пп. 1-8, в котором ЭТ обладают повышенной экспрессией одного или более положительных в отношении молочной железы маркеров клеток-предшественников по сравнению с уровнем экспрессии упомянутых положительных в отношении молочной железы маркеров клеток-предшественников в ЭТ, не обработанных BMP4.9. Method according to any one of paragraphs. 1-8, in which EBs have increased expression of one or more mammary positive progenitor cell markers compared to the level of expression of said mammary positive progenitor cell markers in EBs not treated with BMP4.
10. Способ по любому из пп. 1-9, в котором по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или более ЭТ экспрессируют один или более положительных в отношении молочной железы маркеров клеток-предшественников, причем необязательно по меньшей мере 50% ЭТ экспрессируют положительные в отношении молочной железы маркеры клеток-предшественников EpCAM и CD49f, при этом необязательно по меньшей мере 15% ЭТ экспрессируют положительные в отношении молочной железы маркеры клеток-предшественников MUC1 и CD49f, причем необязательно по меньшей мере 20% ЭТ экспрессируют положительные в отношении молочной железы маркеры клеток-предшественников MUC1 и EpCAM, и/или при этом необязательно по меньшей мере 15% ЭТ экспрессируют положительные в отношении молочной железы маркеры клеток-предшественников GATA3.10. Method according to any one of paragraphs. 1-9, wherein at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% or more of the EBs express one or more breast positive progenitor cell markers, wherein optionally at least 50% of EBs express mammary positive progenitor cell markers EpCAM and CD49f, optionally at least 15% of EBs express mammary positive progenitor cell markers MUC1 and CD49f, optionally at least 20 % of EBs express mammary positive progenitor cell markers MUC1 and EpCAM, and/or optionally at least 15% of EBs express mammary positive progenitor cell markers GATA3.
11. Способ по любому из пп. 1-10, в котором ЭТ экспрессируют один или более неневральных эктодермальных маркеров, необязательно выбранных из транскрипционного фактора АР-2-альфа (TFAP2A) и транскрипционного фактора АР-2-гамма (TFAP2C).11. Method according to any one of paragraphs. 1-10, in which the EBs express one or more non-neural ectodermal markers, optionally selected from transcription factor AP-2 alpha (TFAP2A) and transcription factor AP-2 gamma (TFAP2C).
12. Способ по любому из пп. 1-11, в котором ЭТ имеют повышенную экспрессию одного или более неневральных эктодермальных маркеров по меньшей мере в 2 раза по сравнению с уровнем экспрессии упомянутых неневральных эктодермальных маркеров в ЭТ, не обработанных BMP4, необязательно повышенную по меньшей мере в 3-15 раз.12. Method according to any one of paragraphs. 1-11, in which EBs have increased expression of one or more non-neural ectodermal markers by at least 2-fold compared to the level of expression of said non-neural ectodermal markers in EBs not treated with BMP4, optionally increased by at least 3-15 times.
13. Способ по любому из пп. 1-12, в котором ЭТ имеют сниженную экспрессию одного или более невральных эктодермальных маркеров по меньшей мере в 0,5 раза по сравнению с уровнем экспрессии упомянутых невральных эктодермальных маркеров в ЭТ, не обработанных BMP4, причем необязательно упомянутые невральные эктодермальные маркеры выбраны из гена парного бокса 6 (PAX6), ортодентового гомеобокса 2 (OXT2) и фактора транскрипции SRY-бокса 11 (SOX11).13. Method according to any one of paragraphs. 1-12, in which EBs have reduced expression of one or more neural ectodermal markers by at least 0.5 times compared to the expression level of said neural ectodermal markers in EBs not treated with BMP4, wherein optionally said neural ectodermal markers are selected from a paired gene box 6 (PAX6), orthodental homeobox 2 (OXT2), and SRY box transcription factor 11 (SOX11).
14. Способ по любому из пп. 1-13, в котором ЭТ экспрессируют один или более маркеров специфического для молока биологически активного вещества, необязательно остеопонтин (OPN).14. Method according to any one of paragraphs. 1-13, in which the EBs express one or more markers of a milk-specific bioactive substance, optionally osteopontin (OPN).
15. Способ по любому из пп. 1-14, в котором ЭТ имеют повышенную экспрессию OPN по меньшей мере в 2 раза по сравнению с уровнем экспрессии OPN в ЭТ, не обработанных BMP4, необязательно повышенную по меньшей мере в 4-18 раз.15. Method according to any one of paragraphs. 1-14, in which EBs have increased OPN expression by at least 2-fold compared to the level of OPN expression in EBs not treated with BMP4, optionally increased by at least 4-18 times.
16. Способ по любому из пп. 1-15, в котором клетки молочной железы образуют лактоцитарные органоиды, подобные молочной железе.16. Method according to any one of paragraphs. 1-15, in which mammary gland cells form lactocyte organoids similar to the mammary gland.
17. Способ по любому из пп. 1-16, в котором клетки молочной железы генерируют повышенную экспрессию маркеров специфического для молока биологически активного вещества по сравнению с клетками молочной железы, не обработанными BMP4, причем необязательно клетки молочной железы генерируют повышенную по меньшей мере в 2 раза экспрессию маркеров специфического для молока биологически активного вещества по сравнению с клетками молочной железы, не обработанными BMP4, при этом необязательно упомянутые маркеры выбраны из альфа-рецептора, связанного с эстрогеном (ESRRA), кератина 14 (KRT14) и MUC1.17. Method according to any one of paragraphs. 1-16, wherein mammary cells generate increased expression of milk-specific bioactive markers compared to mammary cells not treated with BMP4, wherein mammary cells optionally generate at least 2-fold increased expression of milk-specific bioactive markers substances compared to mammary cells not treated with BMP4, with optionally mentioned markers selected from estrogen receptor alpha (ESRRA), keratin 14 (KRT14) and MUC1.
18. Применение BMP4 для повышения эффективности дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток млекопитающих (miPSC) в клетки-предшественники молочной железы в протоколе дифференцировки.18. Use of BMP4 to enhance the differentiation efficiency of mammalian induced pluripotent stem cells (miPSCs) into mammary progenitor cells in a differentiation protocol.
19. Способ получения продукта, подобного молоку млекопитающих, включающий:19. A method for producing a product similar to mammalian milk, comprising:
C) получение лактоцитарных органоидов, подобных молочной железе, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток млекопитающих (miPSC);C) producing mammary gland-like lactocyte organoids derived from mammalian induced pluripotent stem cells (miPSC);
D) секрецию продукта, подобного молоку млекопитающих, из упомянутых лактоцитов,D) secretion of a product similar to mammalian milk from said lactocytes,
причем стадия A) включает в себя культивирование miPSC в культуральной среде, содержащей BMP4.wherein step A) involves culturing the miPSC in a culture medium containing BMP4.
20. Способ по п. 19, предназначенный для получения продукта, подобного человеческому грудному молоку,20. The method according to claim 19, intended for obtaining a product similar to human breast milk,
причем стадия A) дополнительно включает в себя:wherein step A) further includes:
i) направление индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSC) так, чтобы они дифференцировались в неневральные эктодермальные клетки, путем их культивирования в подходящей культуральной среде, содержащей BMP4, например в среде MammoCult и BMP4, в подходящей 3D-системе культивирования, например в условиях 3D-суспензии, в течение по меньшей мере 12 дней, иi) directing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to differentiate into non-neural ectodermal cells by culturing them in a suitable culture medium containing BMP4, for example MammoCult and BMP4 media, in a suitable 3D culture system, for example 3D conditions - suspension, for at least 12 days, and
ii) выращивание сформированных мЭТ (маммосфер) в подходящей 3D-системе для встраивания, например в смешанном плавающем геле, состоящем из матриксного белка, такого как Matrigel и/или Collagen I, в течение по меньшей мере 30 дней, например в течение 32 дней, для получения лактоцитов.ii) growing the formed mETs (mammospheres) in a suitable 3D embedding system, for example in a mixed floating gel consisting of a matrix protein such as Matrigel and/or Collagen I, for at least 30 days, for example for 32 days, to obtain lactocytes.
21. Способ по п. 20, в котором стадия A)i) определяется следующим образом:21. The method according to claim 20, wherein step A)i) is defined as follows:
i) получение эмбриоидных телец (ЭТ) из hiPSC путем инкубации в стандартной для iPSC среде E8, содержащей DMEM/F12, магния L-аскорбиновая кислота-2-фосфат, селенит натрия, FGF2, инсулин, NaHCO3 и трансферрин, TGFβ1 или NODAL, или в среде mTeSR™ в течение двух дней и получение мЭТ (маммосфер), сильно обогащенных неневральными эктодермальными клетками, путем инкубации ЭТ в полной среде MammoCult, содержащей базальную среду, добавку для пролиферации и дополненной BMP4, гепарином и гидрокортизоном, в течение 10 дней, и при этомi) obtaining embryoid bodies (EBs) from hiPSCs by incubation in standard iPSC medium E8 containing DMEM/F12, magnesium L-ascorbic acid-2-phosphate, sodium selenite, FGF2, insulin, NaHCO 3 and transferrin, TGFβ1 or NODAL, or in mTeSR™ medium for two days and obtaining mETs (mammospheres) highly enriched in non-neural ectodermal cells by incubating the EBs in complete MammoCult medium containing basal medium, proliferation supplement and supplemented with BMP4, heparin and hydrocortisone for 10 days, and wherein
стадия A)ii) подразделяется на дополнительные подстадии и включает в себя следующие стадии: ii), iii) и iv):Stage A)ii) is divided into additional sub-stages and includes the following stages: ii), iii) and iv):
ii) инкубацию мЭТ (маммосфер) в полной среде EpiCultB, дополненной добавкой EpiCult для пролиферации и паратиреоидным гормоном (pTHrP), в течение 5 дней,ii) incubation of mETs (mammospheres) in complete EpiCultB medium supplemented with EpiCult proliferation supplement and parathyroid hormone (pTHrP) for 5 days,
iii) стимулирование дифференцировки ветвей и альвеол и спецификации клеток молочной железы путем инкубации мЭТ (маммосфер) в среде EpiCultB, дополненной добавкой EpiCult для пролиферации, гидрокортизоном, инсулином, FGF10 и HGF, в течение 20 дней, иiii) promoting lineage and alveolar differentiation and mammary cell specification by incubating mETs (mammospheres) in EpiCultB medium supplemented with EpiCult Proliferation Supplement, hydrocortisone, insulin, FGF10 and HGF for 20 days, and
iv) индукцию экспрессии молочного белка путем инкубации мЭТ (маммосфер) в среде EpiCultB, дополненной добавкой EpiCult для пролиферации, гидрокортизоном, инсулином, эмбриональной бычьей сывороткой (FBS), пролактином, прогестероном и β-эстрадиолом, в течение 7 дней.iv) induction of milk protein expression by incubating mETs (mammospheres) in EpiCultB medium supplemented with EpiCult proliferation supplement, hydrocortisone, insulin, fetal bovine serum (FBS), prolactin, progesterone and β-estradiol for 7 days.
22. Способ по п. 20, в котором стадия A)i) определяется следующим образом:22. The method according to claim 20, wherein step A)i) is defined as follows:
i) получение эмбриоидных телец (ЭТ) из hiPSC путем инкубации в стандартной для iPSC среде E8, содержащей DMEM/F12, магния L-аскорбиновая кислота-2-фосфат, селенит натрия, FGF2, инсулин, NaHCO3 и трансферрин, TGFβ1 или NODAL, в течение двух дней и получение мЭТ (маммосфер), сильно обогащенных неневральными эктодермальными клетками, путем инкубации ЭТ в среде MammoCultB, дополненной добавкой MammoCult для пролиферации, гидрокортизоном, гепарином и BMP4, в течение 10 дней, и при этом стадия A)ii) подразделяется на дополнительные подстадии и включает в себя следующие стадии ii), iii) и iv):i) obtaining embryoid bodies (EBs) from hiPSCs by incubation in standard iPSC medium E8 containing DMEM/F12, magnesium L-ascorbic acid-2-phosphate, sodium selenite, FGF2, insulin, NaHCO 3 and transferrin, TGFβ1 or NODAL, for two days and obtaining mETs (mammospheres) highly enriched in non-neural ectodermal cells by incubating the EBs in MammoCultB medium supplemented with MammoCult Proliferation Supplement, hydrocortisone, heparin and BMP4 for 10 days, whereby stage A)ii) is subdivided into additional sub-stages and includes the following stages ii), iii) and iv):
ii) встраивание сформированных мЭТ (маммосфер) в смесь Matrigel и Collagen I, плавающую в среде EpiCultB, дополненной добавкой EpiCult для пролиферации и паратиреоидным гормоном (pTHrP), в течение 5 дней,ii) embedding the formed mETs (mammospheres) in a mixture of Matrigel and Collagen I floating in EpiCultB medium supplemented with EpiCult proliferation supplement and parathyroid hormone (pTHrP) for 5 days,
iii) стимулирование дифференцировки ветвей и альвеол и спецификации клеток молочной железы путем инкубации встроенных мЭТ (маммосфер) в среде EpiCultB, дополненной добавкой EpiCult для пролиферации, гидрокортизоном, инсулином, FGF10 и HGF, в течение 20 дней, иiii) promoting lineage and alveolar differentiation and mammary cell specification by incubating embedded mETs (mammospheres) in EpiCultB medium supplemented with EpiCult Proliferation Supplement, hydrocortisone, insulin, FGF10 and HGF for 20 days, and
iv) индукцию экспрессии молочного белка путем инкубации мЭТ (маммосфер) в среде EpiCultB, дополненной добавкой EpiCult для пролиферации, гидрокортизоном, инсулином, FBS, пролактином, прогестероном и β-эстрадиолом, в течение 7 дней.iv) induction of milk protein expression by incubating mETs (mammospheres) in EpiCultB medium supplemented with EpiCult proliferation supplement, hydrocortisone, insulin, FBS, prolactin, progesterone and β-estradiol for 7 days.
23. Способ по любому из пп. 19-22, в котором стадия A) включает в себя способ по любому из пп. 1-17.23. Method according to any one of paragraphs. 19-22, in which stage A) includes a method according to any one of paragraphs. 1-17.
24. Способ по п. 19 или 23, в котором стадию A) проводят в условиях культивирования в 3D-суспензии.24. The method according to claim 19 or 23, in which step A) is carried out under cultivation conditions in a 3D suspension.
25. Продукт, подобный человеческому грудному молоку, который можно получить в соответствии со способом по любому из пп. 19-24.25. A product similar to human breast milk, which can be obtained in accordance with the method according to any one of paragraphs. 19-24.
26. Продукт, подобный человеческому грудному молоку, по п. 25 для применения в терапии.26. A product similar to human breast milk according to claim 25 for use in therapy.
27. Применение продукта, подобного человеческому грудному молоку, по п. 25 в качестве заменителя человеческого грудного молока, необязательно заменителя грудного вскармливания.27. Use of the human breast milk-like product according to claim 25 as a human breast milk substitute, not necessarily a breastfeeding substitute.