JP2007000077A - Method for serum-free culture of adherent animal cell and culture medium for serum-free culture of adherent animal cell - Google Patents

Method for serum-free culture of adherent animal cell and culture medium for serum-free culture of adherent animal cell Download PDF

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JP2007000077A JP2005183590A JP2005183590A JP2007000077A JP 2007000077 A JP2007000077 A JP 2007000077A JP 2005183590 A JP2005183590 A JP 2005183590A JP 2005183590 A JP2005183590 A JP 2005183590A JP 2007000077 A JP2007000077 A JP 2007000077A
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Masaru Nanba
Keisuke Shibuya
啓介 渋谷
良一 芳賀
勝 難波
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Hitachi Medical Corp
株式会社日立メディコ
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for the serum-free culture of an adherent animal cell, by which the adherent animal cell can be proliferated without a serum originated from an animal, while maintaining the original functions of the cell, and to provide a serum-free culture medium. <P>SOLUTION: This method for the serum-free culture of the adhesive animal cell is characterized by inoculating the cell into a culture container whose culture surface is covered, and culturing the adhesive animal cell in the serum-free culture medium containing one or more hormones selected from cortisol and prolactin as an active ingredient. The serum-free culture medium is characterized by adding one or more hormones selected from cortisol and/or prolactin as an active ingredient to a serum-free culture medium for culturing the adherent animal cell. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は付着性動物細胞の無血清培養方法、その付着性動物細胞の培養に適した培地、その培養方法によって得られた間葉系幹細胞などに係る。 The present invention is serum-free culture method of adherent animal cells, a medium suitable for culturing the adherent animal cells, according to such mesenchymal stem cells obtained by the culture method.

詳しくは、基本培地にホルモン乃至成長因子を添加して培養する方法であって、細胞活性を損なうことなく、無血清付着性動物細胞を増殖させる培養方法及び培地に関するものである。 For more information, a method of culturing with the addition of hormones or growth factors in the basal medium, without impairing the cell activity, to a culture methods and media growing serum-free adherent animal cells.

間葉系幹細胞は骨髄および/または骨膜由来であり、未分化であるが骨、軟骨、筋、靭帯、脂肪など間葉系に属する細胞に分化する能力を備えた細胞である。 Mesenchymal stem cells are derived from bone marrow and / or periosteum, it is but undifferentiated with bone, cartilage, muscle, ligament, the ability to differentiate into cells belonging to the mesenchymal such adipocytes. 間葉系幹細胞はその分化多能性のみならず、骨髄等に存在し採取が容易な上、増殖能力が高く生体外の細胞培養環境でも容易に数を増やすことが出来る。 The mesenchymal stem cells may not their pluripotent only, on is easy exist harvested bone marrow, etc., proliferative capacity is high in vitro it can easily increase the number in the cell culture environment. そのため、骨、軟骨、腱、筋肉、脂肪、歯周組織など、多くの組織の再生医療のための移植材料として注目されている(遺伝子医学、Vol.4、No.2(2000)p58−60)。 Therefore, bone, cartilage, tendon, muscle, fat, such as periodontal tissue, has been attracting attention as an implant material for the regenerative medicine of many organizations (gene medicine, Vol.4, No.2 (2000) p58-60 ).

骨髄等に含まれる間葉系幹細胞の数は非常に少なく、骨髄液10ml中1,000細胞程度といわれている。 The number of mesenchymal stem cells contained in bone marrow and the like is very small, it is said that 1,000 cells moderate bone marrow fluid 10 ml. それに対し、間葉系幹細胞を、組織の再生医療に利用するためには10 細胞以上必要であるため、まず、この幹細胞を生体組織から採取し、それを大量に増殖させ、更に分化誘導を行う必要がある。 In contrast, the mesenchymal stem cells, since in order to use the regenerative medicine tissue must be at least 10 8 cells, first, the stem cells were harvested from the tissue, grown it in large quantities, the further differentiation induction There is a need to do. 増殖に必要な培養期間は約1ヶ月といわれている。 Culture period required for growth is said to be about one month.

間葉系幹細胞を増殖させる際、構成成分が既知の基本合成培地に動物から抽出された構成成分未知の血清を混ぜて培養を行っている。 When growing the mesenchymal stem cells are then cultured mix component unknown serum components are extracted from the animal to the known basic synthetic medium. この血清成分には、細胞の生存維持、増殖に必要な成分が含まれていると考えられている。 The serum component, survival of cells and is thought to contain ingredients necessary for growth. しかし、動物由来の血清を用いて培養された細胞には感染症(HIV、BSE、SARS等)のリスクがあり、血清の入った培地で培養された細胞を医療用に用いることは問題視されているため、血清を用いずに細胞を培養する技術が重要視されている。 However, the cells cultured with serum from animals are at risk of infection (HIV, BSE, SARS, etc.), the use of serum containing and the cells cultured in medium medical are problematic and for that, techniques for culturing cells without serum is regarded as important.

動物細胞用の無血清培地の特許文献はいくつか見られる。 Patent Document of serum-free medium for animal cell is seen some. 例えば特許文献1の工業的物質生産に使用可能な動物細胞培養用の無血清培地、特許文献2の血清添加を必要とせずに細胞が機能性を失わずに良好に培養され得る既知成分のみから構成される培地と、多くがタンパク等の生産用動物細胞培養のための無血清培地である。 For example serum-free medium for the available animal cell culture for the industrial production of substances of Patent Document 1, only known component cells without the need for added serum of Patent Document 2 can be satisfactorily culture without loss of functionality and medium configured, many of which are serum-free medium for the production for animal cell culture protein and the like. しかし、これらの無血清培地は主に生産された物質を精製する際に未知成分を多数含む血清が障害となるため、それを解決するための手段として開発されたものである。 However, since the serum contains many unknown components in these serum-free media for purifying mainly produced substance is an obstacle, which has been developed as a means to solve it.

一方、医療用材料として間葉系幹細胞を利用するために開発された技術に関する特許文献も出ている。 On the other hand, it is out of patents literature on developed techniques in order to use mesenchymal stem cells as a medical material. 例えば、特許文献3には、無血清環境下でヒト間葉系幹細胞の生存を維持する組成物及び方法が開示されている。 For example, Patent Document 3, compositions and methods for maintaining the viability of human mesenchymal stem cells under a serum-free environment is disclosed. また、特許文献4には、間葉系幹細胞の分化を誘導するためにプロスタグランジン、アスコルビン酸、コラーゲン細胞外基質等からなる骨誘導因子、分化付随因子、軟骨誘導因子等の生物活性因子と接触させることよりなる方法が開示されている。 Further, Patent Document 4, prostaglandins to induce differentiation of mesenchymal stem cells, ascorbic acid, osteoinductive factors, which consist of collagen extracellular matrix such as, differentiation associated factor, a bioactive agent such as cartilage inducing factor the method consisting of contacting is disclosed. 特許文献5には、プロラクチン又はその同効物の共存下で多能性間葉系幹細胞を培養し、間葉系幹細胞を脂肪細胞へ分化させる方法について公開されている。 Patent Document 5, culturing the pluripotent mesenchymal stem cells in the presence of a prolactin or a same equivalents, mesenchymal stem cells have been published on how to differentiate into adipocytes. しかし、間葉系幹細胞において無血清培地で分化能を維持したまま増殖させる培地及び培養方法については報告されていない。 However, there is no report about the media and culture methods for propagating while maintaining the ability to differentiate in a serum-free medium in mesenchymal stem cells.

特開平8−70859号公報 JP 8-70859 discloses 特開平8−308561号公報 JP-8-308561 discloses 特表平11−506610号公報 Kohyo 11-506610 JP 特表平10−512756号公報 Kohyo 10-512756 JP 特開2000−217576号公報 JP 2000-217576 JP

以上述べたように、従来の付着性培養の培養方法では、動物から抽出された血清を用いて培養しなければならなかった。 Above As mentioned, in the culture method of the conventional attachment culture had to be cultured using serum extracted from the animal. 医療用として細胞を調製する場合、動物から抽出された血清を用いると HIV、BSE、SARS等の感染症の危険性が残る。 When preparing the cell as a medical, HIV, BSE, the risk of infectious diseases such as SARS remains the use of sera extracted from animals. 血清の性能は個体差に大きく左右され、細胞の品質及び生産に関しても著しく差が生じていた。 Serum performance depends largely on the individual difference, significantly different with regard quality and productivity of the cells had occurred. また、細胞を用いた研究を行う際、未知成分である血清を用いた実験では、再現性を確認することが難しく、薬剤の効果を調べる研究に関しても血清に含まれている他の成分の影響まで議論することが出来なかった。 Further, when performing studies with cells, experiments with sera of unknown components, it is difficult to confirm the reproducibility, the influence of other components contained in the serum regard study to investigate the effect of a drug It could not be discussed until.

本発明は、無血清で十分な速度で培養ができる付着性動物細胞の無血清培養方法及び付着性動物細胞無血清培養用培地を提供することを目的とする。 The present invention aims at providing a serum-free culture method and adherent animal cells serum-free culture medium of adherent animal cells in a serum-free can cultured at a sufficient rate.

上記課題を解決するために、本発明は、コルチゾル又はプロラクチンを有効成分として含有する培地を用いた無血清培養方法に関し、これと成長因子を併用して培養することで、無血清で付着性動物細胞を増殖培養させることを可能とした。 In order to solve the above problems, the present invention relates to a serum-free culture method using the medium containing cortisol or prolactin as an active ingredient, by culturing in a combination of this and growth factors, adhesion animals serum It made it possible to grow cultured cells.

本発明により、付着性の動物細胞を培養して細胞を増殖させる際に、動物から抽出された血清及び蛋白を用いる必要が無くなる。 The present invention, by culturing adherent animal cells when growing the cells, it is not necessary to use a serum and protein extracted from the animal. この為、HIV、BSE、SARS等の感染症の危険性を回避することが可能となり、かつ細胞を安定して供給することができ、再生医療などに適用することが可能となる。 Therefore, HIV, BSE, it is possible to avoid the risk of infections such as SARS, and can be stably supplied to cells, it is possible to apply such a regenerative medicine.

上記のような従来技術に存在する問題点を解決するために、動物から抽出された血清成分を含まず、既知成分のみで構成される培地及び培養方法を提供する事を目的とする。 In order to solve the problems existing in the prior art as described above, it does not contain serum components extracted from the animal, an object to provide a composed media and culture methods only known component.

血清及び動物由来成分を含まず細胞を培養するために、コルチゾルによる細胞の生存性を高め、更に増殖因子を添加することで、無血清で幹細胞を培養することを実現した。 For culturing cells free of serum and animal-derived components, enhance the viability of cells by cortisol, by further addition of growth factors was achieved culturing the stem cells in serum-free. また、この無血清培地で培養した幹細胞は、分化能を維持しており、分化誘導をかけることで他の細胞への分化もできる培養を実現した。 Further, the stem cells cultured in this serum-free medium, maintains the ability to differentiate, and realize the culture can also differentiate into other cells by applying a differentiation induction. また、研究用として細胞を用いる際も、未知成分を含んだ血清と違い、細胞内のシグナル伝達等のメカニズムを明確にすることが可能となる。 Further, even when using a cell used for research, unlike serum containing unknown components, it is possible to clarify the mechanism of such intracellular signaling.

本発明の具体的実施態様を例示すると以下のとおりである。 To illustrate specific embodiments of the present invention is as follows.
上記付着性動物細胞培養用培地が、少なくとも栄養源、窒素減、ビタミン及び接着因子を含有する培養無血清培地。 The adherent animal cell culture medium, at least nutrients, nitrogen decreased, the culture serum-free medium containing vitamins and adhesion factors.
上記付着性動物細胞培養用培地は、コルチゾルを1〜100μg/mLの濃度で含有する。 The adherent animal cell culture media contains cortisol in a concentration of 1-100 [mu] g / mL.
上記付着性動物細胞培養用培地は、プロラクチンを1〜10ng/mLの濃度で含有する。 The adherent animal cell culture media contains prolactin at a concentration of 1-10 ng / mL.
(4)上記付着性動物細胞培養用培地は、リポソームとホルモンとの混合物を含有する。 (4) the adherent animal cell culture medium contains a mixture of liposome and hormones.
(5)上記付着性動物細胞培養用培地は、コルチゾルが血清アルブミンをコンジュゲイトしている。 (5) the adherent animal cell culture medium, cortisol is Konjugeito serum albumin.
(6)培養表面を被覆した培養容器に細胞を播種し、上記培地を用いて培養する付着性動物細胞の無血清培養方法。 (6) cells were seeded in a culture vessel coated with a culture surface, serum-free culture method of adherent animal cells to be cultured using the above medium. この無血清培養を複数回繰り返すことができる。 This serum-free culture can be repeated multiple times. これにより、採取した動物細胞に含まれるHIV等の危険因子の濃度を低くすることができ、生産物の利用の安全性が高まる。 Thus, the concentration of the risk factors of HIV and the like contained in the collected animal cells can be lowered, it increases the safety of use of the product.
(7)血清アルブミンがヒト血清アルブミンもしくはウシ血清アルブミンである上記付着性動物細胞の培養方法。 (7) The method of culturing the adherent animal cells is serum albumin human serum albumin or bovine serum albumin.
(8)血清アルブミンが組み換えタンパク(リコンビナントタンパク)である上記付着性動物細胞の培養方法。 (8) The method of culturing the adherent animal cells is serum albumin recombinant protein (recombinant protein).
(9)塩基性繊維芽細胞増殖因子FGF−2、インターロイキン類、血小板由来増殖因子PDGFのいずれか1種以上を共存させた上記付着性動物細胞の培養方法。 (9) basic fibroblast growth factor FGF-2, interleukins, method for culturing the adherent animal cells which are allowed to coexist one or more one of the platelet-derived growth factor PDGF.
(10)接着因子としてフィブロネクチン、コラーゲン及びラミニンのいずれか一つ以上で培養表面を被覆した培養容器に細胞を播種し、上記の無血清培地を用いて培養する付着性動物細胞の無血清培養方法。 (10) fibronectin as an adhesion factor, cells were seeded on collagen and culture container coated with a culture surface at any one or more of laminin, serum-free culture method of adherent animal cells to be cultured using a serum-free medium of the .
(11)血清を添加した培地で培養した後に細胞を回収し、接着因子としてフィブロネクチン、コラーゲン及びラミニンのいずれか一つ以上で培養表面を被覆した培養容器に該細胞を播種して、上記の無血清培地を用いて培養する付着性動物細胞の無血清培養方法。 (11) The cells were harvested after cultured in medium supplemented with serum, were seeded fibronectin, the cells to the culture vessel coated with a culture surface at any one or more of collagen and laminin as the adhesive agent, the above-free serum-free culture method of adherent animal cells to be cultured using a serum medium. このように、最初に血清存在下で動物細胞の培養を行って、次いで培養壁から細胞を引き剥がして洗浄し、所定の濃度で無血清培養容器に播種して、無血清培養を行うことができる。 Thus, initially and cultured animal cells in the presence of serum, cells were then peeled off by washing from the culture walls, and plated in serum-free culture vessel at a predetermined concentration, is possible to serum-free culture it can. この場合も、低濃度の細胞を播種することにより、危険因子の濃度を低くすることができる。 Again, by seeding the low concentration of cells, it is possible to lower the concentration of risk factors.
(12)動物由来成分を用いずに継代を行う動物細胞の無血清培養法。 (12) serum-free culture method of animal cells undergoing passaged without animal derived components.
(13)7世代以上の継代培養において多分化能を保持する動物細胞の無血清培養法。 (13) 7 serum-free culture method of animal cells retaining pluripotency in higher generation subculture.
(14)1ヶ月以上の培養が可能である動物細胞の無血清培養法。 (14) serum-free culture method of animal cells capable of more than one month of culture.
(15)コンフルエントな細胞密度の1/10 〜1/10 となる低密度の播種で増殖させる動物細胞の無血清培養法。 (15) 1/10 3 to 1/10 5 become low-density serum-free culture method of animal cells grown in inoculation of confluent cell density. 本発明はこのように非常な低濃度の播種でも効率よく培養できるという特徴を有する。 The present invention is characterized in that in this way can be efficiently cultured even at very low concentrations seeding.
(16)低密度で播種することで増殖速度を向上させる動物細胞の無血清培養法。 (16) serum-free culture method of animal cells to improve the growth rate by seeded at low density. 低密度で播種することにより、前述のように、HIVなどの危険因子の濃度を低めることができる。 By seeding at low density, as described above, it is possible to lower the concentration of risk factors such as HIV.
(17)付着性動物細胞がヒト由来の間葉系幹細胞である付着性動物細胞の無血清培養方法。 (17) serum-free culture method of adherent animal cells adherent animal cell is a mesenchymal stem cell from human.
(18)上記方法によって得られた多分化能を保持する間葉系幹細胞。 (18) mesenchymal stem cells retain pluripotency obtained by the above method.
(19)骨芽細胞への分化能を有する間葉系幹細胞。 (19) mesenchymal stem cells capable of differentiating into osteoblasts.
(20)脂肪細胞への分化能を有する間葉系幹細胞。 (20) mesenchymal stem cells capable of differentiating into adipocytes.

以下、本発明を、実施例を挙げて、より具体的に説明するが、本発明の保護範囲は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention, Examples will be described more specifically, the protection scope of the present invention is not limited to the following examples.

(コルチゾルによる生存期間の延長) (Prolongation of survival period by cortisol)
本実施例で用いた細胞はすべて米Cambrex社のヒト間葉系幹細胞(以下hMSC;タカラバイオ製品コードPT034)を購入して供試した。 Cells used in this example are all US Cambrex Corp. of human mesenchymal stem cells (hereinafter hMSC; Takara Bio product code PT034) this was subjected to buy. 本細胞は,米国FDA認可の正常骨髄提供者プログラムに基づき,18〜45歳の健常な男性ならびに妊娠していない女性の骨髄より採取した骨髄液から分離されたものである。 The cell is based on the normal bone marrow donor program of the United States FDA approval, it is one that is separated from healthy men, as well as bone marrow fluid collected from the bone marrow of non-pregnant women of 18-45 years of age. 米Cambrex社において,微生物試験(HIV−1,マイコプラズマ,B型およびC型肝炎ウイルス,細菌,酵母,カビ:陰性)と分化能試験(脂肪細胞,軟骨細胞および骨細胞への分化能:陽性)などの品質管理が行われている。 In US Cambrex Corp., microbial test (HIV-1, mycoplasma, B and C hepatitis viruses, bacteria, yeasts, fungi: negative) and differentiation tolerance test (adipocytes, ability to differentiate into chondrocytes and osteocytes: positive) quality management, such as has been carried out.

このhMSCを接着因子であるフィブロネクチンを培養面にコートした6穴プレート上に1,000個/cm の密度で播種し、血清を含まない基本培地としてのIBL Media I培地(免疫生物研究所)乃至、コルチゾル含有IBL Media I培地で37℃、5%CO 環境下で培養した。 The fibronectin is the adhesion factor hMSC were plated at a density of 1,000 / cm 2 in coated 6-well plates the culture surface, IBL Media I medium as basal medium without serum (Immuno-Biological Laboratories) to, 37 ° C. in cortisol content IBL Media I medium and incubated under 5% CO 2 environment. 各培養日数(1、4、7、11日)で、細胞をPBSで洗浄し、浮遊細胞を取り除いた後、トリプシンを用いて細胞を培養床から剥離し、コールターカウンタ(ベックマン社)により付着細胞数を計数した。 In each culture days (1, 4, 7, 11 days), cells were washed with PBS, after removing the floating cells, the cells were detached from the culture bed with trypsin, adherent cells with a Coulter counter (Beckman) I was counting the number. ただし、無血清培地として使用する基本培地はIBL Media Iに限定されるものではない。 However, the basic medium used as a serum-free medium is not limited to the IBL Media I. 上記無血清培地での細胞増殖曲線を図1に示す。 Cell growth curve in the serum-free medium shown in FIG. 基本培地のみの無血清培地では培養4日目まで増殖はするものの、その後増殖は停止し、7日目以降は減少していった。 Although in serum-free medium of the basal medium only is growth up to 4 days of culture, then the growth will stop, day 7 and later began to decrease.

一方、コルチゾルを含んだ無血清培地では4日目までコルチゾルを含まない無血清培地より早い増殖速度で増え、その後、増殖は停止するが細胞数は減少しなかった。 On the other hand, is in a serum-free medium containing cortisol increased at a faster than serum-free medium containing no cortisol up to 4 days growth rate, then, the growth did not reduce but to stop the number of cells. このことより、基本培地だけでは細胞は4日までは増殖が遅く、7日以降は徐々に細胞が付着性を失い死滅していくが、無血清培地にコルチゾルを添加することで、細胞の増殖速度が高まり、また細胞の付着性及び生存を維持させる効果があることがわかる。 From this fact, the only basal medium cells slow the growth up to 4 days, but gradually cell is 7 days or later going to kill lose adhesion, the addition of cortisol in serum-free medium, the cell proliferation rate is increased, also seen to be effective to maintain the adhesion and survival of cells.

IBL Media I培地及びIBL MediaI培地にコルチゾルを添加した無血清培地でhMSCを37℃、5%CO 環境下で1ヶ月間培養した。 IBL Media I Media and IBL MediaI media 37 ° C. The hMSC in serum-free medium supplemented with cortisol, for one month culture under 5% CO 2 environment. 図2に1ヶ月培養後の細胞の写真を示す。 Show the photographs of cells of one month after culture in Figure 2. コルチゾルを含んだ無血清培地では、1ヶ月の培養後でも細胞が培養床に付着し、生存していることがわかる。 Including cortisol in serum-free medium, the cells even after one month of culture is to adhere to the culture floor, it can be seen that the survival. 一方、コルチゾルを含まない無血清培地では、培養一ヶ月後には細胞が培養床から剥がれ、細胞の形状も丸くなり浮遊した。 On the other hand, in the serum-free medium containing no cortisol, after one month cultured cells detach from the culture bed was the shape of the cells is also rounded floating. この結果より、無血清培地にコルチゾルを含むことで少なくとも1ヶ月以上細胞を培養床に生着させ、生育させることが可能であることがわかる。 From the results, the cell at least 1 month or more by including cortisol is engrafted cultured floor serum-free medium, it can be seen that it is possible to grow. コルチゾルの添加は、無血清培地で一ヶ月以上の長期間細胞を培養することを可能にさせる。 The addition of cortisol, makes it possible to long term culturing cells of more than a month in a serum-free medium.

(コルチゾルの最適濃度) (Optimal concentration of cortisol)
IBL Media I培地に0−100μg/mLの各濃度のコルチゾルを添加した無血清培地でフィブロネクチンをコートした96穴プレート上でhMSCを培養し、播種後4日後の付着細胞数を計数した。 IBL Media were cultured hMSC Fibronectin on 96-well plates coated with serum-free medium supplemented with cortisol for each concentration of 0-100μg / mL in I medium, and counting the number of adherent cells after 4 days after seeding. 細胞の計数にはセルカウンティングキット(同仁化学)を用いた。 The cell counts were used Cell Counting Kit (Dojin Chemical). 図3に各濃度に対する付着細胞数の相対値を示す。 It shows the relative values ​​of the number of attached cells to each concentration in FIG. この図より、コルチゾルの濃度が3μg/mL以上で効果のあることがわかる。 From this figure, it can be seen that the concentration of cortisol is effective in more than 3 [mu] g / mL.

ただし、コルチゾルの最適濃度は、培養条件により変わり得るものであり、上記の濃度に限定されるものではない。 However, the optimum concentration of cortisol, which can vary by culture conditions, but is not limited to the concentration described above. 例えば、リポソームにコルチゾルを結合させることで細胞の食作用を利用し、細胞内へ容易にコルチゾルを入れることが出来るため低濃度でもコルチゾルの効果を得ることが可能である。 For example, by using the phagocytosis of cells by binding to cortisol in liposomes, it is possible to obtain the effect of cortisol in low concentrations for easily be put cortisol into the cell.

(コルチゾル+FGF−2による細胞増殖) (Cell proliferation by cortisol + FGF-2)
IBL Media I培地に増殖因子FGF−2を添加した培地とIBL Media I培地にコルチゾルとFGF−2を添加した培地でhMSCを培養し、培養16日目で継代を行った。 IBL Media were cultured hMSC in a medium with the addition of cortisol and FGF-2 in medium supplemented with growth factor FGF-2 to I medium and IBL Media I medium, were passaged cultured for 16 days. 継代では、リコンビナントトリプシン(遺伝子組み換えトリプシン)、大豆由来トリプシンインヒビターを用い、動物由来成分を用いずに行った。 The passages, recombinant trypsin (recombinant trypsin), using soybean-derived trypsin inhibitor was performed without using animal-derived components. 図4にこのときの細胞の増殖曲線を示す。 Figure 4 shows growth curves of the cells at this time. コルチゾルとFGF−2を添加した無血清培地では培養30日で図5に示すようにコンフレントな状態まで到達した。 In serum-free medium supplemented with cortisol and FGF-2 has reached confluency state as shown in FIG. 5 at 30 days of culture. 一方、FGF−2のみ添加した無血清培地では、培養8日で増殖は止まり、コンフルエントな状態まで到達しなかった。 On the other hand, in the serum-free medium alone was added FGF-2, stops the proliferation at 8 days of culture, did not reach confluence.

また、コルチゾルとFGF−2を添加した無血清培地では継代を行うと細胞の増殖は可能であったが、FGF−2のみを添加した無血清培地では継代を行っても細胞は増殖しなかった。 Further, in the serum-free medium supplemented with cortisol and FGF-2 it was possible do the proliferation of cells passaging, the cells were grown even if the passages in serum-free medium supplemented with only the FGF-2 There was no.

(播種密度の影響) (The effect of seeding density)
hMSCをフィブロネクチンをコートした6ウェルプレートに0.5、5、50、500、5,000個/cm の各播種密度で播種し、IBL Media I培地にコルチゾルとFGF−2を添加した無血清培地で37℃、5%CO 環境下で培養を行った。 serum-free hMSC were seeded at the seeding density of 0.5,5,50,500,5,000 pieces / cm 2 in 6-well plates coated with fibronectin were added cortisol and FGF-2 in IBL Media I medium 37 ° C. in a medium, the cells were cultured under 5% CO 2 environment. 図6に各播種密度での増殖曲線を示す。 It shows the growth curves for each seeding density in FIG. 標準的な血清培地(DMEMに10%ウシ胎児血清を加えた培地)では、播種時の細胞数密度は5,000個/cm と推奨されており、これはコンフレントな状態40,000個/cm の8分の1である。 In standard serum medium (Medium plus 10% fetal bovine serum in DMEM), the number density of the cells at the time of sowing is recommended as 5,000 / cm 2, which is 40,000 confluency state / which is one-eighth of cm 2. それゆえ、細胞が8倍に増殖した時点で継代を行う必要がある。 Therefore, it is necessary to carry out the passages at the time when the cells were grown to eight times. しかし、本無血清培地で培養すると、推奨よりもはるかに低い密度(2万分の1以上の密度)でも細胞を増殖させることが可能であり、継代なしに細胞を10 倍以上に増殖させることができる。 However, when cultured in the serum-free medium, much a low density (20,000 parts per more density) even possible to grow cells, cells are grown to more than 10 5 fold without passages than the recommended be able to.

この増殖曲線より培養30日までの比増殖速度を求めると図7のようになる。 When determining the specific growth rate of from up to 30 days of culture the growth curve is shown in FIG. 本無血清培地で細胞を培養すると播種密度が小さくなるにつれ、細胞の増殖が早くなることがわかる。 As seeding density and culturing the cells in the serum-free medium is decreased, it can be seen that the cell proliferation is faster. 従って播種密度を小さくすることで、早い増殖速度で細胞を増殖させることが可能であることがわかる。 Therefore by reducing the seeding density, it can be seen that it is possible to grow cells at a faster growth rate.

(インターロイキン−1αの効果) (Effect of interleukin--1α)
培養面にフィブロネクチンのコートされた6ウェルプレート上にhMSCを播種し、コルチゾル、FGF−2、インターロイキン−1αを含んだ無血清培地で培養を行った。 Were seeded hMSC into 6-well plates coated fibronectin to the culture surface was performed cortisol, FGF-2, cultured in serum-free medium containing interleukin-1 alpha. 図8にその増殖曲線を示す。 Figure 8 shows the growth curve. コルチゾル、FGF−2を含んだ(インターロイキン−1α不含)無血清培地では、標準血清培地に比して増殖は遅い。 Cortisol, including FGF-2 in (interleukin -1α free) serum-free medium, growth compared to the standard serum medium is slow.

しかし、コルチゾル、FGF−2を含む無血清培地に更にインターロイキン−1αを添加することで、播種後3日までは増殖が遅いものの、その後は標準血清培地を上回る増殖性を示した。 However, the addition cortisol, a further interleukin -1α in serum-free medium containing FGF-2, up to 3 days after seeding although growth is slow, then showed a proliferative over standard serum medium.

コルチゾル、FGF−2に加え、更にインターロイキン−1αを添加することで増殖能が向上することがわかる。 Cortisol, in addition to FGF-2, it is understood that further improves the growth ability by adding interleukin 1 alpha.

(骨芽細胞への分化能の確認) (Confirmation of the ability to differentiate into osteoblasts)
コルチゾルとFGF−2を添加した無血清培地と更にインターロイキン−1αを添加した無血清培地それぞれでhMSCを2週間培養し、骨芽細胞への分化誘導を行った。 The hMSC was cultured for 2 weeks in each serum-free medium was further added interleukin -1α with serum-free medium supplemented with cortisol and FGF-2, it was induce differentiation into osteoblasts.

骨芽細胞への分化には、骨芽細胞分化培地(Cambrex)を用いた。 Differentiation into osteoblasts were used osteoblast differentiation medium (Cambrex). 骨芽細胞分化培地には、ウシ血清の他、デキサメタゾン、アスコルビン酸、グリセロリン酸を含んでいる。 Osteoblast differentiation medium, other bovine serum, include dexamethasone, ascorbic acid, a-glycerophosphate. hMSCを無血清培地で2週間培養した後に、上記骨芽細胞分化培地に交換し、さらに2週間培養を続けた。 The hMSC after two weeks in culture in serum-free medium, was replaced in the osteoblast differentiation medium, it continued for a further two weeks in culture. この間、3日に一度新しい培地との交換を行った。 During this time, the exchange was performed once new media three days.

骨芽細胞への分化は、アルカリフォスファターゼ染色法で確認した。 Differentiation into osteoblasts, was confirmed by alkaline phosphatase staining method. 染色にはTRACP&ALP double−stain Kit(タカラバイオ)を用いた。 The staining was used TRACP & ALP double-stain Kit (Takara Bio). 手順は分化誘導を行った細胞を、PBSで1回洗浄し、細胞固定液を加え室温で5分間静置し、固定した。 The procedure was carried out differentiation induction cells were washed once with PBS, and allowed to stand for 5 minutes at room temperature was added a cell fixative and fixed. 滅菌水を加え固定液を希釈してから、固定液を取り除き、再び滅菌水で細胞を洗浄した。 Sterile water fixative was diluted added, removed fixative, the cells were washed again sterile water.

アルカリ性フォスファターゼ基質液を固定した細胞に加えた。 It was added to the fixed cells alkaline phosphatase substrate solution. 37℃、30分間インキュベートを行い発色させた。 37 ° C., was developed performed for 30 minutes. 顕微鏡により、染色像を撮影した。 By microscope, they were taken stained image. 結果を図9に示す。 The results are shown in Figure 9.

骨芽細胞に分化した細胞はアルカリフォスファターゼ活性染色によりいずれも黒褐色に染まった(図9(a)(c)(e))。 Cells differentiated into osteoblasts stained dark brown both by alkaline phosphatase activity staining (Fig. 9 (a) (c) (e)). 特に、インターロイキン−1α+コルチゾル+FGF−2(図9(c))と標準血清培地(図9(e))が強く染まっていた。 In particular, interleukin-1 alpha + cortisol + FGF-2 (to FIG. 9 (c)) and the standard serum medium (FIG. 9 (e)) were stained strongly. 一方分化誘導を行わなかった細胞に関しては、いずれも誘導を行った細胞ほど染まらなかったが、標準血清培地に関しては若干細胞が染まっており(図9(f))、誘導をかけなくても骨芽細胞への分化が起こる傾向が見られた。 For the other hand was not induced to differentiate cells, but did not stain the more cells were induced either has slightly cells stained regarding standard serum medium (FIG. 9 (f)), bone without applying induction tendency for differentiation into osteoblasts occurs was observed.

以上より、インターロイキンを加えた本無血清培地で培養することにより、骨芽細胞への自然な分化を防ぐことができ、かつ分化誘導を行うことで高い骨芽細胞への分化を行うことができることがわかる。 As described above, by culturing the serum-free medium plus interleukin, be performed differentiation can prevent natural differentiation into osteoblasts, and to a high by performing the differentiation inducing osteoblast it can be seen that.

(脂肪細胞への分化能の確認) (Confirmation of the ability to differentiate into fat cells)
コルチゾルとFGF−2を添加した無血清培地と更にインターロイキン−1αを添加した無血清培地それぞれでhMSCを2週間培養し、脂肪細胞への分化誘導を行った。 The hMSC was cultured for 2 weeks in each serum-free medium was further added interleukin -1α with serum-free medium supplemented with cortisol and FGF-2, was induction of differentiation into adipocytes.

脂肪細胞への分化には、脂肪細胞分化維持培地と脂肪細胞分化誘導培地の2種類の培地を用いた。 The differentiation into adipocytes, using two kinds of media adipocyte differentiation maintenance medium and fat cell differentiation induction medium. 脂肪細胞分化維持培地には、ウシ血清の他、ヒトインシュリンが含まれている。 The adipocyte differentiation maintenance medium, other bovine serum, contains human insulin. 脂肪細胞分化誘導培地には、ウシ血清、ヒトインシュリン(組み換え体)の他、L−グルタミン、デキサメタゾン、インドメタシン、IBMXが含まれている。 The adipocyte differentiation induction medium, bovine serum, other human insulin (recombinant), L-glutamine, dexamethasone, indomethacin, contains IBMX. 無血清培地で培養した細胞を脂肪細胞分化誘導培地に交換し、3日間培養した。 The cells cultured in a serum-free medium was replaced with adipocyte differentiation induction medium and cultured for 3 days. その後、脂肪細胞分化維持培地に交換し3日間培養した。 Then cultured replaced adipocyte differentiation maintenance medium for 3 days. 更に脂肪細胞分化誘導培地に代え、3日間と3回繰り返すことにより脂肪細胞への分化誘導を行った。 Further instead of the adipocyte differentiation induction medium was differentiation induction into adipocytes by repeating 3 days and 3 times.

脂肪細胞はオイルレッドO染色により確認した。 Fat cells were confirmed by Oil Red O staining. 手順は、分化誘導した細胞をPBSで3回洗浄し、10%ホルムアルデヒドを加え4℃、1時間静置し、細胞を固定した。 Procedure, the differentiation induction cells were washed 3 times with PBS, and added 10% formaldehyde 4 ° C., allowed to stand for 1 hour, the cells were fixed. ホルムアルデヒドを吸い取り、オイルレッドO溶液を加え、室温で15分静置し、蒸留水で3回洗浄した。 Blotting formaldehyde, Oil Red O solution was added, standing for 15 minutes at room temperature and washed 3 times with distilled water. その後、顕微鏡により細胞を観察した。 Then, the cells were observed with a microscope.

脂肪細胞に分化した細胞はオイルレッドO染色により赤色に染まる(図10)。 Cells differentiated into adipocytes stained red by Oil Red O staining (Figure 10). 分化誘導を行った図10(a)、10(c)、10(e)では顆粒状に染色された細胞が確認できるのに対し、分化誘導を行わなかった細胞図10(b)、10(d)、10(f)では全く染色されなかった。 10 subjected to differentiation induction (a), 10 (c), 10 while (e) the granular staining cells can be confirmed, was not induced to differentiate cells Figure 10 (b), 10 ( d), it was not at all staining in 10 (f). このことより、本無血清培地での培養では脂肪細胞への分化能を維持したまま増殖させることができることを示している。 From this, the culture in the serum-free media have shown that can be grown while maintaining the ability to differentiate into adipocytes. 特に、コルチゾル+FGF−2を含有する無血清培地(図10(a))より、コルチゾル+FGF−2+インターロイキン−1αを含有する培地(図10(c))の方が脂肪細胞への分化能が高く保持されることがわかる。 In particular, from the serum-free medium containing cortisol + FGF-2 (FIG. 10 (a)), who media containing cortisol + FGF-2 + interleukin 1 alpha (to FIG. 10 (c)) is the ability to differentiate into adipocytes high is held can be seen.

(他のホルモン(プロラクチン)による増強) (Enhancement by other hormones (prolactin))
フィブロネクチンのコートされた96ウェルプレートにhMSCを播種し、0.1−10ng/mLの濃度のプロラクチンを含んだ無血清培地で培養を行った。 Were seeded hMSC on 96-well plates coated fibronectin, were cultured in serum-free medium containing prolactin concentration of 0.1-10 ng / mL. 培養4日目にセルカウンティングキットを用いて細胞数の計数を行った。 They were counted in the number of cells using a cell counting kit on the fourth day culture. その結果を図11に示す。 The results are shown in Figure 11. この図より1ng/mL以上の濃度で増殖の効果があることがわかる。 It can be seen that at a concentration of at least 1 ng / mL from this figure the effect of growth.

(コルチゾルに他の因子を添加した場合の効果向上) (Effectiveness of the case of adding other factors cortisol)
上記、無血清培地内にコルチゾル+FGF−2+インターロイキン−1αを含有した無血清培地の他に、コルチゾルと他の因子の組合せで添加した無血清培地でhMSCの培養を行った。 Above, in addition to the serum-free medium containing cortisol + FGF-2 + interleukin -1α in serum-free medium, they were cultured in hMSC in serum-free medium supplemented with a combination of cortisol and other factors.

フィブロネクチンのコートされた96ウェルプレートにhMSCを播種し、4日間培養し、細胞数を計数した。 Were seeded hMSC on 96-well plates coated fibronectin and cultured for 4 days, the cells were counted number. 細胞数の計数はセルカウンティングキットを用いた。 Counting cell numbers using a cell-counting kit. 図12に各組合せの増殖効果を示す。 It shows the proliferative effects of the combination in Figure 12.

コルチゾルにプロラクチンを加えてもコルチゾル単独より効果が向上する。 Effect is improved than cortisol alone be added prolactin to cortisol. また、コルチゾルとFGF−2の組合せで大きな効果があるが、更にプロラクチン、もしくはPDGFを添加することにより増殖の向上を得ることができる。 Further, there is a great effect by the combination of cortisol and FGF-2, can be obtained an improvement in growth by the addition of further prolactin or PDGF,.

無血清培地にコルチゾルを加えたときの間葉系幹細胞の増殖曲線を示す図である。 Is a diagram showing growth curves of the mesenchymal stem cells when added to cortisol in serum-free medium. コルチゾルを加えた無血清培地(a)とコルチゾルを加えない無血清培地(b)でそれぞれ1ヶ月間間葉系幹細胞を培養したときの細胞の写真である。 Is a photographs of cells upon culturing mesenchymal stem cells each month in serum-free medium supplemented with cortisol (a) and without the addition of cortisol serum-free medium (b). 無血清培地で細胞を培養した際のコルチゾルの濃度依存性を示す図である。 It is a graph showing the concentration dependence of cortisol when cells were cultured in serum-free medium. コルチゾルとFGF−2を加えた無血清培地で継代培養を行ったときの細胞の増殖曲線を示す図である。 It is a diagram showing growth curves of the cells when subcultured in serum-free medium supplemented with cortisol and FGF-2. 破線部はFGF−2のみを添加した無血清培地で培養した増殖曲線である。 Broken lines is the growth curves were cultured in serum-free medium supplemented with only the FGF-2. コルチゾルとFGF−2を加えた無血清培地で継代培養を行ったときの(イ)播種後1日、(ロ)播種後30日の細胞写真である。 Cortisol and FGF-2 to when subcultured in serum-free medium supplemented (b) 1 day after seeding, a photographs of cells 30 days after sowing (b). 無血清培地にて各播種密度(0.5、5、50、500、5,000個/cm )で細胞を培養したときの増殖曲線である。 A growth curve when cells were cultured in the seeding density in serum-free medium (0.5,5,50,500,5,000 pieces / cm 2). 無血清培地で培養した際の、播種密度と比増殖速度との関係を示した図である。 When cultured in serum-free medium is a diagram showing the relationship between the seeding density and the specific growth rate. コルチゾル、FGF−2に加えインターロイキン−1αを添加した無血清培地で細胞を培養したときのインターロイキン−1αの効果を示す図である。 Cortisol is a diagram showing the effect of interleukin -1α when cells were cultured in serum-free medium supplemented with interleukin -1α addition to FGF-2. コルチゾルとFGF−2もしくはコルチゾルとFGF−2とインターロイキン−1αを添加した無血清培地で幹細胞を培養した後に骨芽細胞へ分化誘導を行ったときのアルカリフォスファターゼ活性による染色像である。 A stained image by alkaline phosphatase activity when subjected to differentiation induction into osteoblast cells after culturing the stem cells in serum-free medium supplemented with cortisol and FGF-2 or cortisol and FGF-2 and interleukin-1 alpha. コルチゾルとFGF−2もしくはコルチゾルとFGF−2とインターロイキン−1αを添加した無血清培地で幹細胞を培養した後に脂肪細胞へ分化誘導を行ったときの透過光像である。 A transmitted light image when performing induced to differentiate into adipocytes after culturing the stem cells in serum-free medium supplemented with cortisol and FGF-2 or cortisol and FGF-2 and interleukin-1 alpha. 無血清培地で間葉系幹細胞を培養した際のプロラクチンの濃度依存性を示す図である。 Is a graph showing the concentration dependence of prolactin when cultured mesenchymal stem cells in serum-free medium. 無血清培地にコルチゾルの他、プロラクチン、FGF−2、PDGFを様々な組合せで添加して間葉系幹細胞を培養した際の、培養4日後における付着細胞数を示した図である。 Other cortisol in serum-free medium, prolactin, at the time of culturing the mesenchymal stem cells by adding FGF-2, PDGF in various combinations, a diagram showing the number of adhered cells after 4 days of culture.

Claims (22)

  1. 培養表面を被覆した培養容器に細胞を播種し、コルチゾル及びプロラクチンの1種以上のホルモンを有効成分として含有する付着性動物細胞の無血清培地を用いて培養することを特徴とする付着性動物細胞の無血清培養方法。 Adherent animal cells, which comprises culturing with serum-free medium adherent animal cells which cells are seeded in a culture vessel coated with culture surface contains one or more hormones cortisol and prolactin as an active ingredient serum-free culture method of.
  2. 無血清培養を行って得た細胞を培養容器から剥離し再度新たな培養容器に播種を複数回繰り返すことを特徴とする請求項1記載の付着性動物細胞の無血清培養方法。 Serum-free culture method of adherent animal cells according to claim 1, wherein a plurality of times the release seeded into new culture vessels again cells obtained by performing serum-free culture from the culture vessel.
  3. 血清を添加した培地で培養した後に細胞を回収し、接着因子で培養表面を被覆した培養容器に該細胞を播種して、コルチゾル及びプロラクチンの1種以上のホルモンを有効成分として含有する無血清培地を用いて付着性動物細胞の培養を複数回繰り返すことを特徴とする付着性動物細胞の無血清培養方法。 Sera Cells were recovered after culturing in a medium added, serum-free medium containing seeded the cells to the culture vessel coated culture surface with adhesion factor, one or more hormones cortisol and prolactin as an active ingredient serum-free culture method of adherent animal cells, characterized by repeating several times the culture of adherent animal cells using.
  4. 動物由来成分を用いずに継代を行うことを特徴とする請求項1から3のいずれかに記載の付着性動物細胞の無血清培養方法。 Serum-free culture method of adherent animal cells according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the passage without the use of animal-derived components.
  5. 7世代以上の継代培養において多分化能を保持することを特徴とする請求項1から4のいずれかに記載の無血清培養方法。 Serum-free culture method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that retaining pluripotency in 7 or more generations of subculture.
  6. 1ヶ月以上の培養が可能であることを特徴とする請求項1から5のいずれかに記載の付着性動物細胞の無血清培養方法。 Serum-free culture method of adherent animal cells according to any one of claims 1 to 5, characterized in that more than 1 month of cultivation are possible.
  7. コンフルエントな細胞密度の1/10 〜1/10 となる低密度の播種で増殖させることを特徴とする請求項1から6のいずれかに記載の付着性動物細胞の無血清培養方法。 Serum-free culture method of adherent animal cells according to any one of claims 1 to 6, characterized in that grown in confluent dissemination of low density as a 1/10 3 to 1/10 5 cell density.
  8. 低密度で播種することにより増殖速度を向上させることを特徴とする請求項1から7のいずれかに記載の付着性動物細胞の無血清培養方法。 Serum-free culture method of adherent animal cell according to any of claims 1 to 7, characterized in that to improve the growth rate by seeding at low density.
  9. 付着性動物細胞がヒト由来の間葉系幹細胞である請求項1から8のいずれかに記載の付着性動物細胞の無血清培養方法。 Serum-free culture method of adherent animal cell of any adherent animal cells from claim 1 is a mesenchymal stem cell from human 8.
  10. コルチゾル及びプロラクチンの1種以上のホルモンを有効成分として含有する付着性動物細胞の無血清培養用培地。 Serum-free culture medium of adherent animal cells which contain one or more hormones cortisol and prolactin as an active ingredient.
  11. 前記培地が、栄養源、窒素源、ビタミン及び接着因子を含有する請求項10記載の付着性動物細胞の無血清培養用培地。 Wherein the medium, nutrient source, a nitrogen source, vitamins and serum-free culture medium of adherent animal cells according to claim 10, wherein comprising an adhesion factor.
  12. コルチゾルを1〜100μg/mLの濃度で培地中に含有する請求項10に記載の付着性動物細胞の無血清培養用培地。 Serum-free culture medium of adherent animal cells according to claim 10 containing cortisol in the medium at a concentration of 1-100 [mu] g / mL.
  13. プロラクチンを1〜10 ng/mLの濃度で培地中に含有する請求項10に記載の付着性動物細胞の無血清培養用培地。 Serum-free culture medium of adherent animal cells according to claim 10 containing in the medium prolactin at a concentration of 1 to 10 ng / mL.
  14. リポソームと前記ホルモンとの混合物を培地に含有させることを特徴とする請求項10から13のいずれかに記載の付着性動物細胞の培養用無血清培地。 Serum free medium for culturing adherent animal cells according to claim 10, characterized in that to contain a mixture of the liposomes hormone to the medium 13.
  15. コルチゾルが血清アルブミンをコンジュゲイトしている請求項10又は12に記載の付着性動物細胞の無血清培養用培地。 Serum-free culture medium of adherent animal cells according to claim 10 or 12 cortisol is Konjugeito serum albumin.
  16. 血清アルブミンがヒト血清アルブミンもしくはウシ血清アルブミンである請求項15記載の付着性動物細胞の無血清培養用培地。 Serum-free culture medium of adherent animal cells according to claim 15, wherein the serum albumin is human serum albumin or bovine serum albumin.
  17. 血清アルブミンが組み換えタンパク(リコンビナントタンパク)である請求項15又は16に記載の付着性動物細胞の無血清培養用培地。 Serum-free culture medium of adherent animal cells in serum albumin according to claim 15 or 16, which is a recombinant protein (recombinant protein).
  18. 塩基性繊維芽細胞増殖因子FGF−2、インターロイキン類及び血小板由来増殖因子PDGFのいずれか1種以上を共存させた請求項10から17のいずれかに記載の付着性動物細胞の無血清培養用培地。 Basic fibroblast growth factor FGF-2, for serum-free culture of adherent animal cells according to claim 10 in which the coexistence of any one or more interleukins and platelet-derived growth factor PDGF 17 Culture medium.
  19. 接着因子がフィブロネクチン、コラーゲン及びラミニンの一つ以上であることを特徴とする請求項11記載の付着性動物細胞の無血清培養用培地。 11. serum-free culture medium of adherent animal cells, wherein the attachment factor is fibronectin, collagen and laminin one or more.
  20. 請求項1から9のいずれかに記載の付着性動物細胞の無血清培養法によって得られた多分化能を保持する間葉系幹細胞。 Mesenchymal stem cells retain pluripotency obtained by serum-free culture adherent animal cells according to any one of claims 1 to 9.
  21. 骨芽細胞への分化能を有する請求項20に記載の間葉系幹細胞。 Mesenchymal stem cells of claim 20 having the ability to differentiate into osteoblasts.
  22. 脂肪細胞への分化能を有する請求項20に記載の間葉系幹細胞。 Mesenchymal stem cells of claim 20 having the ability to differentiate into adipocytes.
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