Claims (14)
1. Клеточная линии HCT116_dCas9_PCP_sgRNA-TL_53BP1, где sgRNA-TL - гидовая РНК, визуализирующая целевой локус, на который направлена проверяемая нуклеаза, и ген белка-маркера двуцепочечных разрывов ДНК 53BP1, который слит с флуоресцентным белком.1. Cell line HCT116_dCas9_PCP_sgRNA-TL_53BP1, where sgRNA-TL is a guide RNA that visualizes the target locus to which the nuclease being tested is directed, and the 53BP1 DNA double-strand break marker protein gene, which is fused with a fluorescent protein.
2. Клеточная линия по п. 1, характеризующаяся тем, что используют клетки млекопитающих, скорость деления которых составляет не менее одного деления в 2–3 суток.2. The cell line according to claim 1, characterized in that they use mammalian cells whose division rate is at least one division every 2–3 days.
3. Клеточная линия по п. 2, характеризующаяся тем, что в качестве клеток млекопитающих используют клетки человека, или мыши, или кролика.3. The cell line according to claim 2, characterized in that human, or mouse, or rabbit cells are used as mammalian cells.
4. Клеточная линия по п. 1, характеризующаяся тем, что для визуализации целевого локуса (TL) используют систему для прижизненной визуализации локусов хроматина в клетках.4. The cell line according to claim 1, characterized in that for visualization of the target locus (TL) a system is used for intravital visualization of chromatin loci in cells.
5. Клеточная линия по п. 1, характеризующаяся тем, что для прижизненной визуализации локусов хроматина в клетках используют систему CRISPR-имаджинга, основанную на связывании каталитически неактивного белка dCas9 с гидовыми РНК, имеющими аптамерные последовательности, связываемые белками, слитыми с флуоресцентным белком. 5. The cell line according to claim 1, characterized in that for intravital visualization of chromatin loci in cells, a CRISPR imaging system is used, based on the binding of the catalytically inactive dCas9 protein to guide RNAs having aptamer sequences bound by proteins fused with a fluorescent protein.
6. Клеточная линия по п. 1, характеризующаяся тем, что в качестве элементов визуализации целевого локуса используют ген dCas9, ген направляющей sgRNA_TL-8xPP7 и ген визуализирующего слитого белка PCP-sfGFP.6. The cell line according to claim 1, characterized in that the dCas9 gene, the sgRNA_TL-8xPP7 guide gene and the PCP-sfGFP imaging fusion protein gene are used as visualization elements of the target locus.
7. Клеточная линия по п. 1, характеризующаяся тем, что в качестве флуоресцентных белков используют sfGFP и tagBFP.7. The cell line according to claim 1, characterized in that sfGFP and tagBFP are used as fluorescent proteins.
8. Способ получения клеточной линии по п. 1, характеризующийся тем, что предварительно получают 3 плазмидных вектора для интеграции генных кассет в геном клеток, проводят лентивирусную трансдукцию, с последующим отбором трансдуцированных клеток HCT116_dCas9_PCP_sgRNA-TL_53BP1 с помощью клеточного сортинга в флуоресцентных каналах, детектирующих флуоресценцию sfGFP и tagBFP, а также с помощью селектирующего антибиотика пуромицина.8. The method of obtaining a cell line according to claim 1, characterized in that 3 plasmid vectors are first obtained for integrating gene cassettes into the cell genome, lentiviral transduction is carried out, followed by selection of transduced HCT116_dCas9_PCP_sgRNA-TL_53BP1 cells using cell sorting in fluorescent channels that detect fluorescence sfGFP and tagBFP, as well as using the selecting antibiotic puromycin.
9. Способ по п. 8, характеризующийся тем, что плазмидные векторы содержат последовательности, необходимые для упаковки в лентивирусные частицы, а также интегрируемые кассеты: в первом — ген dCas9 и ген устойчивости к селектирующему антибиотику пуромицину, во втором — ген белка PCP, слитого с sfGFP, в третьем — ген визуализирующей целевой локус РНК, и ген белка 53BP1, слитого с tagBFP.9. The method according to claim 8, characterized in that the plasmid vectors contain the sequences necessary for packaging into lentiviral particles, as well as integrated cassettes: in the first - the dCas9 gene and the gene for resistance to the selective antibiotic puromycin, in the second - the gene for the PCP protein fused with sfGFP, in the third - the gene for visualizing the target locus of RNA, and the gene for the 53BP1 protein fused with tagBFP.
10. Способ оценки эффективности нуклеаз-геномных редакторов, характеризующийся тем, что используют клеточную линию HCT116_dCas9_PCP_sgRNA-TL_53BP1 по п.1, клетки которой трансфицируют плазмидами, кодирующими проверяемые нуклеазы-редакторы и РНК- или ДНК-гиды, направляющие нуклеазу на целевой локус, и спустя 24−48 часов оценивают с помощью конфокальной микроскопии долю целевых локусов, в которые был внесен разрыв, по колокализации фокусов tagBFP и sfGFP; эффективность нуклеазы-редактора оценивают по доле клеток, в которых сигналы от целевого локуса и сигналы от 53BP1 колокализованы после трансфекции плазмидами, кодирующими необходимые элементы проверяемой системы редактирования генома, по сравнению с нетрансфицированными клетками. 10. A method for assessing the effectiveness of nuclease-genomic editors, characterized in that the cell line HCT116_dCas9_PCP_sgRNA-TL_53BP1 is used according to claim 1, the cells of which are transfected with plasmids encoding the nuclease editors being tested and RNA or DNA guides that direct the nuclease to the target locus, and after 24−48 hours, the proportion of target loci in which a gap was introduced is assessed using confocal microscopy by colocalization of tagBFP and sfGFP foci; The efficiency of the nuclease editor is assessed by the proportion of cells in which signals from the target locus and signals from 53BP1 are colocalized after transfection with plasmids encoding the necessary elements of the genome editing system being tested, compared with untransfected cells.
11. Способ по п.10, характеризующийся тем, что трансфекцию проводят методом электопорации, для чего прикрепленные на поверхности культуральной емкости клетки линии HCT116_dCas9_PCP_sgRNA_53BP1 снимают с поверхности с помощью раствора трипсина, суспендируют в буфере для электропорации и электропорируют согласно протоколу, а после трансфекции наносят на стекла для дальнейшей микроскопии.11. The method according to claim 10, characterized in that transfection is carried out by the method of electroporation, for which the cells of the HCT116_dCas9_PCP_sgRNA_53BP1 line attached to the surface of the culture container are removed from the surface using a trypsin solution, suspended in a buffer for electroporation and electroporated according to the protocol, and after transfection they are applied to slides for further microscopy.
12. Способ по п.11, характеризующийся тем, что используют нуклеопоратор Neon (ThermoFisher), программу для электропорации клеток HСТ116: 2 импульса тока напряжением 1050 В, длительностью 30 мс каждый.12. The method according to claim 11, characterized by the use of a Neon nucleoporator (ThermoFisher), a program for electroporation of HCT116 cells: 2 current pulses with a voltage of 1050 V, each lasting 30 ms.
13. Способ по п.10, характеризующийся тем, что долю целевых локусов, в которые внесен разрыв, оценивают по колокализации фокусов tagBFP и sfGFP в клетках HCT116_dCas9_PCP_sgRNA_53BP1, трансфицированных согласно п.11, а колокализацию оценивают по пересечению сигналов-фокусов tagBFP и sfGFP.13. The method according to claim 10, characterized in that the proportion of target loci into which a gap is introduced is assessed by the colocalization of tagBFP and sfGFP foci in HCT116_dCas9_PCP_sgRNA_53BP1 cells transfected according to claim 11, and colocalization is assessed by the intersection of tagBFP and sfGFP focus signals.
14. Способ по п.13, характеризующийся тем, что подсчет проводят среди 100 сигналов в клетках HCT116_dCas9_PCP_sgRNA_53BP1, трансфицированных по п.11 и среди 100 сигналов нетрансфицированных клеток, после чего значение процента колокализации для контроля вычитают из значения процента колокализации для опыта.14. The method according to claim 13, characterized in that the count is carried out among 100 signals in HCT116_dCas9_PCP_sgRNA_53BP1 cells transfected according to claim 11 and among 100 signals in non-transfected cells, after which the colocalization percentage value for the control is subtracted from the colocalization percentage value for the experiment.