RU2021608C1 - Способ диагностики анаэробной газовой инфекции - Google Patents
Способ диагностики анаэробной газовой инфекции Download PDFInfo
- Publication number
- RU2021608C1 RU2021608C1 SU4939222A RU2021608C1 RU 2021608 C1 RU2021608 C1 RU 2021608C1 SU 4939222 A SU4939222 A SU 4939222A RU 2021608 C1 RU2021608 C1 RU 2021608C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- acids
- diagnosis
- gangrene
- anaerobic
- clostridia
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Использование: в медицине, в методах клинической диагностики. Цель: повышение точности и специфичности способа. Сущность изобретения: у больного берут пробу ткани из очага поражения, готовят гомогенат ткани, в котором методом хроматографического анализа определяют высшие жирные кислоты и по наличию 10-оксистеариновой или одновременно 10-оксистеариновой и 10-оксиолеиновой кислот диагностируют газовую гангрену. 2 табл.
Description
Изобретение относится к медицине, и может быть использовано для клинической диагностики газовой гангрены.
Для диагностики газовой гангрены применяются бактериологические, гистологические, иммунные, биологические методы, основанные на высевании микроорганизмов на селективные среды из проб биологических жидкостей человека и их диффренциацию по особенностям ферментации субстратов, на особенностях организации клеточной стенки и ее морфологии, на иммунных реакциях бактериальных токсинов и других специфических макромолекул. Известны также хроматографические методы, основанные на специфичности профиля продуктов метаболизма клостридий или изменении состава питательной среды после их культивирования.
Недостатки известных способов состоят в том, что одни из них длительны и трудоемки, например микробиологические способы, другие связаны с применением биологических материалов (сыворотки, ферменты, питательные среды, животные), которые требуют стандартизации и постоянного контроля, что снижает эффективность их использования.
Наиболее близким к предлагаемому является способ газохроматографической диагностики анаэробной газовой инфекции (АГИ) по продуктам метаболизма клостридий, который состоит в том, что эфирные экстракты центрифугатов культуральных сред клостридий, в том числе выделенные от больных АГИ, анализируют методом газовой хроматографии и по профилю метаболитов проводят хемодифференциацию двенадцати видов клостридий, разделенных на семь групп. При этом реперными веществами в профиле основного возбудителя газовой гангрены Clostridium perfringens является уксусная, масляная и пропионовая кислоты.
Недостатком этого метода является необходимость выделения чистой культуры от больных и низкая специфичность диагностических признаков. Известно, что уксусная, пропионовая и масляная кислоты производятся многими анаэробными бактериями и на фоне смешанной анаэробной микрофлоры не позволяют однозначно судить о наличии клостридий и, следовательно, диагностировать газовую гангрену.
Целью изобретения является повышение специфичности диагностики.
Поставленная цель достигается тем, что в известном способе диагностики газовой гангрены, включающем экстракцию продуктов метаболизма клостридий из ткани больных людей, их хроматографический анализ и диагностику газовой гангрены по наличию маркерных веществ, из гомогенизата ткани в очаге поражения экстрагируют высшие жирные кислоты и по наличию в их составе 10-оксистеариновой кислоты или 10-оксистеариновой и 10-оксиолеиновой кислот совместно судят о заболевании газовой гангреной, при этом концентрацию маркерных 10-оксикислот определяют как отношение площади их хроматографического пика к площади пика гептадекановой кислоты.
Способ основан на том, что при взаимодействии клостридий с клетками организма хозяина происходит ферментативное окисление основных ненасыщенных жирных кислот с образованием 10-оксистеариновой и 10-оксиолеиновой, а иногда 10-оксипальмитиновой кислот. Эти кислоты отсутствуют в составе самих клостридий и клетках организма хозяина и поэтому могут служить хорошими маркерами газовой гангрены.
Способ является новым, так как ранее не использовали 10-оксикислоты для диагностики газовой гангрены. Способ обладает положительным эффектом, так как маркерные летучие кислоты прототипа: уксусная, масляная и пропионовая не являются строго специфичными и образуются также при неклостридиальной инфекции, а 10-оксикислоты появляются только в присутствии клостридий и (или) при наличии клинических признаков газовой гангрены.
Способ осуществляется следующим образом. Материал из очага поражения (ткань, экссудат) тщательно гомогенизируют и производят экстракцию из него высших жирных кислот (ВЖК) одним из известных способов. В процессе экстракции или после нее ВЖК переводят в летучие производные - метиловые или триметилсилиловые эфиры. Пробу полученных эфиров анализируют методом газовой хроматографии или хроматомасс-спектрометрии. Наличие в составе экстракта 10-оксистеариновой или совместно 10-оксистеариновой и 10-оксиолеиновой кислот свидетельствует о заболевании газовой гангреной. 10-оксикислоты С18: 0 и С18:1 (18-число атомов углерода, 0 и 1 - число двойных связей) образуются преимущественно при инфицировании клостридиями вида перфрингенс, а также видами эдематиенс (нови), гистолитикум и септикум. Эти кислоты не обнаруживаются в клетках самих клостридий, а также в клетках других микроорганизмов. Известно, что оксикислоты с другим расположением гидроксила - в положении 2 и 3 - присутствуют лишь в составе липида А полисахаридного антигена грамотрицательных бактерий.
10-оксикислоты ранее были обнаружены лишь в трупных тканях и для клинической диагностики не использовались.
П р и м е р 1. К 1 г материала ткани больного добавляли 2 мл изотонического раствора хлористого натрия (0,66%), материал тщательно гомогенизировали, добавляли 2,5 н. соляную кислоту в соотношении 10:1 с материалом и проводили гидролиз в термостате при 60оС в течение 6 ч. После этого материал охлаждали и проводили экстракцию гексаном два раза по 1 мл. Экстракт упаривали и обрабатывали 15 мин при 65оС с 20 мкл БСТФА (бистриметилсилилтрифторацетамида) для получения триметилсилиловых эфиров. Реакционную смесь в количестве 1-5 мкл вводили в инжектор хроматографа с капиллярной колонкой. Заболевание газовой гангреной определяли по наличию 10-оксистеариновой кислоты. Ее количественную характеристику получали отнесением площади хроматографического пика этой кислоты к площади пика гептадекановой кислоты. Результаты по примеру 1 в сопоставлении с клиническими и бактериологическими данными обследования больных приведены в табл. 1, NN 1-4 и 6-12.
П р и м е р 2. Водную фазу гомогенизата после экстракции гексаном по примеру 1 депротеинизировали 30%-ной сульфосалициловой кислотой, центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин, супернатант выпаривали, а сухой остаток экстрагировали метанолом 2 раза по 1 мл. Объединенный экстракт упаривали, обрабатывали БСТФА, анализировали как в примере 1 и определяли наличие 10-оксикислот С18 и их количественные показатели. Результаты по примеру 2 приведены в табл.1, N 5.
В таблице приведены данные, которые показывают, что во всех случаях обследования больных, у которых по клиническим данным зафиксировано заболевание газовой гангреной, диагноз подтверждается анализом 10-оксикислот, а при отсутствии такового эти кислоты не обнаруживаются, т.е. предлагаемый способ не дает ложноположительных или ложноотрицательных определений. Опыт 5 не является ложноположительным, так как бактериологический анализ дает наличие клостридий и предлагаемый способ фиксирует это, хотя клиническая картина газовой гангрены еще не проявляется. Это свидетельствует о высокой чувствительности предлагаемого способа.
Данные табл.1 по бактериологическим исследованиям свидетельствуют также о специфичности способа в отношении клостридий. 10-оксикислоты обнаруживаются в тканях больных только при наличии клостридий. Присутствие других бактерий: кокков, псевдомонад, энтеробактерий, а также анаэробной неклостридиальной микрофлоры не вызывает образования 10-оксикислот С18:0 и С18:1, т. е. не дает перекрестных ложных определений газовой гангрены. В здоровых тканях 10-оксикислоты отсутствуют - опыт 10 (см. табл.1).
П р и м е р 3. 0,5 г материала ткани морских свинок, инфицированных клостридиями видов перфрингенс, эдематиенс, септикум и гистолитикум, гомогенизировали, высушивали и обрабатывали 2,5 г. HCl в сухом метаноле для экстракции жирных кислот и одновременного образования их метиловых эфиров. Обработку проводили в течение 4 ч при 80оС. Из метанолизатов экстрагировали метиловые эфиры жирных кислот смесью гексана и хлористого метилена в соотношении 2: 1. Для анализа 5-10 мкл экстракта вводили в хроматограф. Анализ проводили на капиллярной колонке с метилсиликоновой фазой типа 0-1 при программировании температуры со скоростью 5-8 град/мин в интервале температур 100-300оС. Одновременно сухие пробы метиловых эфиров жирных кислот силилировали как в примере 1 и анализировали оксикислоты С18 методом масс-фрагментографии на хроматомасс-спектрометре для определения малых концентраций этих кислот, присущих опытам на животных. Заболевание определяли при хроматографическом анализе по наличию пиков 10-оксистеариновой и 10-оксиоктадеценовой кислот на хроматограмме, получаемой с помощью плазменно-ионизационного детектора, а при масс-фрагментографии - по наличию ионов, специфичных для метилтриметилилильных производных 10-оксикислот С18 при соответствующих им временам хроматографического удерживания. Одновременно проводили селективное детектирование гептадекановой кислоты по молекулярному иону ее метилового эфира и определение количественных характеристик содержания оксикислот. Результаты опытов с двумя сериями инфицированных и контрольных животных приведены в табл.2.
Из данных табл. 2 следует, во-первых, что оксикислоты обнаруживаются достаточно надежно, так как их количество соизмеримо или больше количества гептадекановой кислоты, а она всегда хорошо видна на хроматограмме тканевых жирных кислот. Во-вторых, маркер интенсивен по величине, поскольку она превышает минимально детектируемое значение по 10-оксистеариновой кислоте в 5-300 раз.
П р и м е р 4. (по известному способу). 1 г материала от больных с анаэробной инфекцией гомогенизировали, добавляли 1 мл физиологического раствора, центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин. рН супернатанта доводили 50% -ной серной кислотой до 2,0. Проводили экстракцию эфиром два раза по 1 мл. Полученный экстракт в количестве 2-5 мкл вводили в хроматограф и определяли количество масляной и пропионовой кислот в качестве теста на присутствие летучих кислых метаболитов клостридий (по прототипу). Из 36 обследованных больных у пяти клинически и бактериологически определена газовая гангрена. Для них получено соотношение пропионовой кислоты к масляной, равное 3:10, а для больных с неклостридиальной формой анаэробной инфекции - 4:10. Как видно, специфичность этого признака невелика. Если разница и выходит за пределы погрешности измерений, но при единичном анализе такая диагностика ненадежна (неспецифична) и может быть использована лишь как дополнительный признак в суммарной клинической диагностике или для подтверждения бактериологического анализа после подращивания выделенной культуры клостридий и анализа кислых метаболитов среды, в которой оно производилось.
Данные анализа по прототипу, приведенные в табл.1 и примере 4, показывают, что этот способ не дает однозначного диагноза. Признаки газовой гангрены по прототипу - уксусная, масляная и пропионовая кислоты, присутствуют и при других видах анаэробной инфекции. Это означает, что известный способ может быть использован как предварительный тест на возможное наличие клостридий, а для окончательного диагноза необходимо подтверждение другими данными. Заявляемый способ специфичен для клостридий и не дает перекрестных определений с другими видами возбудителей, присутствующих в раневой инфекции.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет осуществлять специфическую диагностику газовой гангрены на фоне неклостридиальной аэробной и анаэробной микрофлоры. Кроме того, в отличие от известных способов диагностики, хроматографический способ определения анаэробной газовой инфекции не требует для выполнения специфического биологического тестового материала: ферментов, сывороток, питательных сред, экспериментальных животных и т.п. Аппаратура и используемые реактивы универсальны, т.е. общеупотребимы в хроматографическом анализе.
Claims (1)
- СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АНАЭРОБНОЙ ГАЗОВОЙ ИНФЕКЦИИ, включающий хроматографический анализ экстрактов культуральных сред клостридий, выделенных из тканей больных, отличающийся тем, что , с целью повышения точности и специфичности способа, берут ткань из очага поражения, готовят гомогенат ткани, в котором определяют высшие жирные кислоты, и по наличию 10-оксистеариновой или одновременно 10-оксистеариновой и 10-оксиолеиновой кислот диагностируют газовую гангрену.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU4939222 RU2021608C1 (ru) | 1991-05-27 | 1991-05-27 | Способ диагностики анаэробной газовой инфекции |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU4939222 RU2021608C1 (ru) | 1991-05-27 | 1991-05-27 | Способ диагностики анаэробной газовой инфекции |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2021608C1 true RU2021608C1 (ru) | 1994-10-15 |
Family
ID=21576080
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU4939222 RU2021608C1 (ru) | 1991-05-27 | 1991-05-27 | Способ диагностики анаэробной газовой инфекции |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2021608C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2768491C1 (ru) * | 2021-06-16 | 2022-03-24 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ диагностики вируса папилломы человека по концентрации молекулярных маркеров |
-
1991
- 1991-05-27 RU SU4939222 patent/RU2021608C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1985, N 10, с.22-25. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2768491C1 (ru) * | 2021-06-16 | 2022-03-24 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ диагностики вируса папилломы человека по концентрации молекулярных маркеров |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Gorbach et al. | Rapid diagnosis of anaerobic infections by direct gas-liquid chromatography of clinical speciments. | |
Fair et al. | Prostatic antibacterial factor identity and significance | |
Phillips et al. | Rapid diagnosis of anaerobic infections by gas-liquid chromatography of clinical material. | |
Byun et al. | Wound‐State Monitoring for Burn Patients Using E‐Nose/SPME System | |
US4349626A (en) | Method of detecting Pseudomonas aeruginosa infections utilizing selected ketone and/or sulfur metabolites | |
Deacon et al. | Gas-liquid chromatographic analysis of metabolic products in the identification of Bacteroidaceae of clinical interest | |
Larsson et al. | Diagnosis of pulmonary tuberculosis by selected-ion monitoring: improved analysis of tuberculostearate in sputum using negative-ion mass spectrometry | |
CN111929391A (zh) | 用于准确测定人血清中维生素a和e浓度的试剂盒及检测方法 | |
Alexander et al. | Urinary ethanol and diabetes mellitus | |
CN101131362A (zh) | 一种快速筛选牛奶类液体样中抗菌药物残留的方法 | |
RU2021608C1 (ru) | Способ диагностики анаэробной газовой инфекции | |
Brooks et al. | Studies of stools from pseudomembranous colitis, rotaviral, and other diarrheal syndromes by frequency-pulsed electron capture gas-liquid chromatography | |
Edman et al. | Gas—liquid chromatography—frequency pulse-modulated electron-capture detection in the diagnosis of infectious diseases | |
Canonica et al. | Gas-liquid chromatographic analysis of fatty acid methyl esters of Aeromonas hydrophila, Aeromonas sobria, and Aeromonas caviae | |
Ziegler et al. | Hippurate hydrolysis as a taxonomic criterion in the genus Streptomyces (order Actinomycetales) | |
Brook et al. | Abnormalities in synovial fluid of patients with septic arthritis detected by gas-liquid chromatography. | |
Reig et al. | Gas-liquid chromatography in routine processing of blood cultures for detecting anaerobic bacteraemia. | |
US20230030753A1 (en) | Method for detecting short-chain fatty acids in biological sample | |
RU2146368C1 (ru) | Способ выявления возбудителя инфекционного процесса в стерильных биологических средах макроорганизма | |
Murray et al. | Presence of N-acyl and acetoxy derivatives of putrescine and cadaverine in the human gut. | |
Tsai et al. | Simple continuous and simultaneous determination of tetracycline residues | |
RU2093581C1 (ru) | Способ определения чистоты биомассы микобактерий | |
RU2042134C1 (ru) | Способ идентификации микобактерий м. tuberculosis и м. bovis | |
Brooks et al. | Rapid differentiation of enterotoxigenic Escherichia coli that produce heat-stable and heat-labile toxins by frequency-pulsed electron capture gas-liquid chromatography analysis of diarrheal stool specimens | |
RU2117295C1 (ru) | Способ диагностики септических состояний |