RU2021371C1 - Method of ligninolytic enzymes preparing - Google Patents
Method of ligninolytic enzymes preparing Download PDFInfo
- Publication number
- RU2021371C1 RU2021371C1 SU5055933A RU2021371C1 RU 2021371 C1 RU2021371 C1 RU 2021371C1 SU 5055933 A SU5055933 A SU 5055933A RU 2021371 C1 RU2021371 C1 RU 2021371C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- enzymes
- mnp
- medium
- cultivation
- carried out
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности. The invention relates to biotechnology and can be used in the microbiological industry.
Лигнинолитические ферменты могут найти применение в технологии производства бумаги для осветления бумажной пульпы; для получения ценного сырья (например, ванилина, метанола) из промышленных отходов (например, лигносульфонатов); для предобработки отходов сельского хозяйства (солома, различные жомы и т.п.) при производстве кормов; для очистки сточных вод целлюлозно-бумажной и деревообрабатывающей промышленности; для детоксикации устойчивых ксенобиотиков; при приготовлении компостов для выращивания съедобных грибов; в научной работе - как сильные окислители, как маркеры в конъюгатах с антителами. Ligninolytic enzymes can be used in paper technology to lighten paper pulp; to obtain valuable raw materials (for example, vanillin, methanol) from industrial waste (for example, lignosulfonates); for the pretreatment of agricultural waste (straw, various pulp, etc.) in the production of feed; for wastewater treatment of the pulp and paper and woodworking industries; for the detoxification of resistant xenobiotics; in the preparation of composts for growing edible mushrooms; in scientific work - as strong oxidizing agents, as markers in conjugates with antibodies.
К лигнинолитическим ферментам относятся: лигнин-пероксидаза (диарилпропаноксигеназа, лигниназа) (LiP), Mn-зависимая пероксидаза обычного типа (Mn-зависимая пероксидаза с функциями ключевого фермента комплекса (MnP-б), лакказа (полифенолоксидаза) (L), другие оксидазы типа лакказы (Ох). В зависимости от свойств и функций в составе ферментных комплексов среди лигнинолитических ферментов выделяют "ключевые" ферменты, инициирующие деполимеризацию лигнина за счет способности расщеплять широкий спектр лигниновых связей как фенольной, так и нефенольной природы (LiP, MnPб); а также вспомогательные ферменты, способные лишь к частичной деполимеризации лигнина и расщеплению только фенольных подструктур лигнина, составляющих не более 20-40% от общего количества лигниновых связей (MnP-а, L, Ох). Ligninolytic enzymes include: lignin peroxidase (diarylpropanoxygenase, ligninase) (LiP), Mn-dependent peroxidase of the usual type (Mn-dependent peroxidase with the functions of a key enzyme complex (MnP-b), laccase (polyphenol oxidase) (L), other oxides laccases (Ox.) Depending on the properties and functions of the enzyme complexes, among the ligninolytic enzymes, “key” enzymes are identified that initiate lignin depolymerization due to the ability to cleave a wide range of lignin bonds, both phenolic and nephenol minutes nature (LiP, MnPb); as well as auxiliary enzymes capable of only partial depolymerization of lignin and splitting only phenolic lignin substructures constituting no more than 20-40% of the lignin bonds (MnP-a, L, Ox).
Лигнинолитические ферменты продуцируются в виде ферментных комплексов, состав и свойства которых зависят от вида продуцента. Известны четыре типа таких комплексов: 1 - продуцент Phanerochaete chrysosporium, состав: LiP, MnP-а; 2 - продуцент Сoriolus versicolor, состав: LiP, MnP-а, L; 3 - продуцент Phlebia radiata, состав LiP, MnP-а, Ох; 4 - продуцент Panus tigrinus, состав: MnP-б, Ох. Ligninolytic enzymes are produced in the form of enzyme complexes, the composition and properties of which depend on the type of producer. Four types of such complexes are known: 1 — producer of Phanerochaete chrysosporium, composition: LiP, MnP-a; 2 - producer Coriolus versicolor, composition: LiP, MnP-a, L; 3 - producer Phlebia radiata, composition LiP, MnP-a, Oh; 4 - producer of Panus tigrinus, composition: MnP-b, Oh.
Сравнительно недавно обнаруженные MnP-б и Ох обладают более широкими лигнинолитическими возможностями, чем их "классические " аналоги (соответственно, LiP и L): так, MnP-б, кроме реакций, характерных для LiP, катализирует еще и расщепление С-бета-C-4 cвязи лигнина, а Ох, в отличие от типичных лакказ, окисляет не только фенольные, но и нефенольные подструктуры лигнина,что делает эти ферменты более перспективными для практического использования по сравнению с другими указанными выше ферментами как в виде отдельных ферментов, так и в виде препаратов, содержащих оба фермента. The relatively recently discovered MnP-b and Ox have wider ligninolytic capabilities than their "classical" analogues (LiP and L, respectively): for example, MnP-b, in addition to the reactions characteristic of LiP, also catalyzes the cleavage of C-beta-C -4 bonds of lignin, and Ox, in contrast to typical laccases, oxidizes not only phenolic but also non-phenolic substructures of lignin, which makes these enzymes more promising for practical use in comparison with the other enzymes indicated above, both in the form of separate enzymes and in form of drugs, soda holding both enzymes.
Описан способ получения лигнинолитических ферментов, MnP-б и Ох грибов P.tigrinus 8/18, c использованием твердофазной ферментации лигноцеллюлозных материалов. Способ заключается в том, что в ферментационный сосуд (колбу) емкостью 0,75 л вносят пшеничную солому или древесные опилки, которые смачивают водопроводной водой, стерилизуют и засевают гомогенизированным мицелием гриба-продуцента Panus tigrinus 8/18. На 4-6-е сутки культивирования - по достижении максимальной активности внеклеточных лигнинолитических ферментов - солому или опилки, ферментированные грибом, смачивают водой или ацетатным буфером, отжимают и получают грубый ферментный препарат, содержащий MnP-б и Ох. Содержание ферментов в полученном грубом ферментном препарате составляет: MnP-б - 1,5 Ед/мл, общий съем составляет 183 Ед; Ох - 0,25 Ед/мл, общий съем 30 Ед. При добавлении к соломе перед началом культивирования гриба специфического индуктора - 3-метилбензилового спирта (2 мМ) получают препарат с активностью MnP-б 2. 6 Ед/мл, общий съем составляет 312 Ед, сведения о содержании Ох не приводятся. A method for producing ligninolytic enzymes, MnP-b and Ox of P. tigrinus 8/18 fungi is described using solid-phase fermentation of lignocellulosic materials. The method consists in adding wheat straw or sawdust to a fermentation vessel (flask) with a capacity of 0.75 L, which is moistened with tap water, sterilized and inoculated with homogenized mycelium of the producer mushroom Panus tigrinus 8/18. On the 4-6th day of cultivation — upon reaching the maximum activity of extracellular ligninolytic enzymes — straw or sawdust fermented with the fungus is moistened with water or acetate buffer, squeezed and a crude enzyme preparation containing MnP-b and Ox is obtained. The content of enzymes in the obtained crude enzyme preparation is: MnP-b - 1.5 U / ml, the total removal is 183 Units; Oh - 0.25 U / ml, total eat 30 U When a specific inducer, 3-methylbenzyl alcohol (2 mM), is added to the straw before the cultivation of the fungus, a preparation with MnP-b activity of 2. 6 U / ml is obtained, the total removal is 312 U, information on the Oh content is not given.
Основным недостатком способа является высокое содержание трудноудалимого водорастворимого лигнина в грубых ферментных препаратах, что сильно осложняет выделение лигнинолитических ферментов. The main disadvantage of this method is the high content of hard-to-remove water-soluble lignin in crude enzyme preparations, which greatly complicates the isolation of ligninolytic enzymes.
Наиболее близким к предлагаемому способу по совокупности существенных признаков является способ получения лигнинолитических ферментов, в частности MnP-б, предусматривающий погруженное периодическое культивирование гриба белой гнили Р. tigrinus 8/18 c использованием специфических индукторов. Согласно этому способу культуру-продуцент - гриб белой гнили P.tigrinus 8/18 выращивают в течение 4-5 сут при 29oC на минеральной среде, лимитированной по азоту, содержащей 1% глюкозу в качестве источника углерода. Среда забуферена диметилсукцинатом Na, рН 4,5.Closest to the proposed method for the combination of essential features is a method for producing ligninolytic enzymes, in particular MnP-b, involving submerged batch cultivation of white rot fungus P. tigrinus 8/18 using specific inducers. According to this method, P. tigrinus 8/18, a producer of white rot fungus, is grown for 4-5 days at 29 ° C on a mineral medium limited in nitrogen containing 1% glucose as a carbon source. The medium is buffered with dimethyl succinate Na, pH 4.5.
При внесении посевного материала в среду добавляют метилбензиловый спирт до 2 мМ концентрации в качестве специфического индуктора MnP-б P.tigrinus 8/18. Культивирование проводят в 250 мл конических колбах, содержащих 20 мл среды, в стационарных условиях. Начиная с 3 сут культивирование проводили с регулярной продувкой кислородом в герметически укупоренных колбах. В этих условиях, начиная с 2-3 cут культивирования проявляется и к 4-5 сут достигает максимума активность MnP-б. Максимальное содержание MnP-б в культуральной жидкости составляет 2,2 Ед/мл, общий съем 44,0 Ед. Активность оксидазы в указанных условиях отсутствует. When the seed is introduced into the medium, methylbenzyl alcohol is added to a concentration of 2 mM as a specific inducer of MnP-b P.tigrinus 8/18. Cultivation is carried out in 250 ml of conical flasks containing 20 ml of medium under stationary conditions. Starting from day 3, cultivation was carried out with regular purging with oxygen in hermetically sealed flasks. Under these conditions, starting from 2-3 days of cultivation, MnP-b activity is manifested and reaches a maximum of 4-5 days. The maximum content of MnP-b in the culture fluid is 2.2 U / ml, the total eat 44.0 Units. There is no oxidase activity under these conditions.
Основными недостатками данного способа являются невысокое содержание MnP-б в культуральной жидкости и низкий съем продукта в силу того, что объем культуральной среды вследствие особенностей метода не может превышать 8% от объема культивационного сосуда. Кроме того, в культуральной жидкости отсутствует Ох. The main disadvantages of this method are the low content of MnP-b in the culture fluid and the low removal of the product due to the fact that the volume of the culture medium due to the characteristics of the method cannot exceed 8% of the volume of the cultivation vessel. In addition, Oh. Is absent in the culture fluid.
Способ имеет также другие недостатки: дороговизна буфера; необходимость кислородной атмосферы, что, в свою очередь, требует специальных приспособлений для стерильной продувки ферментационных сосудов кислородом и герметичной укупорки их. The method also has other disadvantages: the high cost of the buffer; the need for an oxygen atmosphere, which, in turn, requires special devices for sterile purging of the fermentation vessels with oxygen and hermetic sealing of them.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка эффективности способа получения лигниносодержащих ферментов MnP-б и Ох, обладающих широким лигнинолитическим действием. The problem to which the invention is directed, is to develop the effectiveness of a method for producing lignin-containing enzymes MnP-b and Ox having a wide ligninolytic effect.
Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в повышении выхода лигнинолитических ферментов за счет увеличения содержания MnP-б в культуральной жидкости, обеспечения условий для одновременного дополнительного биосинтеза оксидазы, увеличения коэффициента заполнения ферментационного сосуда, а также в упрощении процесса по сравнению с прототипом. The technical result that can be obtained by carrying out the invention is to increase the yield of ligninolytic enzymes by increasing the MnP-b content in the culture fluid, providing conditions for simultaneous additional biosynthesis of oxidase, increasing the fill factor of the fermentation vessel, and also simplifying the process compared to prototype.
Сущность способа заключается в том, что гриб белой гнили P.tigrinus 8/18 выращивают в погруженных условиях на синтетической среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора, минеральные соли, тиамин и микроэлементы, в присутствии индуктора, при этом в качестве источника углерода используют мельтозу, в среду дополнительно вносят твин-80 и марганец сернокислый в количестве 60-90 мг/л в пересчете на Mn, а в процессе культивирования осуществляют температурный сдвиг. Процесс получения продукта может осуществляться с использованием мицелия, иммобилизованного на поликапроамидном волокне. The essence of the method lies in the fact that the white rot fungus P.tigrinus 8/18 is grown under submerged conditions on a synthetic medium containing sources of carbon, nitrogen, phosphorus, mineral salts, thiamine and trace elements, in the presence of an inductor, while using a carbon source meltose, tween-80 and manganese sulfate in the amount of 60-90 mg / l in terms of Mn are additionally added to the medium, and a temperature shift is carried out during cultivation. The process of obtaining the product can be carried out using mycelium immobilized on polycaproamide fiber.
Использование в качестве источника углерода мальтозы вместо глюкозы, сернокислого марганца в повышенных концентрациях, внесение твина-80 и осуществление температурного сдвига в процессе культивирования позволяют существенно повысить содержание в культуральной жидкости MnP-б и обеспечить одновременный биосинтез другого, необходимого для эффективного лигнинолитического действия препарата, фермента-оксидазы. The use of maltose instead of glucose, manganese sulfate in elevated concentrations as a carbon source, the introduction of tween-80 and the implementation of a temperature shift during cultivation can significantly increase the content of MnP-b in the culture fluid and provide simultaneous biosynthesis of another enzyme necessary for the effective ligninolytic action of the drug oxidases.
В литературе отсутствуют сведения об использовании мальтозы в способах получения лигининолитических ферментов, в том числе MnP-б и Ох. There is no information in the literature on the use of maltose in methods for producing ligninolytic enzymes, including MnP-b and Ox.
Установлено, что существенное повыше
ние активности MnP-б происходит при исходных концентрациях Mn в среде 60-90 мг/л в пересчете на Mn (табл.1). Концентрация Mn не влияет на содержание в культуральной жидкости оксидазы.Found to be significantly higher
MnP-b activity decreases at initial concentrations of Mn in the medium of 60-90 mg / L in terms of Mn (Table 1). The concentration of Mn does not affect the content of oxidase in the culture fluid.
Представленные концентрации MnSO4 соответствуют концентрациям Mn, определенным с помощью атомно-адсорбционного анализатора Perkin-Еlmer 5100 (CША) (т.е. 60, 71, 90 и 120 мг/л Mn(II) соответствуют 0,302, 0,358, 0,453 и 0,603 г/л cухой соли MnSO4х7Н2O;
Введение в питательную среду твина-80 позволяет также осуществлять эффективную аэрацию и перемешивание, что дает возможность значительно увеличить объем используемой среды (повысить коэффициент заполнения ферментационного сосуда с 8 до 30%) и соответственно повысить общий съем продуктов.The reported MnSO 4 concentrations correspond to Mn concentrations determined using a Perkin-Elmer 5100 atomic absorption analyzer (United States) (i.e. 60, 71, 90 and 120 mg / L Mn (II) correspond to 0.302, 0.358, 0.453 and 0.603 g / l dry salt of MnSO 4 x 7H 2 O;
The introduction of Tween-80 into the nutrient medium also allows efficient aeration and mixing, which makes it possible to significantly increase the volume of the medium used (increase the fill factor of the fermentation vessel from 8 to 30%) and, accordingly, increase the overall removal of products.
Для повышения буферной емкости среды могут быть использованы различные органические кислоты; некоторые из них, например, барбитуровая, мета-фталевая и полиакриловая обеспечивают выход внеклеточных лигнинолитических ферментов P.tigrinus на таком же уровне как диметилсукцинат, использованный в способе-прототипе; такие, как пиромелитовая, орто-фталевая, янтарная, винная - повышают выход ферментов, примерно в 1,5 раза, по сравнению с диметилсукцинатом. Из них тартрат (винная кислота) наиболее доступен, дешев и обеспечивает наиболее стабильные результаты. Various organic acids can be used to increase the buffer capacity of the medium; some of them, for example, barbituric, metaphthalic and polyacrylic, provide extracellular ligninolytic P. tigrinus enzymes at the same level as dimethyl succinate used in the prototype method; such as pyromelitic, orthophthalic, succinic, tartaric - increase the yield of enzymes by about 1.5 times, compared with dimethyl succinate. Of these, tartrate (tartaric acid) is the most affordable, cheapest and provides the most stable results.
Проведение процесса культивирования продуцента в присутствии поликапроамидного волокна позволяет дополнительно увеличить съем продукта. Carrying out the process of cultivation of the producer in the presence of polycaproamide fiber can further increase the removal of the product.
При необходимости ферменты (MnP-б или Ох, или их смеси, не содержащие посторонних белков) могут быть выделены из фильтрата культуральной жидкости, путем его концентрирования (ультрафильтрацией или осаждением белка органическими растворителями или высаливанием), анионообменной хроматографии и гель-фильтрации. Для получения особо чистых ферментов используют дополнительно анионообменную хроматографию с применением хроматографической системы FPLC. If necessary, enzymes (MnP-b or Ox, or mixtures thereof that do not contain extraneous proteins) can be isolated from the filtrate of the culture fluid by concentration (ultrafiltration or precipitation of the protein with organic solvents or salting out), anion exchange chromatography, and gel filtration. To obtain highly pure enzymes, anion exchange chromatography is additionally used using the FPLC chromatographic system.
Указанные ферменты могут использоваться в виде неочищенных ("грубых") ферментных препаратов: непосредственно культуральной жидкости, отфильтрованной от мицелия; в виде концентрата культуральной жидкости, полученного ультрафильтрацией или осаждением белка органическими растворителями или высаливанием. These enzymes can be used in the form of crude ("coarse") enzyme preparations: directly culture fluid filtered from the mycelium; in the form of a culture fluid concentrate obtained by ultrafiltration or precipitation of the protein with organic solvents or salting out.
П р и м е р 1. Выращивают инокулят из фрагмента мицелия Р.tigrinus 8/18 до 7-суточного возраста на соево-глицериновой среде известного состава и гомогенизируют его перемешиванием с фарфоровыми брусами на качалке при 180 об/мин в течение 10 мин; в 750-мл качалочные колбы вносят и стерилизуют 200 мл культуральной среды. PRI me R 1. Grow the inoculum from a fragment of P. tigrinus 8/18 mycelium up to 7 days old on a soya-glycerin medium of known composition and homogenize it by mixing with porcelain beams on a shaker at 180 rpm for 10 min; 200 ml of culture medium are introduced and sterilized into 750 ml rocking flasks.
Среда забуферена 20 мМ Na-тартратным буфером рН 4,2; индуктор - 3-метилбензиловый спирт - вносят в 100 мкл диметилформамида на колбу. The medium is buffered with 20 mM Na-tartrate buffer pH 4.2; the inducer, 3-methylbenzyl alcohol, is added to 100 μl of dimethylformamide per flask.
Вносят в колбы по 2 мл инокулята. Культивируют при 24oC и 180 об/мин первые двое суток. С 3 сут увеличивают температуру до 29oC. Начиная с 3 сут контролируют уровень внеклеточной активности MnPб и Ох.Add 2 ml of inoculum to the flasks. Cultivate at 24 o C and 180 rpm for the first two days. From 3 days, increase the temperature to 29 o C. Starting from 3 days, the level of extracellular activity of MnPb and Ox is monitored.
Активность MnP-б определяют по скорости окисления НАД-Н (модифицированный метод: в реакционную смесь, содержащую 0,05 М лактат-цитратный буфер рН 4,0, 0,1 мМ MnSO4 и 0,1 мМ НАД-Н, вносят ферментный препарат и определяют спектрофотометрически скорость уменьшения поглощения при 340 нм. За одну единицу активности принимают изменение поглощения при 340 нм, вызываемое 1 мл ферментного препарата за 1 мин (все значения активности MnP-б даны в единицах, определенных при использовании высокоочищенного НAД-Н фирмы "Serva" ФРГ; при использовании НАД-Н фирмы "Reanal" ВНР, менее стабильного в водных растворах, абсолютные значения активности MnP-б завышаются: так, в стандартных условиях Кирка максимальная активность MnPб P. tigrinus составляет 0,5 Ед с НАД-Н фирмы "Serva" или 1,44 Ед с НАД-Н фирмы "Reanal" ВНР. The activity of MnP-b is determined by the oxidation rate of NAD-H (modified method: an enzyme preparation is added to the reaction mixture containing 0.05 M lactate-citrate buffer pH 4.0, 0.1 mm MnSO4 and 0.1 mm NAD-N and determine the spectrophotometrically the rate of decrease in absorption at 340 nm.For one unit of activity take the change in absorbance at 340 nm caused by 1 ml of the enzyme preparation in 1 min (all values of MnP-b activity are given in units determined using highly purified NAD-H firm "Serva "Germany; when using NAD-H company" Reanal "Hungary, less stable in aqueous solutions, the absolute values of MnP-b activity are overestimated: for example, under Kirk standard conditions, the maximum activity of P. tigrinus MnPb is 0.5 units with NAD-H from Serva or 1.44 units with NAD-H from Reanal "VNR.
Активность Ох определяют по скорости окисления сирингальдазина (модифицированный метод): в реакционную смесь, содержащую 0,02 М Na-ацетатный буфер рН 5,0 и 0,05 мМ сирингальдазин в этаноле (конечная концентрация этанола 20%), вносят ферментный препарат и определяют спектрофотометрически скорость увеличения поглощения при 525 нм. За одну единицу активности принимают изменение поглощения при 525 нм, вызываемое 1 мл ферментного препарата за 1 мин. Ox activity is determined by the oxidation rate of syringaldazine (modified method): in the reaction mixture containing 0.02 M Na-acetate buffer pH 5.0 and 0.05 mm syringaldazine in ethanol (final ethanol concentration of 20%), the enzyme preparation is added and determined spectrophotometrically the rate of increase in absorption at 525 nm. For one unit of activity, the change in absorbance at 525 nm, caused by 1 ml of the enzyme preparation in 1 min, is taken.
Максимальная активность лигнинолитических ферментов достигается к 10-12 сут культивирования и составляет: MnP-б - 11,5 Ед/мл, общий съем продукта составляет 2300 Ед; Ох - 7 Ед/мл, общий съем продукта - 1400 Ед. The maximum activity of ligninolytic enzymes is achieved by 10-12 days of cultivation and is: MnP-b - 11.5 U / ml, the total removal of the product is 2300 U; Oh - 7 Units / ml, the total removal of the product - 1400 Units.
П р и м е р 2. Способ осуществляют по примеру 1, но культивирование проводят в присутствии поликапроамидного волокна: перед стерилизацией среды в каждую колбу вносят по 4 г поликапроамидного волокна "Вия". PRI me R 2. The method is carried out as in example 1, but the cultivation is carried out in the presence of polycaproamide fiber: before sterilization of the medium in each flask contribute 4 g of polycaproamide fiber "Viya".
Максимальное содержание лигнинолитических ферментов достигается к 10-12 сут культивирования и составляет для MnP-б 18,4 Ед/мл, общим съем MnP-б составляет 3680 Ед.; Ох - 11 Ед/мл, общий съем Ох - 2200 Ед. The maximum content of ligninolytic enzymes is achieved by 10-12 days of cultivation and is 18.4 U / ml for MnP-b, the total consumption of MnP-b is 3680 Units; Oh - 11 Units / ml, total eat Oh - 2200 Units.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет эффективно осуществлять процесс получения лигнинолитических ферментов с широким спектром действия с помощью гриба белой гнили Panus tigrinus 8/18. Thus, the proposed method allows you to effectively carry out the process of obtaining ligninolytic enzymes with a wide spectrum of action using the fungus of white rot Panus tigrinus 8/18.
Использование мальтозы в качестве источника углерода, повышенных концентраций марганца в среде, внесение твина-80 и осуществление температурного сдвига в процессе культивирования позволяют существенно повысить содержание в культуральной жидкости MnP-б и обеспечить одновременный биосинтез оксидазы. Содержание Mn-пероксидазы с функциями ключевого фермента (MnP-б) в культуральной жидкости составляет не менее 18 Ед/мл, что ≈ в 5-7,5 раза больше, чем в способе-прототипе, при увеличении общего съема продукта в 57-84 раза. Кроме того, культуральная жидкость содержит значительные количества оксидазы (Ох), которая в отличие от типичных лакказ окисляет не только фенольные, но и нефенольные подструктуры лигнина ( ≈ 8,0-12,4 Ед/мл или общий съем - 1600-2480 Ед.). The use of maltose as a source of carbon, increased concentrations of manganese in the medium, the introduction of Tween-80 and the implementation of the temperature shift during cultivation can significantly increase the content of MnP-b in the culture fluid and provide simultaneous oxidase biosynthesis. The content of Mn-peroxidase with the functions of the key enzyme (MnP-b) in the culture fluid is at least 18 U / ml, which is 5-7.5 times more than in the prototype method, with an increase in the total removal of the product in 57-84 times. In addition, the culture fluid contains significant amounts of oxidase (Ox), which, in contrast to typical laccases, oxidizes not only phenolic but also non-phenolic substructures of lignin (≈ 8.0-12.4 U / ml or total removal - 1600-2480 Units. )
Внесение в среду культивирования твина-80 также дает возможность значительно увеличить коэффициент заполнения ферментационного сосуда (8% - в способе-прототипе и не менее 30% - в предлагаемом способе). The introduction of tween-80 into the cultivation medium also makes it possible to significantly increase the fill factor of the fermentation vessel (8% in the prototype method and at least 30% in the proposed method).
Кроме того, способ позволяет упростить процесс, так как не требует специальных приспособлений для продувки ферментационных сосудов кислородом, и использовать для повышения буферной емкости среды различные, в том числе, дешевые и доступные вещества. In addition, the method allows to simplify the process, since it does not require special devices for purging the fermentation vessels with oxygen, and use various, including cheap and affordable substances, to increase the buffer capacity of the medium.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU5055933 RU2021371C1 (en) | 1992-07-23 | 1992-07-23 | Method of ligninolytic enzymes preparing |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU5055933 RU2021371C1 (en) | 1992-07-23 | 1992-07-23 | Method of ligninolytic enzymes preparing |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2021371C1 true RU2021371C1 (en) | 1994-10-15 |
Family
ID=21610220
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU5055933 RU2021371C1 (en) | 1992-07-23 | 1992-07-23 | Method of ligninolytic enzymes preparing |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2021371C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10907143B2 (en) | 2014-09-08 | 2021-02-02 | Battelle Memorial Institute | Enzyme formulation and method for degradation |
| RU2770690C1 (en) * | 2021-06-23 | 2022-04-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Уфимский государственный нефтяной технический университет" | Fomes fomentarius vkpm f-1531 strain - producer of phenol oxidase enzymes |
-
1992
- 1992-07-23 RU SU5055933 patent/RU2021371C1/en active
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Леонтьевский А.А. и др. Биохимия, 1990, т.55, вып.10, с.1841-1846. * |
| Леонтьевский А.А. и др. Биохимия, 1991, т.56, вып.9, с.1665-1675. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10907143B2 (en) | 2014-09-08 | 2021-02-02 | Battelle Memorial Institute | Enzyme formulation and method for degradation |
| RU2770690C1 (en) * | 2021-06-23 | 2022-04-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Уфимский государственный нефтяной технический университет" | Fomes fomentarius vkpm f-1531 strain - producer of phenol oxidase enzymes |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Janusz et al. | Increased production of laccase by Cerrena unicolor in submerged liquid cultures | |
| Moldes et al. | Different proportions of laccase isoenzymes produced by submerged cultures of Trametes versicolor grown on lignocellulosic wastes | |
| Guillén et al. | Production of hydrogen peroxide by aryl-alcohol oxidase from the ligninolytic fungus Pleurotus eryngii | |
| Desai et al. | Isolation of laccase producing fungi and partial characterization of laccase | |
| Lankinen et al. | The onset of lignin-modifying enzymes, decrease of AOX and color removal by white-rot fungi grown on bleach plant effluents | |
| Mai et al. | Enhanced stability of laccase in the presence of phenolic compounds | |
| JPH05500899A (en) | Microperoxidase preparations containing heme peptides as active ingredients | |
| US20090311751A1 (en) | Wood-rotting basidiomycetes for production of ligninolytic enzymes | |
| Nishizawa et al. | Purification and characterization of laccase from white rot fungus Trametes sanguinea M85-2 | |
| CN103305430B (en) | Laccase generation cerrena and application thereof | |
| KR100866999B1 (en) | Process for preparing ligninolytic enzyme | |
| Trigiano et al. | Extracellular enzymes of some fungi associated with mushroom culture | |
| RU2021371C1 (en) | Method of ligninolytic enzymes preparing | |
| Perez et al. | Role of organic acid chelators in manganese regulation of lignin degradation by Phanerochaete chrysosporium | |
| Roushdy et al. | Biotechnological approach for lignin peroxidase (lip) production from agricultural wastes (rice husk) by Cunninghamella elegans | |
| CA1339349C (en) | Bacterial extracellular lignin peroxidase | |
| Yoshida et al. | Production and characterization of ligninolytic enzymes of Bjerkandera adusta grown on wood meal/wheat bran culture and production of these enzymes using a rotary-solid fermenter | |
| WO2021193893A1 (en) | Culture medium and method for producing laccase | |
| Ferdeș et al. | Laccase enzyme production and biomass growth in liquid cultures of wood-degrading fungal strains. | |
| US5081027A (en) | Method for producing pulp by treatment using a microorganism, and its related enzymes | |
| JP2021153575A (en) | Culture media and methods of laccase production | |
| Garcés et al. | An alternative, banana peel-based medium used to investigate the catalytic properties of peroxidase from a fungus, Inonotus sp SP2, recently isolated in southern Chile | |
| Pradeep et al. | Production of ligninolytic enzymes for dye decolorization by cocultivation of white-rot fungi Pleurotus ostreatus and Phanerochaete chrysosporium under solid-state fermentation | |
| Ahlawat et al. | Dye decolorization potential of spent substrates from Agaricus bisporus and Pleurotus sp. –a laboratory study | |
| Aruna et al. | Screening, production and partial purification of laccase enzyme from white rot fungi |