Claims (90)
1. Способ выполнения ферментативной реакции с использованием электрофореза, включающий:1. A method for performing an enzymatic reaction using electrophoresis, comprising:
обеспечение системы электрофореза, содержащей:providing an electrophoresis system comprising:
гелевую матрицу для электрофореза, имеющую первый конец и второй конец и длину между первым и вторым концами;an electrophoresis gel matrix having a first end and a second end and a length between the first and second ends;
первый участок вблизи первого конца, содержащий первый кофактор фермента для фермента;a first region near the first end containing a first enzyme cofactor for the enzyme;
второй участок вблизи второго конца и содержащий второй кофактор фермента для указанного фермента, причем второй кофактор фермента имеет электрический заряд, противоположный электрическому заряду первого кофактора фермента;a second region near the second end and containing a second enzyme cofactor for said enzyme, the second enzyme cofactor having an electrical charge opposite to that of the first enzyme cofactor;
реакционный участок между первым участком и вторым участком и содержащий фермент; иa reaction site between the first site and the second site and containing the enzyme; and
пару из положительного и отрицательного электродов, расположенных на первом и втором концах соответственно; иa pair of positive and negative electrodes located at the first and second ends, respectively; and
приложение электрического поля между парой электродов для перемещения первого кофактора фермента из первого участка на реакционный участок и перемещения второго кофактора фермента из второго участка на реакционный участок с образованием активированного ферментного комплекса, содержащего фермент, первый кофактор фермента и второй кофактор фермента.application of an electric field between a pair of electrodes to move the first enzyme cofactor from the first site to the reaction site and move the second enzyme cofactor from the second site to the reaction site to form an activated enzyme complex containing the enzyme, the first enzyme cofactor and the second enzyme cofactor.
2. Способ по п. 1, в котором когда первый кофактор фермента представляет собой ион металла, второй кофактор фермента представляет собой полинуклеотид.2. The method of claim 1, wherein when the first enzyme cofactor is a metal ion, the second enzyme cofactor is a polynucleotide.
3. Способ по п. 1, дополнительно включающий нанесение субстрата для активированного ферментного комплекса на реакционный участок перед стадией (с), причем приложение электрического поля включает в себя реагирование активированного ферментного комплекса с субстратом на реакционном участке с образованием продукта реакции.3. The method of claim 1 further comprising applying a substrate for the activated enzyme complex to the reaction site prior to step (c), wherein applying an electric field comprises reacting the activated enzyme complex with the substrate at the reaction site to form a reaction product.
4. Способ по п. 1, в котором приложение электрического поля включает в себя миграцию непрореагировавших первого и второго кофакторов ферментов из реакционного участка для отделения непрореагировавших первого и второго кофакторов ферментов от продукта реакции на реакционном участке.4. The method of claim 1, wherein the application of an electric field includes migrating unreacted first and second enzyme cofactors from the reaction site to separate the unreacted first and second enzyme cofactors from the reaction product at the reaction site.
5. Способ по п. 1, в котором первый электрод представляет собой положительный электрод, а первый кофактор фермента имеет положительный заряд, при этом второй электрод представляет собой отрицательный электрод, а второй кофактор фермента имеет отрицательный заряд.5. The method of claim 1, wherein the first electrode is a positive electrode and the first enzyme cofactor is positively charged, wherein the second electrode is a negative electrode and the second enzyme cofactor is negatively charged.
6. Способ по п. 3, в котором субстрат представляет собой целевую двухцепочечную нуклеиновую кислоту, причем необязательно целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота представляет собой двухцепочечную ДНК, двухцепочечную РНК или ДНК/РНК гибрид.6. The method of claim 3, wherein the substrate is the target double-stranded nucleic acid, optionally the target double-stranded nucleic acid is double-stranded DNA, double-stranded RNA, or a DNA/RNA hybrid.
7. Способ по п. 1, в котором фермент представляет собой транспозазу, причем необязательно транспозаза представляет собой транспозазу Тn5, и при этом необязательно первый кофактор фермента содержит Mg2+, необязательно в виде Mg(OAc)2 или MgCl2 и необязательно второй кофактор фермента представляет собой адаптор полинуклеотидной транспозазы, содержащий двухцепочечную концевую последовательность транспозона и одноцепочечную область метки.7. The method according to p. 1, in which the enzyme is a transposase, and optionally the transposase is a Tn5 transposase, and optionally the first cofactor of the enzyme contains Mg 2+ , optionally in the form of Mg(OAc) 2 or MgCl 2 and optionally the second cofactor The enzyme is a polynucleotide transposase adapter containing a double-stranded transposon terminal sequence and a single-stranded tag region.
8. Способ получения библиотеки меченых фрагментов нуклеиновых кислот из целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включающий:8. A method for obtaining a library of labeled nucleic acid fragments from a target double-stranded nucleic acid, comprising:
обеспечение системы электрофореза, содержащей:providing an electrophoresis system comprising:
гелевую матрицу для электрофореза, имеющую первый конец и второй конец, ширину и длину между первым и вторым концами;an electrophoresis gel matrix having a first end and a second end, a width and a length between the first and second ends;
первый участок вблизи первого конца, содержащий первый кофактор транспозазы, причем первый кофактор транспозазы представляет собой ион металла;a first region near the first end containing a first transposase cofactor, wherein the first transposase cofactor is a metal ion;
реакционный участок, расположенный на расстоянии от первого конца и содержащий транспосомный комплекс, содержащий транспозазу и адаптор полинуклеотидной транспозазы, содержащий двухцепочечную концевую последовательность транспозона и одноцепочечную область метки; иa reaction site located at a distance from the first end and containing a transposome complex containing a transposase and a polynucleotide transposase adapter containing a double-stranded transposon terminal sequence and a single-stranded tag region; and
пару из положительного и отрицательного электродов, расположенных на первом и втором концах соответственно;a pair of positive and negative electrodes located at the first and second ends, respectively;
нанесение целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты на реакционный участок;applying the target double-stranded nucleic acid to the reaction site;
приложение первого электрического поля между парой электродов для перемещения первого кофактора транспозазы из первого участка на реакционный участок с образованием активированного транспосомного комплекса, содержащего транспозазу, адаптор полинуклеотидной транспозазы и первый кофактор транспозазы; иapplying a first electric field between the pair of electrodes to move the first transposase cofactor from the first site to the reaction site to form an activated transposome complex comprising transposase, a polynucleotide transposase adapter, and a first transposase cofactor; and
инкубирование целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты с активированным транспосомным комплексом на реакционном участке в условиях, достаточных для фрагмента целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, а не множества фрагментов нуклеиновых кислот, и мечение фрагментов нуклеиновых кислот, таким образом создавая библиотеку меченых фрагментов нуклеиновых кислот.incubating the target double-stranded nucleic acid with the activated transposome complex in the reaction site under conditions sufficient for the target double-stranded nucleic acid fragment rather than a plurality of nucleic acid fragments, and labeling the nucleic acid fragments, thereby creating a library of labeled nucleic acid fragments.
9. Способ по п. 8, в котором транспосомный комплекс иммобилизуют на твердой подложке на реакционном участке, необязательно посредством взаимодействия стрептавидин-биотин.9. The method of claim 8, wherein the transposome complex is immobilized on a solid support at the reaction site, optionally via a streptavidin-biotin interaction.
10. Способ по п. 9, включающий высвобождение транспосомного комплекса из твердой подложки после создания меченых фрагментов нуклеиновой кислоты.10. The method of claim 9, comprising releasing the transposome complex from the solid support after generation of labeled nucleic acid fragments.
11. Способ по п. 10, дополнительно включающий изменение величины первого электрического поля после стадии для перемещения меченых фрагментов нуклеиновой кислоты, связанных с транспосомным комплексом, высвобожденным из твердой подложки на участке для сбора.11. The method of claim 10, further comprising changing the magnitude of the first electric field after the step to move labeled nucleic acid fragments associated with the transposome complex released from the solid support at the collection site.
12. Способ получения библиотеки меченых фрагментов нуклеиновых кислот из целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включающий:12. A method for obtaining a library of labeled nucleic acid fragments from a target double-stranded nucleic acid, comprising:
обеспечение системы электрофореза, содержащей:providing an electrophoresis system comprising:
гелевую матрицу для электрофореза, имеющую первый конец и второй конец, ширину и длину между первым и вторым концами;an electrophoresis gel matrix having a first end and a second end, a width and a length between the first and second ends;
первый участок вблизи первого конца, содержащий первый кофактор транспозазы для транспозазы, причем первый кофактор транспозазы представляет собой ион металла;a first region near the first end containing a first transposase cofactor for transposase, wherein the first transposase cofactor is a metal ion;
второй участок вблизи второго конца и содержащий второй кофактор транспозазы для транспозазы, причем второй кофактор транспозазы имеет электрический заряд, противоположный электрическому заряду первого кофактора транспозазы, при этом второй кофактор транспозазы представляет собой адаптор полинуклеотидной транспозазы, содержащий двухцепочечную концевую последовательность транспозона и одноцепочечную область метки;a second region near the second end and containing a second transposase cofactor for transposase, wherein the second transposase cofactor has an electrical charge opposite to that of the first transposase cofactor, wherein the second transposase cofactor is a polynucleotide transposase adapter comprising a transposon double-stranded terminal sequence and a single-stranded tag region;
реакционный участок между первым участком и вторым участком и содержащий транспозазу; иa reactive site between the first site and the second site and containing a transposase; and
пару из положительного и отрицательного электродов, расположенных на первом и втором концах соответственно;a pair of positive and negative electrodes located at the first and second ends, respectively;
нанесение целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты на реакционный участок;applying the target double-stranded nucleic acid to the reaction site;
приложение первого электрического поля между парой электродов для перемещения первого кофактора транспозазы из первого участка на реакционный участок и перемещения второго кофактора транспозазы из второго участка на реакционный участок с образованием активированного транспосомного комплекса, содержащего транспозазу, первый кофактор транспозазы и второй кофактор транспозазы; иapplying a first electric field between a pair of electrodes to move the first transposase cofactor from the first site to the reactive site and move the second transposase cofactor from the second site to the reactive site to form an activated transposomal complex comprising transposase, the first transposase cofactor, and the second transposase cofactor; and
инкубирование целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты с активированным транспосомным комплексом на реакционном участке в условиях, достаточных для фрагмента целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, а не множества фрагментов нуклеиновых кислот, и мечение фрагментов нуклеиновых кислот, таким образом создавая библиотеку меченых фрагментов нуклеиновых кислот.incubating the target double-stranded nucleic acid with the activated transposome complex in the reaction site under conditions sufficient for the target double-stranded nucleic acid fragment rather than a plurality of nucleic acid fragments, and labeling the nucleic acid fragments, thereby creating a library of labeled nucleic acid fragments.
13. Способ по п. 12, в котором одноцепочечная область метки содержит одно или более из: праймерной последовательности, штрихкодовой последовательности, последовательности уникального молекулярного идентификатора (UMI), метки амплификации, метки обогащения или метки очистки.13. The method of claim 12, wherein the single strand region of the tag contains one or more of: a primer sequence, a barcode sequence, a unique molecular identifier (UMI) sequence, an amplification tag, an enrichment tag, or a purification tag.
14. Способ по п. 12, в котором транспозазу иммобилизуют на твердой подложке на реакционном участке, причем реакционный участок необязательно содержит лунку, при этом твердая подложка представляет собой гранулированную частицу или поверхность лунки.14. The method of claim 12, wherein the transposase is immobilized on a solid support at a reaction site, the reaction site optionally containing a well, wherein the solid support is a granular particle or well surface.
15. Способ по п. 12, в котором величину первого электрического поля, приложенного на стадии (c), устанавливают таким образом, чтобы целевая двухцепочечная нуклеиновая кислота по существу не имела электрофоретической подвижности в пределах матрицы для электрофореза.15. The method of claim 12, wherein the magnitude of the first electric field applied in step (c) is set such that the target double-stranded nucleic acid has substantially no electrophoretic mobility within the electrophoresis template.
16. Способ по п. 12, в котором система электрофореза содержит участок для сбора вдоль длины между первым участком и реакционным участком.16. The method of claim 12 wherein the electrophoresis system comprises a lengthwise collection site between the first site and the reaction site.
17. Способ по п. 16, в котором приложение первого электрического поля на стадии (c) включает в себя перемещение меченых фрагментов нуклеиновых кислот на участок для сбора.17. The method of claim 16, wherein the application of the first electric field in step (c) comprises moving labeled nucleic acid fragments to a collection site.
18. Способ по п. 12, включающий изменение величины или направления первого электрического поля через гелевую матрицу для электрофореза.18. The method of claim. 12, including changing the magnitude or direction of the first electric field through the gel matrix for electrophoresis.
19. Способ по п. 12, в котором система электрофореза содержит дополнительные участки вдоль ширины и длины, каждый из которых содержит различные реагенты для тагментации, и вторую пару из положительного и отрицательного электродов на противоположных сторонах ширины на одном из: первого конца или второго конца.19. The method according to claim 12, in which the electrophoresis system contains additional sections along the width and length, each of which contains different reagents for tagging, and a second pair of positive and negative electrodes on opposite sides of the width at one of: the first end or the second end .
20. Способ по п. 19, включающий приложение второго электрического поля между второй парой электродов, причем направление второго электрического поля перпендикулярно направлению первого электрического поля, приложенного на стадии (с).20. The method of claim 19, comprising applying a second electric field between the second pair of electrodes, wherein the direction of the second electric field is perpendicular to the direction of the first electric field applied in step (c).
21. Способ получения библиотеки меченых фрагментов нуклеиновых кислот из целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включающий:21. A method for obtaining a library of labeled nucleic acid fragments from a target double-stranded nucleic acid, comprising:
обеспечение системы электрофореза, содержащей:providing an electrophoresis system comprising:
гелевую матрицу для электрофореза, имеющую первый конец и второй конец, ширину и длину между первым и вторым концами;an electrophoresis gel matrix having a first end and a second end, a width and a length between the first and second ends;
первый участок, содержащий первый кофактор транспозазы для транспозазы, причем первый кофактор транспозазы представляет собой ион металла;a first region containing a first transposase cofactor for transposase, wherein the first transposase cofactor is a metal ion;
второй участок, содержащий второй кофактор транспозазы для транспозазы, причем второй кофактор транспозазы имеет электрический заряд, противоположный электрическому заряду первого кофактора транспозазы, при этом второй кофактор транспозазы представляет собой адаптор полинуклеотидной транспозазы, содержащий двухцепочечную концевую последовательность транспозона и одноцепочечную область метки;a second region containing a second transposase cofactor for transposase, wherein the second transposase cofactor has an electrical charge opposite to that of the first transposase cofactor, wherein the second transposase cofactor is a polynucleotide transposase adapter comprising a transposon double-stranded terminal sequence and a single-stranded tag region;
третий участок, содержащий лизирующий реагент;a third site containing a lysing reagent;
четвертый участок, содержащий транспозазу;a fourth site containing transposase;
реакционный участок между первым участком и вторым участком; иa reaction site between the first site and the second site; and
первую пару из положительного и отрицательного электродов, расположенных на первом и втором концах соответственно; иa first pair of positive and negative electrodes located at the first and second ends, respectively; and
вторую пару из положительного и отрицательного электродов, расположенных на противоположных сторонах ширины на одном из: первого конца или второго конца;a second pair of positive and negative electrodes located on opposite sides of the width at one of: the first end or the second end;
нанесение цельных клеток, содержащих целевую двухцепочечную нуклеиновую кислоту, на реакционный участок;applying whole cells containing the target double-stranded nucleic acid to the reaction site;
приложение первого электрического поля для перемещения лизирующего агента на реакционный участок и/или через него для лизиса клеток, таким образом нанося целевую двухцепочечную нуклеиновую кислоту на участок для образца;applying a first electric field to move a lysing agent into and/or through the reaction site to lyse the cells, thereby applying the target double-stranded nucleic acid to the sample site;
приложение второго электрического поля для перемещения первого кофактора транспозазы из первого участка на реакционный участок, перемещения второго кофактора транспозазы из второго участка на реакционный участок и/или перемещения транспозазы из участка транспозазы на реакционный участок с образованием активированного транспосомного комплекса, содержащего транспозазу, первый кофактор транспозазы и второй кофактор транспозазы; иapplying a second electric field to move the first transposase cofactor from the first site to the reactive site, move the second transposase cofactor from the second site to the reactive site, and/or move the transposase from the transposase site to the reactive site to form an activated transposomal complex containing the transposase, the first transposase cofactor, and a second transposase cofactor; and
инкубирование целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты с активированным транспосомным комплексом на реакционном участке в условиях, достаточных для фрагмента целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, а не множества фрагментов нуклеиновых кислот, и мечение фрагментов нуклеиновых кислот, таким образом создавая библиотеку меченых фрагментов нуклеиновых кислот.incubating the target double-stranded nucleic acid with the activated transposome complex in the reaction site under conditions sufficient for the target double-stranded nucleic acid fragment rather than a plurality of nucleic acid fragments, and labeling the nucleic acid fragments, thereby creating a library of labeled nucleic acid fragments.
22. Способ по п. 21, в котором первое электрическое поле и второе электрическое поле отличаются, а стадию (с) выполняют перед стадией (d); или22. The method according to p. 21, in which the first electric field and the second electric field are different, and step (c) is performed before step (d); or
в котором первое электрическое поле и второе электрическое поле являются одинаковыми, а стадию (с) выполняют одновременно со стадией (d).wherein the first electric field and the second electric field are the same, and step (c) is performed simultaneously with step (d).
23. Устройство электрофореза, содержащее:23. An electrophoresis device, comprising:
гелевую матрицу для электрофореза, имеющую первый конец, второй конец и длину между первым и вторым концами;an electrophoresis gel matrix having a first end, a second end, and a length between the first and second ends;
первый участок вблизи первого конца, содержащий первый кофактор фермента для фермента;a first region near the first end containing a first enzyme cofactor for the enzyme;
второй участок вблизи второго конца и содержащий второй кофактор фермента для указанного фермента, причем второй кофактор фермента имеет электрический заряд, противоположный электрическому заряду первого кофактора фермента;a second region near the second end and containing a second enzyme cofactor for said enzyme, the second enzyme cofactor having an electrical charge opposite to that of the first enzyme cofactor;
реакционный участок между первым участком и вторым участком и содержащий фермент; иa reaction site between the first site and the second site and containing the enzyme; and
пару из положительного и отрицательного электродов, расположенных на первом и втором концах соответственно.a pair of positive and negative electrodes located at the first and second ends, respectively.
24. Устройство электрофореза, содержащее:24. An electrophoresis device, comprising:
гелевую матрицу для электрофореза, имеющую первый конец и второй конец, ширину и длину между первым и вторым концами;an electrophoresis gel matrix having a first end and a second end, a width and a length between the first and second ends;
первый участок вблизи первого конца, содержащий первый кофактор транспозазы, причем первый кофактор транспозазы представляет собой ион металла;a first region near the first end containing a first transposase cofactor, wherein the first transposase cofactor is a metal ion;
реакционный участок, расположенный на расстоянии от первого конца и содержащий транспосомный комплекс, содержащий транспозазу и адаптор полинуклеотидной транспозазы, содержащий двухцепочечную концевую последовательность транспозона и одноцепочечную область метки; иa reaction site located at a distance from the first end and containing a transposome complex containing a transposase and a polynucleotide transposase adapter containing a double-stranded transposon terminal sequence and a single-stranded tag region; and
пару из положительного и отрицательного электродов, расположенных на первом и втором концах соответственно.a pair of positive and negative electrodes located at the first and second ends, respectively.
25. Устройство электрофореза, содержащее:25. An electrophoresis device, comprising:
гелевую матрицу для электрофореза, имеющую первый конец, второй конец и длину между первым и вторым концами;an electrophoresis gel matrix having a first end, a second end, and a length between the first and second ends;
первый участок вблизи первого конца, содержащий первый кофактор транспозазы для транспозазы, причем первый кофактор транспозазы представляет собой ион металла;a first region near the first end containing a first transposase cofactor for transposase, wherein the first transposase cofactor is a metal ion;
второй участок вблизи второго конца и содержащий второй кофактор транспозазы для транспозазы, причем второй кофактор транспозазы имеет электрический заряд, противоположный электрическому заряду первого кофактора транспозазы, при этом второй кофактор транспозазы представляет собой адаптор полинуклеотидной транспозазы, содержащий двухцепочечную концевую последовательность транспозона и одноцепочечную область метки;a second region near the second end and containing a second transposase cofactor for transposase, wherein the second transposase cofactor has an electrical charge opposite to that of the first transposase cofactor, wherein the second transposase cofactor is a polynucleotide transposase adapter comprising a transposon double-stranded terminal sequence and a single-stranded tag region;
реакционный участок между первым концом и вторым концом и содержащий транспозазу; иa reactive site between the first end and the second end and containing a transposase; and
пару из положительного и отрицательного электродов, расположенных на первом и втором концах соответственно.a pair of positive and negative electrodes located at the first and second ends, respectively.
26. Устройство электрофореза, содержащее:26. An electrophoresis device, comprising:
гелевую матрицу для электрофореза, имеющую первый конец и второй конец, ширину и длину между первым и вторым концами;an electrophoresis gel matrix having a first end and a second end, a width and a length between the first and second ends;
первый участок вблизи первого конца, содержащий первый кофактор транспозазы для транспозазы, причем первый кофактор транспозазы представляет собой ион металла;a first region near the first end containing a first transposase cofactor for transposase, wherein the first transposase cofactor is a metal ion;
второй участок вблизи второго конца и содержащий второй кофактор транспозазы для транспозазы, причем второй кофактор транспозазы имеет электрический заряд, противоположный электрическому заряду первого кофактора транспозазы, при этом второй кофактор транспозазы представляет собой адаптор полинуклеотидной транспозазы, содержащий двухцепочечную концевую последовательность транспозона и одноцепочечную область метки;a second region near the second end and containing a second transposase cofactor for transposase, wherein the second transposase cofactor has an electrical charge opposite to that of the first transposase cofactor, wherein the second transposase cofactor is a polynucleotide transposase adapter comprising a transposon double-stranded terminal sequence and a single-stranded tag region;
третий участок, содержащий лизирующий реагент;a third site containing a lysing reagent;
четвертый участок, содержащий транспозазу;a fourth site containing transposase;
реакционный участок между первым концом и вторым концом; иa reaction site between the first end and the second end; and
первую пару из положительного и отрицательного электродов, расположенных на первом и втором концах соответственно; иa first pair of positive and negative electrodes located at the first and second ends, respectively; and
вторую пару из положительного и отрицательного электродов, расположенных на противоположных сторонах ширины на одном из: первого конца или второго конца.a second pair of positive and negative electrodes located on opposite sides of the width at one of: the first end or the second end.
27. Система для получения библиотеки меченных фрагментов нуклеиновых кислот из целевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащая:27. A system for obtaining a library of labeled nucleic acid fragments from a target double-stranded nucleic acid, containing:
устройство по любому одному из пп. 23-26;device according to any one of paragraphs. 23-26;
источник питания;power supply;
контроллер, выполненный с возможностью управления направлением и/или величиной первого и второго электрических полей для перемещения реагентов и/или меченых фрагментов нуклеиновых кислот на реакционный участок, участок для сбора и/или приемные участки, и/или через них.a controller configured to control the direction and/or magnitude of the first and second electric fields to move reagents and/or labeled nucleic acid fragments to and/or through the reaction site, collection site and/or receiving sites.