Claims (39)
1. Средство для RNAi, содержащее первую нить и вторую нить, где1. An RNAi tool containing a first strand and a second strand, where
первая нить и вторая нить образуют дуплекс;the first thread and the second thread form a duplex;
первая нить содержит направляющую область, где направляющая область содержит нуклеиновую кислоту, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью с последовательностью 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3' (SEQ ID NO:24) или по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью с последовательностью 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3' (SEQ ID NO:8); иthe first strand contains a guide region, where the guide region contains a nucleic acid characterized by at least about 90% identity with the sequence 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3' (SEQ ID NO:24) or at least about 90% identity with the sequence 5'- UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3' (SEQ ID NO:8); and
вторая нить содержит область, не являющуюся направляющей; где необязательноthe second thread contains an area that is not a guide; where optional
направляющая область содержит последовательность нуклеиновой кислоты 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3' (SEQ ID NO:24), и область, не являющаяся направляющей, содержит последовательность нуклеиновой кислоты 5'- GGCUGAGAACCAAAGAGUA-3' (SEQ ID NO:53).the guide region contains the nucleic acid sequence 5'-UGCUCUUUGGUCUUCUCAGCC-3' (SEQ ID NO:24), and the non-guide region contains the nucleic acid sequence 5'-GGCUGAGAACCAAAAGAGUA-3' (SEQ ID NO:53).
первая нить содержит последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся приблизительно 90% идентичностью с SEQ ID NO: 24 или приблизительно 90% идентичностью с SEQ ID NO: 8;the first strand contains a nucleic acid sequence having approximately 90% identity with SEQ ID NO: 24 or approximately 90% identity with SEQ ID NO: 8;
направляющая область содержит последовательность нуклеиновой кислоты 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3' (SEQ ID NO: 8), и область, не являющаяся направляющей, содержит последовательность нуклеиновой кислоты 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA -3' (SEQ ID NO: 37); илиthe guide region contains the nucleic acid sequence 5'-UGGGCACAUUGGAACUGAGCA-3' (SEQ ID NO: 8) and the non-guide region contains the nucleic acid sequence 5'-UGCUCAGUCAAUGUGCCUA-3' (SEQ ID NO: 37); or
вторая нить содержит последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся приблизительно 90% идентичностью с SEQ ID NO: 53 или приблизительно 90% идентичностью с SEQ ID NO: 37.the second strand contains a nucleic acid sequence having approximately 90% identity with SEQ ID NO: 53 or approximately 90% identity with SEQ ID NO: 37.
2. Средство для RNAi по п. 1, где первая нить и вторая нить соединены посредством РНК-линкера, где необязательно РНК-линкер содержит 4-50 нуклеотидов; где РНК-линкер способен к образованию петлевой структуры, где необязательно петлевая структура содержит 4-20 нуклеотидов.2. Means for RNAi according to claim 1, where the first strand and the second strand are connected by an RNA linker, where optionally the RNA linker contains 4-50 nucleotides; where the RNA linker is capable of forming a loop structure, where optional loop structure contains 4-20 nucleotides.
3. Средство для RNAi по п. 2, где3. The RNAi tool according to claim 2, where
средство для RNAi содержит в направлении от 5'-конца к 3'-концу вторую нить, РНК-линкер и первую нить; или the RNAi agent comprises, in a 5' to 3' direction, a second strand, an RNA linker, and a first strand; or
средство для RNAi содержит в направлении от 5'-конца к 3'-концу первую нить, РНК-линкер и вторую нить;the RNAi agent comprises, in a 5' to 3' direction, a first strand, an RNA linker, and a second strand;
где необязательно средство для RNAi содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:61 или под SEQ ID NO:63 или нуклеотидную последовательность, на приблизительно 90% идентичную нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO: 61 или под SEQ ID NO:63.where optionally the RNAi agent comprises a nucleic acid sequence of SEQ ID NO:61 or SEQ ID NO:63 or a nucleotide sequence approximately 90% identical to the nucleotide sequence of SEQ ID NO:61 or SEQ ID NO:63.
4. Средство для RNAi по любому из пп. 1-3, где4. Means for RNAi according to any one of paragraphs. 1-3, where
средство для RNAi представляет собой малую ингибирующую РНК (siRNA), микроРНК (miRNA) или малую шпилечную РНК (shRNA);the RNAi agent is a small inhibitory RNA (siRNA), microRNA (miRNA), or small hairpin RNA (shRNA);
средство для RNAi нацеливается на РНК, кодирующую полипептид, ассоциированный с нейродегенеративной синуклеинопатией, где необязательно нейродегенеративная синуклеинопатия представляет собой болезнь Паркинсона (PD), множественную системную атрофию атрофию (MSA) или деменцию с тельцами Леви (DLB); иthe RNAi agent targets an RNA encoding a polypeptide associated with neurodegenerative synucleinopathy, where optionally the neurodegenerative synucleinopathy is Parkinson's disease (PD), multiple system atrophy (MSA), or Lewy body dementia (DLB); and
где необязательно полипептид представляет собой альфа-синуклеин (SNCA) или человеческий альфа-синуклеин; илиwhere optionally the polypeptide is alpha-synuclein (SNCA) or human alpha-synuclein; or
выполняются оба условия из (a) и (b). both conditions from (a) and (b) are satisfied.
5. Экспрессионная конструкция, содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую средство для RNAi по любому из пп. 1-4; где необязательно5. An expression construct containing a nucleic acid encoding an RNAi agent according to any one of paragraphs. 1-4; where optional
нуклеиновая кислота, кодирующая средство для RNAi, содержит каркас miRNA;the nucleic acid encoding the RNAi agent contains a miRNA backbone;
нуклеиновая кислота, кодирующая средство для RNAi, функционально связана с промотором, где необязательно промотор выбран из немедленно-раннего промотора цитомегаловируса (CMV), LTR RSV, LTR MoMLV, промотора гена фосфоглицераткиназы-1 (PGK), промотора вируса обезьян 40 (SV40), промотора CK6, промотора гена транстиретина (TTR), промотора TK, тетрациклин-чувствительного промотора (TRE), промотора HBV, промотора hAAT, LSP-промотора, химерного промотора, специфического в отношении печени (LSP), промотора E2F, промотора гена теломеразы (hTERT); промотора, состоящего из энхансера цитомегаловируса/промотора гена бета-актина курицы/промотора гена β-глобина кролика (CAG), промотора гена фактора элонгации 1-альфа (EF1-альфа), промотора человеческого гена β-глюкуронидазы, промотора гена β-актина курицы (CBA), ретровирусного LTR-промотора вируса саркомы Рауса (RSV), промотора гена дигидрофолатредуктазы и промотора гена 13-актина; илиthe nucleic acid encoding the RNAi agent is operably linked to a promoter, where optionally the promoter is selected from the immediate-early cytomegalovirus (CMV) promoter, RSV LTR, MoMLV LTR, phosphoglycerate kinase-1 (PGK) gene promoter, simian virus 40 (SV40) promoter, CK6 promoter, transthyretin (TTR) gene promoter, TK promoter, tetracycline sensitive (TRE) promoter, HBV promoter, hAAT promoter, LSP promoter, chimeric liver-specific (LSP) promoter, E2F promoter, telomerase (hTERT) gene promoter ); promoter consisting of cytomegalovirus enhancer/chicken beta-actin gene promoter/rabbit β-globin (CAG) gene promoter, elongation factor 1-alpha (EF1-alpha) gene promoter, human β-glucuronidase gene promoter, chicken β-actin gene promoter (CBA), Rous sarcoma virus (RSV) retroviral LTR promoter, dihydrofolate reductase gene promoter, and 13-actin gene promoter; or
выполняются оба условия из (a) и (b).both conditions from (a) and (b) are satisfied.
6. Экспрессионная конструкция по п. 5, где экспрессионная конструкция дополнительно содержит интрон, сигнал полиаденилирования или их оба; и где необязательно6. The expression construct according to claim 5, where the expression construct further comprises an intron, a polyadenylation signal, or both; and where optional
интрон представляет собой интрон CBA, интрон hEF1-альфа или химерный интрон, и где необязательно экспрессионная конструкция представляет собой самокомплементарный вектор, и интрон представляет собой химерный интрон дельта; и/илиthe intron is a CBA intron, an hEF1-alpha intron, or a chimeric intron, and where optionally the expression construct is a self-complement vector and the intron is a chimeric delta intron; and/or
сигнал полиаденилирования представляет собой сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста, сигнал полиаденилирования SV40 или сигнал полиаденилирования TK HSV.the polyadenylation signal is a bovine growth hormone polyadenylation signal, an SV40 polyadenylation signal, or a HSV TK polyadenylation signal.
7. Вектор, содержащий экспрессионную конструкцию по п. 5 или 6; где необязательно вектор7. A vector containing an expression construct according to claim 5 or 6; where optional is a vector
представляет собой вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), и где необязательно экспрессионная конструкция фланкирована одной или несколькими последовательностями инвертированного концевого повтора (ITR) AAV или двумя ITR AAV, где необязательно ITR AAV представляют собой ITR серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, AAV козы, AAV крупного рогатого скота или AAV мыши; is a recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector, and where optionally the expression construct is flanked by one or more AAV inverted terminal repeat (ITR) sequences or two AAV ITRs, where optionally AAV ITRs are AAV1, AAV2, AAV3, AAV4 serotype ITRs, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, DJ AAV, goat AAV, bovine AAV, or mouse AAV;
дополнительно содержит спейсерную последовательность нуклеиновой кислоты, расположенную выше или ниже нуклеиновой кислоты, кодирующей средство для RNAi;additionally contains a spacer nucleic acid sequence located upstream or downstream of the nucleic acid encoding the agent for RNAi;
представляет собой самокомплементарный вектор на основе rAAV, где необязательно вектор содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую средство для RNAi, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую последовательность, комплементарную последовательности средства для RNAi, где первая последовательность нуклеиновой кислоты может образовывать внутринитевые пары оснований со второй последовательностью нуклеиновой кислоты на протяжении большей части или всей ее длины, и где необязательно первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторая последовательность нуклеиновой кислоты соединены мутантным ITR AAV, где мутантный ITR AAV характеризуется делецией D-области и содержит мутацию последовательности концевого разрешения; илиis a self-complementary rAAV-based vector, where optionally the vector contains a first nucleic acid sequence encoding an agent for RNAi, and a second nucleic acid sequence encoding a sequence complementary to the sequence of an agent for RNAi, where the first nucleic acid sequence can form intrastrand base pairs with the second sequence nucleic acid for most or all of its length, and where optionally the first nucleic acid sequence and the second nucleic acid sequence are connected by a mutant AAV ITR, where the mutant AAV ITR is characterized by a D-region deletion and contains a terminal resolution sequence mutation; or
предусматривает любую комбинацию из (a)-(c).provides for any combination of (a)-(c).
8. Клетка, содержащая вектор по п. 7.8. A cell containing a vector according to item 7.
9. Частица рекомбинантного AAV, содержащая вектор по п. 7; где необязательно вирусная частица AAV содержит капсид серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, AAV2-HBKO, AAVDJ8, AAVPHP.B, AAVPHP.eB, AAVBR1, AAVHSC15, AAVHSC17, AAV козы, химерного AAV1/AAV2, AAV крупного рогатого скота, AAV мыши или rAAV2/HBoV1; и9. A recombinant AAV particle containing the vector according to claim 7; where optionally the AAV viral particle contains a capsid of the serotype AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, AAV2-HBKO, AAVDJ8, AAVPHP.B, AAVPHP.eB, AAVBR1, AAVHSC15, AAVHSC17, Goat AAV, Chimeric AAV1/AAV2, Bovine AAV, Mouse AAV2/HBoV1 ; and
где необязательноwhere optional
ITR и капсид вирусной частицы rAAV получены из одного и того же серотипа AAV; илиThe ITR and capsid of the rAAV virus particle are derived from the same AAV serotype; or
ITR и капсид вирусной частицы rAAV получены из разных серотипов AAV, где необязательно ITR получен из AAV2, и капсид частицы rAAV получен из AAV1.The ITR and capsid of the rAAV viral particle are derived from different AAV serotypes, where optionally the ITR is derived from AAV2 and the capsid of the rAAV particle is derived from AAV1.
10. Композиция, содержащая частицу rAAV по п. 9, где необязательно композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.10. A composition comprising an rAAV particle according to claim 9, wherein the composition optionally further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
11. Набор, содержащий средство для RNAi по любому из пп. 1-4, частицу AAV по п. 9 или композицию по п. 10, где необязательно набор дополнительно содержит инструкции по применению.11. A kit containing an agent for RNAi according to any one of paragraphs. 1-4, an AAV particle according to claim 9 or a composition according to claim 10, where optionally the kit further contains instructions for use.
12. Способ лечения нейродегенеративной синуклеинопатии у млекопитающего, включающий введение млекопитающему средства для RNAi по любому из пп. 1-4, экспрессионной конструкции по п. 5 или 6, вектора по п. 7, клетки по п. 8, частицы rAAV по п. 9 или композиции по п. 10.12. A method of treating neurodegenerative synucleinopathy in a mammal, comprising administering to the mammal an RNAi agent according to any one of paragraphs. 1-4, an expression construct according to claim 5 or 6, a vector according to claim 7, a cell according to claim 8, an rAAV particle according to claim 9, or a composition according to claim 10.
13. Способ подавления экспрессии альфа-синуклеина у млекопитающего с нейродегенеративным заболеванием, включающий введение млекопитающему средства для RNAi по любому из пп. 1-4, экспрессионной конструкции по п. 5 или 6, вектора по п. 7, клетки по п. 8, частицы rAAV по п. 9 или композиции по п. 10.13. A method of suppressing the expression of alpha-synuclein in a mammal with a neurodegenerative disease, comprising administering to the mammal an RNAi agent according to any one of paragraphs. 1-4, an expression construct according to claim 5 or 6, a vector according to claim 7, a cell according to claim 8, an rAAV particle according to claim 9, or a composition according to claim 10.