RU2020139299A - Образование нокаутных первичных и размноженных nk-клеток человека с использованием рибонуклеопротеинов cas9 - Google Patents
Образование нокаутных первичных и размноженных nk-клеток человека с использованием рибонуклеопротеинов cas9 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2020139299A RU2020139299A RU2020139299A RU2020139299A RU2020139299A RU 2020139299 A RU2020139299 A RU 2020139299A RU 2020139299 A RU2020139299 A RU 2020139299A RU 2020139299 A RU2020139299 A RU 2020139299A RU 2020139299 A RU2020139299 A RU 2020139299A
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cell
- cells
- subject
- target
- modified
- Prior art date
Links
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 title claims 6
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 title claims 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 title claims 2
- 230000000644 propagated Effects 0.000 title claims 2
- 210000000822 Killer Cells, Natural Anatomy 0.000 claims 26
- 210000004693 NK cell Anatomy 0.000 claims 17
- 229920002391 Guide RNA Polymers 0.000 claims 5
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims 5
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 claims 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims 5
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 claims 4
- 102100003994 TGFBR2 Human genes 0.000 claims 4
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims 4
- 102100016790 HPRT1 Human genes 0.000 claims 3
- 101710011940 HPRT1 Proteins 0.000 claims 3
- 108010082684 Transforming Growth Factor-beta Type II Receptor Proteins 0.000 claims 3
- 229920000033 CRISPR Polymers 0.000 claims 2
- 108010082319 CRISPR-Associated Protein 9 Proteins 0.000 claims 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims 2
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims 2
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 claims 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims 1
- 101710011270 TGFBR2 Proteins 0.000 claims 1
- 230000000735 allogeneic Effects 0.000 claims 1
- 101700056051 cas9 Proteins 0.000 claims 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 claims 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 claims 1
- 229920000023 polynucleotide Polymers 0.000 claims 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims 1
Claims (24)
1. Способ генетической модификации NK-клетки, включающий:
а) получение направляющей РНК (гРНК), специфичной для целевой последовательности ДНК; и
б) введение путем электропорации в целевую NK-клетку комплекса рибонуклеопротеина (RNP), содержащего эндонуклеазу CRISPR/Cas класса 2 (Cas9), связанную в комплекс с соответствующей CRISPR/Cas направляющей РНК, гибридизующей целевую последовательность внутри геномной ДНК NK-клетки.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что геном NK-клетки модифицируют путем вставки или делеции одной или более пар оснований, путем вставки фрагмента гетерологичной ДНК (например, донорного полинуклеотида), путем делеции фрагмента эндогенной ДНК, путем инверсии или транслокации фрагмента эндогенной ДНК, или их комбинации.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что NK-клетки представляют собой первичные или размноженные NK-клетки.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что первичные NK-клетки инкубируют в течение 2, 3 или 4 дней в присутствии IL-2 до проведения электропорации.
5. Способ по п. 3, отличающийся тем, что первичные NK-клетки размножают в течение 4 дней в присутствии облученных питающих клеток до проведения электропорации.
6. Способ по п. 1, дополнительно включающий размножение модифицированных NK-клеток с облученными питающими клетками, экспрессирующими mbIL-21, после проведения электропорации.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает образование комплекса RNP путем разбавления 36 мкМ cas9 в растворе 200 мкМ крРНК и ТrасеrРНК.
8. NK-клетка, модифицированная способом по п. 1.
9. Генетически модифицированная NK-клетка, содержащая нокаут гена, кодирующего трансформирующий фактор роста-β рецептор 2 (TGFBR2) или гипоксантин фосфорибозилтрансферазу 1 (HPRT1).
10. Способ адоптивного переноса сконструированных NK-клеток субъекту, нуждающемуся в этом, включающий:
а) получение целевой NK-клетки, подлежащей модификации;
б) получение гРНК, специфичной для целевой последовательности ДНК;
в) введение путем электропорации в целевую NK-клетку комплекса RNP, содержащего эндонуклеазу CRISPR/Cas (Cas9) класса 2, связанную в комплекс с соответствующей CRISPR/Cas направляющей РНК, гибридизующейся с целевой последовательностью внутри геномной ДНК целевой NK-клетки, с образованием сконструированной NK-клетки; и
г) перенос сконструированной NK-клетки в организм субъекта.
11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что субъект страдает от рака.
12. Способ по п. 10, отличающийся тем, что NK-клетка представляет собой первичную NK-клетку, модифицированную ex vivo, и перенесенную субъекту после модификации.
13. Способ по п. 10, отличающийся тем, что NK-клетка представляет собой аутологичную NK-клетку.
14. Способ по п. 10, отличающийся тем, что NK-клетку получают из аллогенного донорского источника.
15. Способ по п. 10, отличающийся тем, что NK-клетку размножают при помощи облученных питающих клеток, экспрессирующих mbIL-21, до введения субъекту.
16. Способ по п. 10, отличающийся тем, что NK-клетку размножают в организме субъекта после переноса NK-клеток субъекту посредством введения IL-21 или облученных питающих клеток, экспрессирующих mbIL-21.
17. Способ по п. 10, отличающийся тем, что комплекс RNP нацелен на ген TGFBR2 или HPRT1.
18. Способ лечения рака у субъекта, включающий введение субъекту NK-клеток, модифицированых таким образом, что они содержат нокаут TGFBR2 гена.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US62/672,368 | 2018-05-16 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2020139299A true RU2020139299A (ru) | 2022-06-16 |
RU2808035C2 RU2808035C2 (ru) | 2023-11-22 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106566838B (zh) | 一种基于CRISPR-Cas9技术的miR-126全长基因敲除试剂盒及其应用 | |
Ghosh et al. | CRISPR–Cas9 a boon or bane: the bumpy road ahead to cancer therapeutics | |
US20200054679A1 (en) | Compositions and Methods for Gene Editing in T cells using CRISPR/Cpf1 | |
JP7409773B2 (ja) | 改変された細胞および治療の方法 | |
CN107630006A (zh) | 一种制备tcr与hla双基因敲除的t细胞的方法 | |
JP2019520844A5 (ru) | ||
JP2017513477A5 (ru) | ||
JP2018522072A5 (ru) | ||
JP2018518181A5 (ru) | ||
Glicksman | Induced pluripotent stem cells: the most versatile source for stem cell therapy | |
CN110616187A (zh) | CRISPR-Cas9高效敲入嵌合抗原受体基因到T细胞特定基因组位点的方法及应用 | |
CN105602987A (zh) | 一种高效的dc细胞xbp1基因敲除方法 | |
CN112840031B (zh) | 成对的二分免疫受体多核苷酸的高通量克隆及其应用 | |
Wu et al. | The application of CRISPR-Cas9 genome editing tool in cancer immunotherapy | |
RU2013121577A (ru) | Композиции бактериальной рибонуклеиновой кислоты и клеточных стенок и способы получения и их применение | |
Roper et al. | Breakthrough moments: genome editing and organoids | |
CN107002036A (zh) | 用于建立具有编码抗原特异性t细胞受体的基因的多能性干细胞的方法 | |
RU2020139299A (ru) | Образование нокаутных первичных и размноженных nk-клеток человека с использованием рибонуклеопротеинов cas9 | |
Chen et al. | Advances in CAR‐Engineered Immune Cell Generation: Engineering Approaches and Sourcing Strategies | |
CN110819592A (zh) | 一种通用供体干细胞及其制备方法 | |
CN106957822A (zh) | 体外扩增基因编辑活化t细胞的培养方法、试剂盒及应用 | |
CN110616233B (zh) | CRISPR-Cas9高效敲除原代T细胞基因的方法及其应用 | |
US20210254068A1 (en) | Genome engineering primary monocytes | |
Li et al. | Improving Cancer Immunotherapy with CRISPR‐Based Technology | |
US20200061210A1 (en) | Novel method for gene therapy using intranasal administration of genetically modified viral vectors |