RU2017816C1

RU2017816C1 - Method of microorganism biomass preparing

Info

Publication number: RU2017816C1
Authority: RU
Inventors: С.С. Автушенко; В.Л. Искрицкий; В.А. Балмасов; Е.Н. Свентицкий; С.Н. Бизунок; В.В. Муховиков
Original assignee: Автушенко Сергей Сергеевич; Научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов
Priority date: 1991-04-04
Filing date: 1991-04-04
Publication date: 1994-08-15

Abstract

FIELD: microbiology. SUBSTANCE: microorganisms are cultured on the liquid nutrient medium with addition of 0.1-5% solution of esterified polyglycerol in liquid hydrocarbon as a surface-active substance. The latter is added to the nutrient medium at concentration 12.5-50 vol.%. EFFECT: improved method of biomass preparing. 2 tbl

Description

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам получения биомассы микроорганизмов. The invention relates to microbiology, and in particular to methods for producing biomass of microorganisms.

Известны способы получения биомассы микроорганизмов путем их культивирования в жидких питательных средах, состоящих из растворов питательных веществ в воде. Known methods for producing biomass of microorganisms by culturing them in liquid nutrient media consisting of solutions of nutrients in water.

Основными недостатками таких способов является низкая скорость роста, невысокая урожайность питательных сред, интенсивное пенообразование, а также низкая устойчивость получаемых микробных клеток к основным технологическим процессам их переработки при получении готовых форм биопрепаратов - замораживанию и высушиванию при лиофилизации, аэрозолированию и высушиванию при распылительной сушке. The main disadvantages of such methods are the low growth rate, low yield of nutrient media, intensive foaming, as well as the low resistance of the resulting microbial cells to the main technological processes of their processing when preparing finished forms of biological products - freezing and drying during lyophilization, aerosolization and drying by spray drying.

Известны способы культивирования микроорганизмов в питательных средах с дополнительным введением в них аминокислот, витаминов или мелассы, обеспечивающие повышение устойчивости микроорганизмов к высушиванию на 20-30%. Known methods for the cultivation of microorganisms in nutrient media with the additional introduction of amino acids, vitamins or molasses into them, which increase the resistance of microorganisms to drying by 20-30%.

Основными недостатками этих способов являются интенсивное пенообразование и низкий уровень повышения устойчивости микроорганизмов при высушивании. The main disadvantages of these methods are intensive foaming and a low level of increased resistance of microorganisms to drying.

Прототипом изобретения является способ получения биомассы микроорганизмов, обеспечивающий повышение устойчивости бактериальных клеток к замораживанию путем введения в питательную среду поверхностно-активного вещества твина-80. Указанный способ обеспечивает повышение устойчивости лактобацилл к замораживанию и кратковременному (48 ч) хранению в условиях температуры минус 17^оС (сохранение активности - 40-60%).The prototype of the invention is a method for producing biomass of microorganisms, which increases the resistance of bacterial cells to freezing by introducing a Tween-80 surfactant into the nutrient medium. The method provides increased resistance to freeze and lactobacillus short-term (48 h) in storage conditions of temperature minus 17 ^{° C} (retention of activity - 40-60%).

Основными недостатками способа являются обильное пенообразование и необходимость использования пеногасителей, низкий уровень повышения устойчивости бактерий к замораживанию и одинаковый с контрольным способом (без твина) выход биомассы микроорганизмов после культивирования. The main disadvantages of the method are abundant foaming and the need to use antifoam agents, a low level of increasing the resistance of bacteria to freezing and the yield of microorganism biomass identical to the control method (without tween) after cultivation.

Целью изобретения является увеличение скорости роста и выхода получаемой биомассы микроорганизмов, повышение устойчивости к стрессовым факторам - замораживанию, высушиванию и аэрозолированию. The aim of the invention is to increase the growth rate and yield of the resulting biomass of microorganisms, increase resistance to stress factors - freezing, drying and aerosolization.

Цель достигается введением в питательные среды, используемые для культивирования различных микроорганизмов 12,5-50% (объем-объем) 0,1-5% (объем/объем) раствора этерифицированного полиглицерина в масле. В результате использования предлагаемого способа достигается увеличение более чем в 2 раза скорости роста и выхода получаемой биомассы, повышение устойчивости микроорганизмов к замораживанию, высушиванию и аэрозолированию, устранение пенообразования. Дополнительно происходит удешевление процесса в целом за счет более низкой стоимости раствора этерифицированного полиглицерина в неполярном растворителе по отношению к питательной среде. The goal is achieved by introducing into the nutrient media used for the cultivation of various microorganisms 12.5-50% (volume-volume) of 0.1-5% (volume / volume) of a solution of esterified polyglycerol in oil. As a result of using the proposed method, an increase of more than 2 times the growth and yield of the resulting biomass is achieved, increasing the resistance of microorganisms to freezing, drying and aerosolization, eliminating foaming. Additionally, the overall process is cheaper due to the lower cost of the solution of esterified polyglycerol in a non-polar solvent relative to the nutrient medium.

Существенным отличием заявляемого способа является использование для культивирования микроорганизмов принципиально другого механизма взаимодействия поверхностно-активного вещества с растущими клетками. Благодаря введению раствора этерифицированного полиглицерина в неполярном растворителе в процессе культивирования формируется эмульсия питательной среды в неполярном растворителе, что приводит к интенсификации процессов массообмена, увеличению скорости роста, количества и качества получаемой биомассы. A significant difference of the proposed method is the use for the cultivation of microorganisms of a fundamentally different mechanism for the interaction of surfactants with growing cells. Due to the introduction of a solution of esterified polyglycerol in a non-polar solvent during the cultivation process, an emulsion of a nutrient medium is formed in a non-polar solvent, which leads to an intensification of mass transfer processes, an increase in the growth rate, quantity and quality of the resulting biomass.

П р и м е р 1. Приготовили стандартную жидкую питательную среду для культивирования E. coli M=17 - продуцента колибактерина. В питательную среду внесли посевную культуру из расчета 1 млрд. кл на 1 мл среды. Культивирование проводили в колбах на качалке при температуре 37±2^оС. Урожай биомассы в указанных условиях культивирования составил 4,2±0,5 млрд. живых клеток в 1 мл питательной среды, удельная скорость роста - 0,35-0,37 и время удвоения биомассы 1,87-1,98 ч (табл.1).PRI me R 1. Prepared a standard liquid nutrient medium for the cultivation of E. coli M = 17 - producer of colibacterin. A seed culture was introduced into the nutrient medium at the rate of 1 billion cells per 1 ml of medium. Cultivation was carried out in shaker flasks at 37 ± 2 ° ^C. The harvest of biomass in these culture conditions was 4.2 ± 0.5 billion live cells in 1 ml culture medium, the specific growth rate -. 0,35-0,37 and biomass doubling time 1.87-1.98 h (Table 1).

П р и м е р 2. Приготовили питательную среду путем добавления к одному объему стандартной среды по условиям примера 1 одного объема 5% (объем/объем) раствора этерифицированного полиглицерина (ЭПГ) в нормальном жидком парафине додекане. Внесли посевную культуру и провели культивирование согласно условиям примера 1. Через 6 ч культивирования урожай биомассы составил 8,8±0,7 млрд. живых клеток в 1 мл среды, удельная скорость роста 0,56-0,58 и время удвоения биомассы 1,03-1,14 (табл.1). PRI me R 2. Prepared a nutrient medium by adding to one volume of standard medium according to the conditions of example 1 one volume of 5% (volume / volume) solution of esterified polyglycerol (EPG) in normal liquid dodecane paraffin. A seed culture was introduced and cultivation was carried out according to the conditions of Example 1. After 6 hours of cultivation, the biomass yield was 8.8 ± 0.7 billion living cells in 1 ml of medium, the specific growth rate was 0.56-0.58 and the biomass doubling time 1, 03-1.14 (Table 1).

П р и м е р 3. Приготовили питательную среду и провели культивирование согласно условиям примера 2. В качестве масла использовали жидкий парафин - тетрадекан. Через 6 ч культивирования урожай биомассы составил 10,3±1,2 млрд. живых клеток в 1 мл среды, удельная скорость роста 0,66-0,69 и время удвоения биомассы 1,00-1,05 ч (табл.1). PRI me R 3. Prepared a nutrient medium and conducted cultivation according to the conditions of example 2. As the oil used liquid paraffin - tetradecane. After 6 hours of cultivation, the biomass yield was 10.3 ± 1.2 billion living cells in 1 ml of medium, the specific growth rate was 0.66-0.69 and the biomass doubling time was 1.00-1.05 hours (Table 1) .

П р и м е р 4. Приготовили питательные среды согласно условиям примеров 2 и 3, но с содержанием ЭПГ в масляной фазе 2,5% (объем/объем). Провели культивирование в условиях примера 3. Выход биомассы через 6 часов культивирования составил 6,1±0,8 млрд.живых клеток в среде с додеканом и 6,2±0,9 в среде с тетрадеканом (табл.1). PRI me R 4. Prepared a nutrient medium according to the conditions of examples 2 and 3, but with an EPG content in the oil phase of 2.5% (volume / volume). The cultivation was carried out under the conditions of example 3. The biomass yield after 6 hours of cultivation was 6.1 ± 0.8 billion living cells in a medium with dodecane and 6.2 ± 0.9 in a medium with tetradecane (Table 1).

П р и м е р 5. Приготовили стандартную питательную среду для культивирования Bac.thuringiensis var. Kurstaki - продуцента лепидоцида. В питательную среду внесли биомассу спор Bac.thuringiensis в концентрации 0,5 млрд. живых спор на 1 мл питательной среды. Культивирование проводили при температуре 37±2^оС в ферментере Ультроферм (ЛКБ, Швеция) в объеме 4 л. Через 24 ч культивирования урожай биомассы составил 2±1 млрд.живых клеток в 1 мл среды. В процессе роста происходило обильное пенообразование, которое устраняли периодическим добавлением полипропиленгликоля (табл.1).PRI me R 5. Prepared a standard nutrient medium for the cultivation of Bac.thuringiensis var. Kurstaki is a producer of lepidocide. Bac.thuringiensis spore biomass was introduced into the culture medium at a concentration of 0.5 billion live spores per 1 ml of culture medium. Cultivation was carried out at a temperature of 37 ± 2 ^{° C} in a fermenter Ultroferm (LKB, Sweden) in a volume of 4 liters. After 24 hours of cultivation, the biomass yield was 2 ± 1 billion living cells in 1 ml of medium. During the growth process, profuse foaming occurred, which was eliminated by the periodic addition of polypropylene glycol (Table 1).

П р и м е р 6. Приготовили питательную среду путем добавления к одному объему стандартной питательной среды по условиям примера 5 одного объема 0,1% раствора (объем/объем) ЭПГ в жидком парафине гексадекане. Внесли посевную культуру и провели культивирование согласно условиям примера 5. Через 18 ч культивирования урожай биомассы Bac. thuringiensis составил 17,7±2,1 млрд. живых клеток в 1 мл среды. В процессе культивирования пенообразования не происходило (табл.1). PRI me R 6. Prepared a nutrient medium by adding to one volume of a standard nutrient medium according to the conditions of example 5 of one volume of 0.1% solution (volume / volume) of EPG in liquid paraffin hexadecane. A seed culture was introduced and cultivation was carried out according to the conditions of Example 5. After 18 hours of cultivation, the Bac biomass crop. thuringiensis amounted to 17.7 ± 2.1 billion living cells in 1 ml of medium. In the process of cultivation, foaming did not occur (table 1).

П р и м е р 7. Приготовили питательную среду согласно условиям примера 3, но содержанием ЭПГ в масляной фазе 0,05% (объем/объем). Провели культивирование в условиях примера 3. Выход биомассы E.coli через 6 ч культивирования составил 3,8±0,4 млрд.живых клеток в 1 мл питательной среды. PRI me R 7. Prepared a nutrient medium according to the conditions of example 3, but the EPG content in the oil phase of 0.05% (volume / volume). The culture was carried out under the conditions of Example 3. The yield of E. coli biomass after 6 hours of cultivation was 3.8 ± 0.4 billion living cells in 1 ml of culture medium.

П р и м е р 8. Приготовили питательные среды согласно условиям примеров 2 и 3, но без добавления ЭПГ в масляную фазу. Провели культивирование в условиях примера 3. Через 6 ч культивирования выход биомассы составил 4,0±0,5 млрд/мл живых клеток в среде с додеканом и 4,1±0,5 млрд/мл живых клеток E.coli в среде с тетрадеканом (табл.1). PRI me R 8. Prepared a nutrient medium according to the conditions of examples 2 and 3, but without the addition of EPG in the oil phase. The culture was carried out under the conditions of Example 3. After 6 hours of cultivation, the biomass yield was 4.0 ± 0.5 billion / ml of living cells in a medium with dodecan and 4.1 ± 0.5 billion / ml of living E. coli cells in a medium with tetradecane (table 1).

П р и м е р 9. Приготовили питательную среду согласно условиям примера 3, но с содержанием ЭПГ в масляной фазе 7% (объем/объем). В питательную среду внесли посевную культуру E.coli М-17 из расчета 1 млрд.клеток на 1 мл среды. Культивирование проводили в ферментере "Ультроферм" (ЛКБ, Швеция) при 37^оС в течение 6 ч в объеме 4 л. Через 6 ч культивирования урожай биомассы составил менее 1 млрд/мл живых клеток E.coli (табл.1).PRI me R 9. Prepared a nutrient medium according to the conditions of example 3, but with the content of EPG in the oil phase of 7% (volume / volume). A seed culture of E. coli M-17 was introduced into the nutrient medium at the rate of 1 billion cells per 1 ml of medium. Culturing was performed in a fermenter "Ultroferm" (LKB, Sweden) at 37 ^{° C} for 6 hours in a volume of 4 liters. After 6 hours of cultivation, the biomass yield was less than 1 billion / ml of living E. coli cells (Table 1).

П р и м е р 10. Приготовили питательные среды согласно условиям примера 3, но с добавлением к стандартной питательной среде 5%, 12,5%, 25%, 50% и 75% (объем/объем) 5% (объем/объем) раствора этерифицированного полиглицерина в тетрадекане. В питательные среды внесли посевную культуру и провели культивирование согласно условиям примера 3. Количество биомассы, полученной через 6 ч культивирования в среде с одинаковым содержанием водной и масляной фаз (согласно условиям примера 3) приняли за 100%. Выход биомассы через 6 часов культивирования в средах с 12,5 и 25% масляной фаз был одинаков и составлял соответственно 106±17 и 96±9% по отношению к урожаю в питательной среде с одинаковым содержанием водной и масляной фаз. В питательных средах с 5 и 75% масляной фазы выход биомассы составлял соответственно 52±7% и 40±8% по отношению к урожаю, полученному в питательной среде, изготовленной согласно условиям примера 3 (табл.2). PRI me R 10. Prepared a nutrient medium according to the conditions of example 3, but with the addition of a standard nutrient medium 5%, 12.5%, 25%, 50% and 75% (volume / volume) 5% (volume / volume ) a solution of esterified polyglycerol in tetradecane. A seed culture was introduced into the culture media and cultivation was carried out according to the conditions of Example 3. The amount of biomass obtained after 6 hours of cultivation in a medium with the same water and oil phases (according to the conditions of Example 3) was taken as 100%. The biomass yield after 6 hours of cultivation in media with 12.5 and 25% oil phases was the same and amounted to 106 ± 17 and 96 ± 9%, respectively, relative to the crop in a nutrient medium with the same content of water and oil phases. In nutrient media with 5 and 75% of the oil phase, the biomass yield was 52 ± 7% and 40 ± 8%, respectively, with respect to the crop obtained in the nutrient medium prepared according to the conditions of Example 3 (Table 2).

П р и м е р 11 (по прототипу). Приготовили питательную среду согласно условиям примера 1. В питательную среду внесли 0,1% твина-80. Внесли посевную культуру и провели культивирование согласно условиям примера 1. Через 6 ч культивирования урожай биомассы составил 4,3±0,5 млрд/мл живых клеток E.coli M-17. PRI me R 11 (prototype). Prepared a nutrient medium according to the conditions of example 1. In the nutrient medium made 0.1% tween-80. A seed culture was introduced and cultivation was carried out according to the conditions of Example 1. After 6 hours of cultivation, the biomass yield was 4.3 ± 0.5 billion / ml of living E. coli M-17 cells.

П р и м е р 12. Приготовили питательные среды и провели культивирование согласно условиям примеров 1, 2, 3 и 11. Полученные культуры разлили в ампулы и заморозили при температуре минус 10±2^оС. Через 6 мес хранения количество живых клеток в контрольных препаратах составляло 2-7% от исходного количества, в препаратах, выращенных с твином-80 - 6-13%, в препаратах, выращенных с додеканом и ЭПГ- 30-37%, в препаратах, выращенных с тетрадеканом и ЭПГ - 42-60% от исходного количества живых клеток в указанном препарате
П р и м е р 13. Культуры E.сoli вырастили согласно условиям примеров 1 и 3. Препараты высушили в тонком слое в вакууме при комнатной температуре до влажности 4±1%. До и после высушивания определили количество жизнеспособных клеток. Выживаемость клеток E.coli составляла 12-60% в контрольных препаратах и 90-100% в препаратах, выращенных с тетрадеканом.EXAMPLE EXAMPLE 12 was prepared culture media and cultivation conducted under the conditions of Examples 1, 2, 3 and 11. The cultures were dispensed into vials and frozen at minus 10 ± 2 ^° C After 6 months storage the number of living cells in the control preparations made up 2-7% of the initial amount, in preparations grown with tween-80 - 6-13%, in preparations grown with dodecan and EPG - 30-37%, in preparations grown with tetradecane and EPG - 42-60 % of the initial number of living cells in the specified drug
Example 13. E. coli cultures were grown according to the conditions of examples 1 and 3. The preparations were dried in a thin layer in vacuum at room temperature to a moisture content of 4 ± 1%. Before and after drying, the number of viable cells was determined. The survival rate of E. coli cells was 12-60% in control preparations and 90-100% in preparations grown with tetradecane.

П р и м е р 14. Культуры E.coli вырастили согласно условиям примеров 1, 2 и 3. Препараты распылили в статическую аэрозольную камеру с относительной влажностью 50±5%. В течение 30 мин витания определяли количество живых клеток в пробах аэрозоля. Выживаемость контрольных образцов через 1,5 и 30 мин витания составляла соответственно 7-15%, 3-5% и 1-3%. Выживаемость препаратов с додеканом и тетрадеканом составляла 27-51, 28-36 и 19-24 % через 1,5 и 30 мин витания. PRI me R 14. Cultures of E. coli were grown according to the conditions of examples 1, 2 and 3. The preparations were sprayed in a static aerosol chamber with a relative humidity of 50 ± 5%. During 30 minutes of soaking, the number of living cells in aerosol samples was determined. Survival of control samples after 1.5 and 30 min of soaring was 7-15%, 3-5%, and 1-3%, respectively. The survival rate of drugs with dodecane and tetradecane was 27-51, 28-36 and 19-24% after 1.5 and 30 minutes of soaking.

Данные примеров 1-14 показывают, что предлагаемый способ получения биомассы микроорганизмов обеспечивает увеличение скорости роста и количества биомассы микроорганизмов и одновременно повышение устойчивости выращенных клеток к замораживанию, высушиванию и аэрозолированию. Преимуществом предлагаемого способа является также отсутствие пенообразования при культивировании микроорганизмов. Применение способа позволяет удешевить процесс культивирования в целом, так как до 50% объема дорогостоящей питательной среды может быть заменено на неполярный растворитель (например, жидкий парафин), обладающий более низкой стоимостью. The data of examples 1-14 show that the proposed method for producing biomass of microorganisms provides an increase in the growth rate and amount of biomass of microorganisms and at the same time increases the resistance of the grown cells to freezing, drying and aerosolization. An advantage of the proposed method is also the absence of foaming during the cultivation of microorganisms. The application of the method allows to reduce the cost of the cultivation process as a whole, since up to 50% of the volume of an expensive nutrient medium can be replaced by a non-polar solvent (for example, liquid paraffin), which has a lower cost.

Количество масляной фазы, добавляемой к стандартной среде для увеличения урожая и качества получаемой биомассы, составляет 12,5-50% от всего объема питательной среды. Оптимальное количество этерифицированного полиглицерина, добавляемого в масляную фазу, составляет 0,1-5% (объем/объем). Концентрации ЭПГ в масляной фазе и количество масляной фазы в питательной среде выше и ниже указанных значений приводят к худшим результатам. The amount of oil phase added to the standard medium to increase the yield and quality of the resulting biomass is 12.5-50% of the total volume of the nutrient medium. The optimal amount of esterified polyglycerol added to the oil phase is 0.1-5% (v / v). The concentration of EPG in the oil phase and the amount of oil phase in the nutrient medium above and below these values lead to worse results.

Способ прост по технике выполнения и может быть использован в любой лаборатории и в любом производстве без переоборудования. The method is simple in execution technique and can be used in any laboratory and in any production without conversion.

Claims

1. METHOD FOR PRODUCING MICROORGANISM BIOMASS by culturing them in a liquid nutrient medium with the addition of a surfactant, characterized in that, in order to increase resistance to stress factors and increase the growth rate, 0.1 to 5% is used as a surfactant solution of esterified polyglycerol in a liquid hydrocarbon.

2. The method according to claim 1, characterized in that the solution of esterified polyglycerol is added to the nutrient medium in an amount of 12.5 to 50 vol.%.