RU2016147204A

RU2016147204A - Метод обнаружения канцерогенеза шейки матки

Info

Publication number: RU2016147204A
Application number: RU2016147204A
Authority: RU
Inventors: Винченцо МАККАЛЛИНИ; БЕНЕДЕТТО Джузеппе ДИ
Original assignee: Винченцо МАККАЛЛИНИ; БЕНЕДЕТТО Джузеппе ДИ
Priority date: 2014-05-07
Filing date: 2015-05-07
Publication date: 2018-06-07
Also published as: AU2015257259A8; EP3140655B1; WO2015170360A4; EP3140655A1; AU2015257259A1; BR112016025913B1; RU2702334C2; RU2016147204A3; PT3140655T; CA2983712A1; WO2015170360A1; IL248688B; BR112016025913A2; ES2721526T3; CA2983712C; IL248688A0; SMT201900233T1; CN107003313A; US20170074881A1

Claims

1. Способ обнаружения злокачественного перерождения клеток, вызываемого вирусом папилломы человека (ВПЧ) у женщин, проходящих скрининг на рак шейки матки, включающий обнаружение в образцах клеток, взятых из плоскоклеточного-цилиндроклеточного стыка эпителия шейки матки обследуемой пациентки, белкового комплекса Е6/р53, состоящего из белка Е6 и белка р53, и белкового комплекса E7/pRB, состоящего из белка Е7 и белка pRB, согласно которому обнаружение указанных двух белковых комплексов показывает, что у обследуемой пациентки канцерогенез стал необратимым, и указанное обнаружение выполняется при комбинированном использовании антител-антибелков Е6 и антител-антибелков Е7.

2. Способ по п. 1, включающий следующие шаги в соответствии с методикой вестерн-блоттинга:

a) подготовка образца клеток, взятых из плоскоклеточного-цилиндроклеточного стыка эпителия шейки матки обследуемой пациентки и его помещение в физиологический раствор;

b) извлечение белков из указанного образца и денатурирование полученных белков;

c) обработка полученных таким образом денатурированных белков электрофорезом в полиакриламидном геле;

d) перенос белков, полученных во время предыдущей операции, на мембрану и нейтрализация свободных участков указанной мембраны;

e) идентификация указанных белков путем их инкубации по меньшей мере со следующими антителами:

первичным моноклональным антителом-антибелком Е6;

первичным моноклональным антителом-антибелком Е7;

с последующей инкубацией с вторичными антителами анти-IgG, конъюгированными с биотином или ферментом-посредником, таким как щелочная фосфатаза;

f) проведение колориметрического анализа или хемилюминесценции продуктов, полученных в результате предыдущей операции;

в которой результаты упомянутого анализа, демонстрирующие двойную полосу реакции по крайней мере для одного из белков Е6 и Е7, где указанная двойная полоса содержит первую полосу, соответствующую молекулярной массе искомого белка, т.е. Е6 или Е7, а вторая полоса соответствует молекулярной массе, отличающейся и превышающей молекулярную массу соответствующего белка первой полосы, и указанный молекулярный вес по существу равен 71 кД для белкового комплекса Е6/р53 и 115,5 кД для белкового комплекса E7/pRB, показывают, что канцерогенез обследуемой пациентки стал необратимым.

3. Способ по п. 2, в котором на указанной стадии e) указанные белки также инкубировали со следующими антителами:

первичным моноклональным антителом-антибелком р53;

первичным моноклональным антителом-антибелком pRb;

дальнейшие действия аналогичны тем, которые проводились в случае инкубации с указанными первичными моноклональными антителами-антибелками Е6 и антибелками Е7, в которых результаты упомянутого анализа, показывающие двойную полосу реакции по крайней мере для одного из белков р53 и pRb, где указанная двойная полоса, содержащая первую полосу, соответствующую молекулярной массе искомого белка р53 или pRb, и вторая полоса, соответствующая молекулярной массе, отличающейся и более высокой, чем молекулярная масса соответствующего белка первой полосы, показывают, что у обследуемой пациентки канцерогенез стал необратимым.

4. Способ по п. 2 или 3, согласно изобретению, где результаты упомянутого анализа показывают одну полосу реакции на белки Е6 и Е7, и указанная одна полоса соответствует молекулярной массе искомого белка Е6 или Е7, показывают, что у обследуемой пациентки канцерогенез еще не начался или еще не стал необратимым.

5. Способ по п. 4, согласно которому результаты анализа, не показывающие какой-либо полосы реакции для белков Е6 и Е7, означают, что у обследуемой пациентки отсутствует интеграция ДНК вируса с ДНК клеток.

6. Способ по любому из пп. 2 или 3, согласно которому вторичные антитела-анти-IgG указанной стадии e) конъюгированы с щелочной фосфатазой, и согласно которому указанное обнаружение по пункту f) представляет собой колориметрический анализ или хемилюминесценцию.

7. Способ по п. 2, в котором указанное первичное моноклональное антитело-антибелок Е6 представляет собой мышиное антитело-антибелок Е6 вирусного типа HPV16 и HPV18, а указанное первичное моноклональное антитело-антибелок Е7 представляет собой мышиное антитело-антибелок Е7 вирусного типа HPV16 и HPV18.

8. Способ по п. 3, в котором указанное первичное моноклональное антитело-антибелок р53 представляет собой мышиное моноклональное антитело к антибелку р53 человека, и указанное первичное моноклональное антитело-антибелок pRb представляет собой мышиное моноклональное антитело к антибелку pRb человека.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что обнаружение выполняется путем комбинированного использования антител-антибелков Е6, антител-антибелков Е7, антител антибелков р53 и антител-антибелков pRB, включающих следующие шаги в соответствии с методом Sandwich ELISA:

a) идентификация изучаемого образца, хранящегося в соответствии с требованиями к жидкофазной цитологии;

b) адсорбция в разных лунках микропланшета антител-антибелков Е6 и антибелков Е7 для захвата антител вирусного белка Е6 или Е7;

c) блокировка остальных участков лунок, связывающих белки с помощью блокирующего буфера;

d) дозирование непосредственно в каждую лунку указанного образца для анализа;

e) идентификация искомых белков путем инкубации с разбавленным антителом-антибелком р53 в лунках, адсорбированных с антителом-антибелком Е6 и разбавленным антителом-антибелком pRB в лунках, адсорбированных с антителом-антибелком Е7;

f) блокировка эндогенного субстрата;

g) инкубация в соответствующие лунки антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP);

h) дозирование раствора хромогена в каждую лунку

i) продукт реакции на стадии h) изучается по интенсивности света, обнаруживаемого при длине волны 450 нм с помощью спектрофотометра, при этом результаты, демонстрирующие окрашивание и подтвержденные положительной абсорбцией, показывают, что у обследуемой пациентки присутствует белковый комплекс Е6/р53 и/или E7/pRB, подтверждающий взаимодействие между белками вируса и человеческими белками, и, следовательно, наличие у обследуемой пациентки необратимого канцерогенеза.

10. Способ в соответствии со стадиями e), f), g) и h) по п. 9, в котором используются имеющиеся на рынке системы, позволяющие усиливать хромогенный сигнал, предпочтительно с использованием антител-антибелков р53 и pRB, биотинилированного и выделенного стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой или другим ферментом.

11. Способ по п. 9, в котором в случае отсутствия положительных результатов обнаружения и отсутствия абсорбции сигнала при длине волны 450 нм для обоих белковых комплексов Е6/р53 и E7/pRB результат указывает на то, что у обследуемой пациентки отсутствует интеграция вирусной ДНК с клеточной ДНК; однако не исключается возможность интеграции вирусной ДНК с клеточной ДНК.

12. Способ по п. 9, отличающийся тем, что первичное моноклональное антитело-антибелок Е6 представляет собой мышиное моноклональное антитело-антибелок Е6 вирусных типов HPV16 и HPV18, указанное первичное моноклональное антитело-антибелок Е7 представляет собой мышиное моноклональное антитело-антибелок Е7 вирусного типа HPV16, указанное первичное моноклональное антитело-антибелок р53 представляет собой моноклональное мышиное антитело к анти-р53-белку человека, указанное первичное моноклональное антитело-анти-pRb-белок представляет собой моноклональное мышиное антитело к анти-pRB-белку человека.

13. Способ обнаружения злокачественного перерождения клеток, вызываемого вирусом папилломы человека (ВПЧ) по любому из пп. 2-5 и 9-12, в соответствии с которым указанный способ используется в рамках скрининговой программы для женского населения или в программе ранней диагностики для выявления рака шейки матки после цитологической диагностики атипичных клеток плоского эпителия (ASC) или худшего диагноза и последующего положительного результата теста на ДНК ВР-ВПЧ.

14. Способ обнаружения злокачественного перерождения клеток, вызываемого вирусом папилломы человека (ВПЧ) по любому из пп. 2-5 и 9-12, в соответствии с которым указанный способ используется в рамках скрининговой программы для женского населения или в программе ранней диагностики для выявления рака шейки матки после положительного результата теста на ДНК ВР-ВПЧ и последующей цитологической диагностики атипичных клеток плоского эпителия (ASC) или худшего диагноза.

15. Способ обнаружения злокачественного перерождения клеток, вызываемого вирусом папилломы человека (ВПЧ) по любому из пп. 2-5 и 9-12, в соответствии с которым указанный способ используется в рамках диагностических мер, скрининга или последующего наблюдения за пациентами с опухолевыми поражениями, вызванными ВПЧ или подозреваемыми во внематочных областях, таких как анус-генитальная область, ротоглотка и т.д.