Claims (57)
1. Способ производства фактора свертывания крови, причем этот способ включает культивирование in vitro в бессывороточных условиях клетки-хозяина человека, трансфицированной, по меньшей мере, одной экзогенной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный фактор свертывания, причем клетка-хозяин человека выбрана из группы, состоящей из иммортализованной клетки из плаценты, иммортализованной клетки из амниотической мембраны и иммортализованной клетки из амниотической жидкости.1. A method of producing a coagulation factor, the method comprising culturing in vitro, in serum-free conditions, a human host cell transfected with at least one exogenous nucleic acid sequence encoding said coagulation factor, the human host cell being selected from the group consisting of from an immortalized cell from the placenta, an immortalized cell from the amniotic membrane and an immortalized cell from the amniotic fluid.
2. Способ по п. 1, в котором указанный фактор свертывания крови выбран из группы, состоящей из фибриногена (фактор I), протромбина (фактор II), тромбина, тканевого фактора (фактор III), лабильного фактора (фактор V), проконвертина (фактор VII), антигемофильного фактора (фактор VIII), фактора Кристмаса (фактор IX), фактора Стюарта-Прауэра (фактор X), плазменного тромбопластина (фактор XI), фактора Хагемана (фактор XII), фибрин-стабилизирующего фактора (трансамидаза или фактор XIIIa), фактора фон Виллебранда, прекалликреина (фактор Флетчера) с высокомолекулярным кининогеном (HMWK) и фибронектина.2. The method of claim 1, wherein said blood coagulation factor is selected from the group consisting of fibrinogen (factor I), prothrombin (factor II), thrombin, tissue factor (factor III), labile factor (factor V), proconvertin ( factor VII), antihemophilic factor (factor VIII), Christmas factor (factor IX), Stuart-Prauer factor (factor X), plasma thromboplastin (factor XI), Hageman factor (factor XII), fibrin-stabilizing factor (transamidase or factor XIIIa ), von Willebrand factor, prekallikrein (Fletcher factor) with high molecular weight kin inogen (HMWK) and fibronectin.
3. Способ по п. 1, в котором указанная клетка-хозяин человека является трансформированным первичным амниоцитом человека.3. The method of claim 1, wherein said human host cell is a transformed human primary amniocyte.
4. Способ по п. 3, в котором трансформированный первичный амниоцит человека является клеточной линией САР или САР-Т.4. The method of claim 3, wherein the transformed human primary amniocyte is a CAP or CAP-T cell line.
5. Способ по п. 1, в котором клетку-хозяин человека культивируют до плотности клеток выше 103 клеток на мл.5. The method of claim 1, wherein the human host cell is cultured to a cell density above 10 3 cells per ml.
6. Способ по п. 1, в котором никакие синтетические ингибитор(ы) протеазы не добавляются.6. The method of claim 1, wherein no synthetic protease inhibitor (s) are added.
7. Способ по п. 1, в котором клетка-хозяин человека трансфицирована экзогенной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей альфа-цепь фибриногена, экзогенной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей бета-цепь фибриногена, и экзогенной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей гамма-цепь фибриногена.7. The method of claim 1, wherein the human host cell is transfected with an exogenous nucleic acid sequence encoding a fibrinogen alpha chain, an exogenous nucleic acid sequence encoding a fibrinogen beta chain, and an exogenous nucleic acid sequence encoding a fibrinogen gamma chain.
8. Способ по п. 7, в котором альфа-цепь фибриногена включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:8. The method of claim 7, wherein the fibrinogen alpha chain comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of:
I) SEQ ID NO.: 3I) SEQ ID NO .: 3
II) подпоследовательность последовательности, определенной в I);Ii) a subsequence of the sequence defined in I);
III) последовательность, которая имеет по меньшей мере 85% идентичность нуклеотидной последовательности, приведенной в I) или II).III) a sequence that has at least 85% identity with the nucleotide sequence shown in I) or II).
9. Способ по п. 7, в котором бета-цепь фибриногена включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:9. The method of claim 7, wherein the fibrinogen beta chain comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of:
I) SEQ ID NO.: 7I) SEQ ID NO .: 7
II) подпоследовательность последовательности, определенной в I);Ii) a subsequence of the sequence defined in I);
III) последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 85% идентичность нуклеотидной последовательности, приведенной в I) или II).III) a sequence that has at least 85% identity with the nucleotide sequence shown in I) or II).
10. Способ по п. 7, в котором гамма-цепь фибриногена включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:10. The method according to p. 7, in which the gamma chain of fibrinogen comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of:
I) SEQ ID NO.: 11I) SEQ ID NO .: 11
II) подпоследовательность последовательности, определенной в I);Ii) a subsequence of the sequence defined in I);
III) последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 85% идентичность аминокислотной последовательности, приведенной в I) или II).III) a sequence that has at least 85% identity with the amino acid sequence shown in I) or II).
11. Способ по п. 1, в котором экзогенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:11. The method of claim 1, wherein the exogenous nucleic acid encodes a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:
I) SEQ ID NO: 13.: (протромбин человека М400А), SEQ ID NO: 15 (протромбин человека WT), SEQ ID NO: 17 (протромбин человека М84А) и SEQ ID NO: 19 (протромбин человека WT);I) SEQ ID NO: 13 .: (human prothrombin M400A), SEQ ID NO: 15 (human prothrombin WT), SEQ ID NO: 17 (human prothrombin M84A) and SEQ ID NO: 19 (human prothrombin WT);
II) подпоследовательность любой одной из последовательностей, определенных в I);Ii) a subsequence of any one of the sequences defined in I);
III) последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 85% идентичность аминокислотной последовательности, приведенной в I) или II).III) a sequence that has at least 85% identity with the amino acid sequence shown in I) or II).
12. Способ по п. 11, в котором указанная аминокислотная последовательность включает gla домен, kringle 1 и/или kringle 2.12. The method of claim 11, wherein said amino acid sequence comprises a gla domain, kringle 1 and / or kringle 2.
13. Способ по п. 1, в котором экзогенная нуклеиновая кислота кодирует аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состояющей из:13. The method of claim 1, wherein the exogenous nucleic acid encodes an amino acid sequence selected from the group consisting of:
I) SEQ ID NO: 21I) SEQ ID NO: 21
II) подпоследовательность последовательности, определенной в I);Ii) a subsequence of the sequence defined in I);
III) последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 85% идентичность с аминокислотной последовательностью, приведенной в I) или II).III) a sequence that has at least 85% identity with the amino acid sequence shown in I) or II).
14. Способ по п. 1, в котором экзогенная нуклеиновая кислота кодирует аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:14. The method of claim 1, wherein the exogenous nucleic acid encodes an amino acid sequence selected from the group consisting of:
I) SEQ ID NO.: 23I) SEQ ID NO .: 23
II) подпоследовательность последовательности, определенной в I);Ii) a subsequence of the sequence defined in I);
III) последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 85% идентичность с аминокислотной последовательностью, приведенной в I) или II).III) a sequence that has at least 85% identity with the amino acid sequence shown in I) or II).
15. Способ по п. 1, в котором указанная клетка-хозяин человека трансфицирована экзогенной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей А1-субъединицу фибриноген-стабилизирующего фактора, и экзогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей В-субъединицу фибриноген-стабилизирующего фактора.15. The method of claim 1, wherein said human host cell is transfected with an exogenous nucleic acid sequence encoding the A1 subunit of the fibrinogen-stabilizing factor and an exogenous nucleic acid sequence encoding the B-subunit of the fibrinogen-stabilizing factor.
16. Способ по п. 15, в котором А1-субъединица фибриноген-стабилизирующего фактора включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:16. The method according to p. 15, in which the A1 subunit of the fibrinogen-stabilizing factor comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of:
I) SEQ ID NO.: 25I) SEQ ID NO .: 25
II) подпоследовательность последовательности, определенной в I);Ii) a subsequence of the sequence defined in I);
II) последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 85% идентичность аминокислотной последовательности, приведенной в I) или II);II) a sequence that has at least 85% identity with the amino acid sequence shown in I) or II);
и В-субъединица фибриноген-стабилизирующего фактора включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:and the b-subunit of the fibrinogen-stabilizing factor includes an amino acid sequence selected from the group consisting of:
I) SEQ ID NO.: 27I) SEQ ID NO .: 27
II) подпоследовательность последовательности, определенной в I);Ii) a subsequence of the sequence defined in I);
III) последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 85% идентичность с аминокислотной последовательностью, представленной в I) или II).III) a sequence that has at least 85% identity with the amino acid sequence shown in I) or II).
17. Клетка-хозяин человека, выбранная из группы, состоящей из иммортализованной клетки из плаценты, иммортализованной клетки из амниона и иммортализованной клетки из амниотической жидкости, причем указанная клетка включает, по меньшей мере, одну экзогенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фактор свертывания крови, и способная производить указанный фактор свертывания крови.17. A human host cell selected from the group consisting of an immortalized cell from a placenta, an immortalized cell from an amnion, and an immortalized cell from an amniotic fluid, said cell comprising at least one exogenous nucleic acid sequence encoding a coagulation factor, and capable of producing the indicated coagulation factor.
18. Рекомбинантный фактор свертывания крови, полученный способом по п. 1.18. Recombinant coagulation factor obtained by the method according to p. 1.
19. Белковая композиция, включающая рекомбинантный фактор свертывания крови по п. 18, характеризующаяся тем, что19. A protein composition comprising a recombinant coagulation factor according to claim 18, characterized in that
III) указанная белковая композиция не содержит синтетических ингибиторов протеазы и/илиIII) said protein composition does not contain synthetic protease inhibitors and / or
IV) указанная белковая композиция не содержит сыворотки.Iv) said protein composition is serum free.
20. Белковая композиция по п. 19, которая дополнительно включает фактор V (активации) и фактор XIII (усиливающий коагуляцию).20. The protein composition according to claim 19, which further includes factor V (activation) and factor XIII (enhancing coagulation).
21. Белковая композиция, включающая в качестве рекомбинантного фактора свертывания крови рекомбинантный фибриноген и/или рекомбинантный протромбин по п. 18, которая может быть использована для местного применения и для предотвращения кровотечения, которое может возникнуть после восстановления сосудов, мышц, например, связанных с аортой, другими сосудами, питающих органы.21. A protein composition comprising, as a recombinant blood coagulation factor, recombinant fibrinogen and / or recombinant prothrombin according to claim 18, which can be used for topical application and to prevent bleeding that can occur after restoration of blood vessels, muscles, for example, associated with the aorta , other vessels that feed the organs.
22. Белковая композиция по п. 21, в которой указанная белковая композиция выполнена в виде клея, порошка (например, MPEG PLGA) или скаффолда.22. The protein composition according to claim 21, wherein said protein composition is in the form of glue, powder (for example, MPEG PLGA) or scaffold.
23. Белковая композиция, содержащая рекомбинантный протромбин, для местного применения.23. Protein composition containing recombinant prothrombin, for topical use.
24. Белковая композиция по п. 23, где указанная белковая композиция выполнена в виде порошка (MPEG ПЛГА+CaCl2), геля или скаффолда.24. The protein composition according to claim 23, wherein said protein composition is in the form of a powder (MPEG PLGA + CaCl 2 ), gel or scaffold.
25. Набор, включающий:25. A kit comprising:
(I) скаффолд, содержащий протромбин по п. 18, и(I) a scaffold containing prothrombin according to claim 18, and
(II) CaCl2.(II) CaCl 2 .
26. Скаффолд, содержащий рекомбинантный фактор свертывания крови по п. 18 и CaCl2, в котором указанный фактор свертывания крови представляет собой протромбин, причем протромбин и CaCl2 присутствует в различных частях или ячейках скаффолда.26. A scaffold containing the recombinant blood coagulation factor according to claim 18 and CaCl 2 , wherein said blood coagulation factor is prothrombin, wherein prothrombin and CaCl 2 are present in different parts or cells of the scaffold.
27. Применение рекомбинантного фактора свертывания крови по п. 18 для лечения или профилактики кровотечений, в качестве тканевого герметика или для облегчения присоединения тканей.27. The use of the recombinant coagulation factor according to claim 18 for the treatment or prevention of bleeding, as a tissue sealant or to facilitate tissue attachment.
28. Применение белковой композиции по любому из пп. 19-24 для лечения или профилактики кровотечений, в качестве тканевого герметика или для облегчения присоединения тканей.28. The use of the protein composition according to any one of paragraphs. 19-24 for the treatment or prevention of bleeding, as a tissue sealant, or to facilitate tissue adherence.