RU2007420C1

RU2007420C1 - Method of placental protein preparing

Info

Publication number: RU2007420C1
Authority: RU
Inventors: Ю.А. Калинин; Ю.С. Татаринов; А.А. Терентьев
Original assignee: Российский государственный медицинский университет
Priority date: 1991-06-21
Filing date: 1991-06-21
Publication date: 1994-02-15

Abstract

FIELD: biochemistry. SUBSTANCE: method involves fractionation of butanol extract of proteins from calf early chorion on immobilized Sepharose-Blue following by gel-filtration of eluate through Sephadex G-200. EFFECT: improved method of protein preparing.

Description

Изобретение относится к биологической химии и может быть использовано для выделения плацентарного протеина коровы (ППК-1). The invention relates to biological chemistry and can be used to isolate the placental protein of a cow (PPK-1).

В литературе этот белок не описан и способов его получения к настоящему времени в доступной патентной и медицинской литературе не найдено. In the literature, this protein is not described and methods for its preparation to date in the patent and medical literature are not found.

ППК-1 был выявлен в экстрактах ткани раннего хориона коровы (котиледоне) со сроком гестации до 12 недель. При иммунохимическом исследовании методом двойной радиальной иммунодиффузии ППК-1 отсутствовал в плазме быка, сыворотке крови стельной кровы и эмбриональной сыворотке, а также в экстрактах ткани матки, гипофиза, надпочечника, яичка, яичника, почки, печени, селезенки, легкого, сердца. Иммунохимически данный антиген был обнаружен в тканях плаценты (котиледоне и карункуле) на всем протяжении гестации, причем содержание его в ранней плаценте превышало содержание в терминальной в 8-10 раз. На ранних сроках гестации ППК-1 обнаруживался в равных количествах как в материнской, так и в плодной частях плаценты. PPK-1 was detected in tissue extracts of the early cow chorion (cotyledon) with gestational age up to 12 weeks. In an immunochemical study using double radial immunodiffusion, PPK-1 was absent in bovine plasma, serum of the blood of the blood and fetal serum, as well as in extracts of uterine tissue, pituitary, adrenal gland, testicle, ovary, kidney, liver, spleen, lung, heart. Immunochemically, this antigen was found in placental tissues (cotyledon and caruncle) throughout the course of gestation, and its content in the early placenta exceeded the content in the terminal placenta by 8-10 times. In the early stages of gestation, PPK-1 was found in equal amounts in both the maternal and fetal parts of the placenta.

Содержание его в этих тканях составило около 4 мг на 100 г ткани ранней плаценты. Its content in these tissues was about 4 mg per 100 g of tissue of the early placenta.

Полученные данные позволяют предположить, что ППК-1 является плацента-специфическим антигеном и может быть использован как маркер для ранней диагностики тельности коровы и мониторинга гестации этого животного. Решению этой задачи будет способствовать создание высокочувствительного иммуноферментного метода определения ППК-1 в биологических жидкостях и тканях на основе очищенного препарата этого белка. The data obtained suggest that PPK-1 is a placenta-specific antigen and can be used as a marker for the early diagnosis of cow activity and monitoring gestation of this animal. The creation of a highly sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for determining PPK-1 in biological fluids and tissues based on a purified preparation of this protein will contribute to this task.

Для получения моноспецифических поликлональных антисывороток к ППК-1 ткань раннего хориона коровы (котиледон) гомогенизировали с равным объемом трис-глицинового буфера (0,05 М, рН 8,5), добавляя 0,1% раствор тритона Х-100, троекратно замораживали и оттаивали, центрифугировали, супернатант диализовали 48 ч против 01, М аммоний-бикарбонатного буфера и лиофилизировали. Беспородных кроликов-самцов иммунизировали пятикратно, с интервалом в 3 дня, вводя каждому животному подкожно по 100 мг препарата белков раннего хориона коровы в смеси с полным адъювантом Фрейнда. Реиммунизацию проводили на 30-й день после последней иммунизации, вводя каждому животному по 100 мг препарата белка без адъюванта. Кровь брали на 7-й, 10-й и 13-й дни после реиммунизации. Антисыворотки абсорбировали плазмой быка, экстрактами почки, печени, селезенки. С помощью полученных таким образом антисывороток в ткани ранней плаценты коровы был идентифицирован антиген с подвижностью альфа_о-глобулина в агаровом геле.To obtain monospecific polyclonal antisera to PPK-1, early cow chorion tissue (cotyledon) was homogenized with an equal volume of Tris-glycine buffer (0.05 M, pH 8.5), adding 0.1% X-100 triton solution, frozen three times and thawed, centrifuged, the supernatant was dialyzed for 48 hours against 01, M ammonium bicarbonate buffer and lyophilized. Outbred male rabbits were immunized five times, with an interval of 3 days, injecting each animal subcutaneously with 100 mg of the protein preparation of the early chorion of the cow mixed with complete Freund's adjuvant. Reimmunization was carried out on the 30th day after the last immunization, introducing to each animal 100 mg of protein preparation without adjuvant. Blood was taken on the 7th, 10th and 13th days after reimmunization. Antisera were absorbed by bovine plasma, extracts of the kidney, liver, and spleen. Using the antisera obtained in this way, the antigen with alpha-α _- globulin mobility in agar gel was identified in the tissue of the early placenta of the cow.

Целью изобретения является получение очищенного препарата плацентарного протеина коровы-1, достигаемое следующим образом: плодную часть (котиледон) 10-12-недельной плаценты коровы гомогенизируют с равным количеством 0,05 М трис-глицинового буфера рН 8,5, гомогенат обрабатывают 5-10% -ным раствором бутилового спирта, центрифугируют, супернатант подвергают аффинной хроматографии на иммобилизованном цибакрон-синем красителе, связавшиеся белки элюируют 2,0 М раствором хлорида натрия в смеси с 5% -ным бутиловым спиртом, элюат осаждают при 90% насыщении сульфатом аммония, центрифугируют и осадок фракционируют на колонке с сефадексом G-200 в 0,1 М аммоний-бикарбонатном буфере рН 8,15, фракции, содержащие целевой продукт, собирают и лиофилизируют, получая препарат ППК-1 50% -ной степени чистоты. The aim of the invention is to obtain a purified preparation of placental protein of cow-1, achieved as follows: the fetal part (cotyledon) of a 10-12-week-old placenta of the cow is homogenized with an equal amount of 0.05 M Tris-glycine buffer pH 8.5, the homogenate is treated with 5-10 with a butyl alcohol solution, centrifuged, the supernatant is subjected to affinity chromatography on an immobilized cybacron blue dye, the bound proteins are eluted with a 2.0 M sodium chloride solution mixed with 5% butyl alcohol, the eluate is precipitated at 90% saturation and ammonium sulfate, centrifuged and the precipitate was fractionated on a Sephadex G-200 column in 0.1 M ammonium bicarbonate pH 8.15 buffer, fractions containing the target product were collected and lyophilized to obtain a PPK-1 preparation of 50% purity .

Сорбент синтезировали следующим образом. 100 мл сефарозы 6В отмывали на фильтре 1 л дистиллированной воды, слегка отжимали, переносили в химический стакан, заливали 100 мл ацетона, добавляли 1,5 г трихлортриазина, тщательно перемешивали, ставили на магнитную мешалку и при медленном перемешивании добавляли по каплям 10% -ный раствор едкого натра, выжидали 5 мин и прекращали реакцию, добавляя к смеси 50 мл 50% -ного раствора уксусной кислоты. The sorbent was synthesized as follows. 100 ml of Sepharose 6B was washed on the filter with 1 L of distilled water, slightly squeezed, transferred to a beaker, 100 ml of acetone was added, 1.5 g of trichlorotriazine was added, thoroughly mixed, put on a magnetic stir bar and 10% was added dropwise with slow stirring. caustic soda solution, wait 5 minutes and stop the reaction by adding 50 ml of a 50% solution of acetic acid to the mixture.

Полученную проактивированную сефарозу омывали на фильтре от несвязавшегося трихлортриазина и других продуктов реакции 1 л 50% -ного водного раствора ацетона и дополнительно 1 л дистиллированной воды. The obtained proactivated sepharose was washed on the filter from unbound trichlorotriazine and other reaction products with 1 liter of a 50% aqueous solution of acetone and an additional 1 liter of distilled water.

Далее сефарозу переносили в химический стакан, добавляли 100 мл дистиллированной воды и 2 г гексаметилендиамина, ставили на магнитную мешалку на ночь при медленном перемешивании. На следующий день полученный продукт отмывали 3 л дистиллированной воды на фильтре, слегка отжимали, перемещали в химическую колбу, добавляли 1 г цибакрон-синего красителя и 1 г карбоната натрия, смесь тщательно перемешивали и помещали в сушильный шкаф при 80^оС на 6 ч. По окончании термической обработки смесь помещали на фильтр и тщательно отмывали 2 л подогретого до 80^оС 2 М раствора хлорида натрия, 2 л дистиллированной воды, еще раз 2 л подогретого до 80^оС 2 М раствора хлорида натрия и 2 л дистиллированной воды, после чего сорбент был готов к употреблению.Next, Sepharose was transferred into a beaker, 100 ml of distilled water and 2 g of hexamethylenediamine were added, and placed on a magnetic stirrer overnight with slow stirring. The next day, the resulting product was washed with 3 liters of distilled water on the filter, lightly squeezed, transferred to a chemical flask was added 1 g tsibakron blue dye and 1 g of sodium carbonate, the mixture was thoroughly mixed and placed in an oven at 80 ° ^C for 6 hours. At the end of the heat treatment, the mixture was placed on the filter and thoroughly washed with 2 L of sodium chloride, heated to 80 ^° C, 2 L of distilled water, 2 liters of sodium chloride, heated to 80 ^° C again, and 2 L of distilled water, after what the sorbent was ready for consumption.

Новым в предлагаемом способе является то, что для выделения и очистки из сложной белковой смеси ранее неизвестного белка - плацентарного протеина коровы - 1 использован биоспецифический для данного белка лиганд - цибакрон-синий краситель, иммобилизованный на нерастворимой матрице - сефарозе, причем элюат, содержащий ППК-1 фракционируют на колонке с сефадексом G-200 в летучем буфере, решая тем самым одновременно две задачи: дополнительной очистки и диализа. Кроме того, обработка исходного материала бутиловым спиртом позволяет добиться более полной экстракции белка, частичной денатурации балластных белков и упрощает процедуру первичной обработки ткани плаценты, заменяя обычную в таких случаях троекратную заморозку и оттаивание часовой инкубацией гомогената при 4^оС.New in the proposed method is that for isolation and purification from a complex protein mixture of a previously unknown protein - the placental protein of a cow - 1, a ligand biospecific for this protein is used - a cybacron blue dye immobilized on an insoluble matrix - sepharose, and the eluate containing PPA- 1 fractionated on a column with Sephadex G-200 in a volatile buffer, thereby simultaneously solving two problems: additional purification and dialysis. In addition, treatment of the starting material butyl alcohol allows to achieve a more complete extraction of the protein, the partial denaturation of proteins and facilitates ballast preprocessing procedure placental tissue, replacing the conventional in such cases three times the freezing and thawing of the homogenate hour incubation at 4 ° ^C.

Для достижения цели изобретения выбраны и обоснованы параметрические значения способа. Так, при обработке гомогената плаценты бутиловым спиртом концентрацией менее 5% наблюдалась неполная экстракция белка, при концентрации бутилового спирта более 10% наблюдалась частичная денатурация ППК-1. To achieve the objective of the invention, the parametric values of the method are selected and justified. So, when processing the placenta homogenate with butyl alcohol with a concentration of less than 5%, incomplete protein extraction was observed, with a butyl alcohol concentration of more than 10%, partial denaturation of PPK-1 was observed.

Для аффинной хроматографии ППК-1 на иммобилизованном цибакрон-синем красителе оптимальным значением кислотности буфера, при котором сорбция белка была максимальной, оказалось рН 8,0-9,0 и молярность трис-НСl буфера 0,04-0,06; при уменьшении минимального значения рН ниже 8,0 наблюдалось уменьшение количества сорбируемого белка, при увеличении более 9,0 наблюдалась повышенная сорбция балластных белков, что уменьшало чистоту препарата. Изменение молярности трис-НСl буфера более 0,06 приводило к уменьшению сорбции белка на сорбенте и, соответственно к снижению выхода целевого продукта; при молярности трис-НСl буфера менее 0,04 наблюдалась повышенная сорбция балластных белков, что уменьшало чистоту препарата. При элюции связавшихся белков наиболее полная десорбция последних была достигнута при использовании 2,0 М раствора хлорида натрия в смеси с 5% -ным бутиловым спиртом, при этом использование для элюции только 2,0 М раствора хлорида натрия приводило к неполной десорбции белка, аналогичный результат наблюдался при использовании в качестве элюента 4,0 М раствора хлорида натрия. For affinity chromatography PPK-1 on an immobilized cybacron-blue dye, the optimal pH value of the buffer, at which protein sorption was maximum, was pH 8.0-9.0 and the molarity of Tris-HCl buffer 0.04-0.06; with a decrease in the minimum pH value below 8.0, a decrease in the amount of sorbed protein was observed; with an increase of more than 9.0, increased sorption of ballast proteins was observed, which reduced the purity of the drug. Changing the molarity of Tris-Hcl buffer more than 0.06 led to a decrease in protein sorption on the sorbent and, accordingly, to a decrease in the yield of the target product; with a Tris-HCl buffer molarity less than 0.04, increased sorption of ballast proteins was observed, which reduced the purity of the preparation. When eluting bound proteins, the most complete desorption of the latter was achieved using a 2.0 M solution of sodium chloride mixed with 5% butyl alcohol, while using only a 2.0 M solution of sodium chloride for elution led to incomplete desorption of the protein, a similar result was observed when using a 4.0 M sodium chloride solution as eluent.

П р и м е р 1. 100 г ткани 10-12-недельной плаценты коровы (котиледон)гомогенизируют со 100 мл 0,05 М трис-глицинового буфера рН 8,5 и к гомогенату добавляют 5% -ный бутиловый спирт (конечная концентрация). Смесь инкубируют 1 ч при 4^оС, центрифугируют, супернатант диализуют 24 ч против дистиллированной воды при 4^оС и 24 ч против 0,04 М трис-НСl буфера рН 8,0. Диализат повторно центрифугируют и используют в аффинной хроматографии на колонке, уравновешенной тем жем буфером и заполненной сефарозой с имобилизованным цибакрон-синим красителем. После отмывки сорбента от несвязавшихся белков проводят элюцию 2,0 М раствором хлорида натрия в смеси с 5% -ным бутиловым спиртом. Элюат осаждают при 90% насыщении сульфатом аммония в течение 12 ч при 4^оС, центрифугируют 45 мин со скоростью 8000 об/мин, осадок растворяют в минимальном объеме дистиллированной воды и фракционируют в колонке с сефадексом G-200, уравновешенном 0,1 М аммоний-бикарбонатным летучим буфером рН 8,15, фракции, содержащие ППК-1 собирают и лиофилизируют, получая 0,7 мг белка. Содержание ППК-1 40% , выход 7% .PRI me R 1. 100 g of tissue of a 10-12-week-old cow placenta (cotyledon) is homogenized with 100 ml of 0.05 M Tris-glycine buffer pH 8.5 and 5% butyl alcohol is added to the homogenate (final concentration ) The mixture was incubated for 1 h at ⁴ ° C, centrifuged, the supernatant was dialyzed 24 hours against distilled water at 4 ^{° C} and 24 hours against 0.04M Tris-HCl buffer pH 8.0. The dialysate is re-centrifuged and used in affinity chromatography on a column equilibrated with the same buffer and filled with Sepharose with immobilized cybacron blue dye. After washing the sorbent from unbound proteins, elution is carried out with a 2.0 M sodium chloride solution mixed with 5% butyl alcohol. The eluate was precipitated with 90% saturated ammonium sulfate for 12 hours at ⁴ ° C, centrifuged 45 min at 8000 rev / min, the precipitate was dissolved in a minimum volume of distilled water and fractionated in a column of Sephadex G-200 equilibrated with 0.1 M ammonium -Bicarbonate volatile buffer pH 8.15, fractions containing PPK-1 are collected and lyophilized to obtain 0.7 mg of protein. The content of PPK-1 is 40%, the yield is 7%.

П р и м е р 2. Ткань плаценты обрабатывают как в примере 1. Аффинную хроматографию проводят в 0,06 М трис-НСl буфере рН 9,0. Элюцию и дальнейшие процедуры осуществляют как в примере 1. Получают 1,0 мг белка с содержанием ППК-1 35% . Выход 8,75% . PRI me R 2. The placental tissue is treated as in example 1. Affinity chromatography is carried out in 0.06 M Tris-Hcl buffer pH 9.0. Elution and further procedures are carried out as in example 1. Obtain 1.0 mg of protein with a content of PPC-1 35%. Yield 8.75%.

П р и м е р 3. Ткань плаценты обрабатывают как в примере 1. Аффинную хроматографию проводят в 0,05 М трис-НСl буфере, рН 8,5. Элюцию и дальнейшие процедуры как в примере 1. Получают 0,8 мг белка, содержание ППК-1 50% , выход 10% . PRI me R 3. The placental tissue is treated as in example 1. Affinity chromatography is carried out in 0.05 M Tris-Hcl buffer, pH 8.5. Elution and further procedures as in example 1. Obtain 0.8 mg of protein, the content of PPC-1 50%, yield 10%.

Предлагаемый способ является оригинальным способом выделения нового белка - плацентарного протеина коровы-1. The proposed method is an original way of isolating a new protein - placental protein of cow-1.

При изучении физико-химических свойств ППК-1 установлено, что данный белок обладает электрофоретической подвижностью (относительно альбумина) - 1,0, молекулярной массой в гель-фильтрации около 110 кД. Белок содержит углеводы при окрашивании дуги преципитации по методу Шиффа и осаждается сульфатом аммония при 65% насыщения. When studying the physicochemical properties of PPK-1, it was found that this protein has an electrophoretic mobility (relative to albumin) of 1.0, and a molecular weight in gel filtration of about 110 kD. The protein contains carbohydrates when staining the precipitation arc according to the Schiff method and precipitates with ammonium sulfate at 65% saturation.

Данные иммунохимического анализа, а также физико-химические свойства ППК-1 позволяют предположить, что этот белок неидентичен альфа-фетопротеину коровы, имеющему мол. м. около 70 кД и встречающемуся в больших количествах в эмбриональной сыворотке; фетуину эмбриональной сыворотки; трофобластическому протеину коровы, имеющему мол. м. 22-24 кД; коровьему высокомолекулярному гликопротеину с молекулярной массой около 700 кД; протеину В, имеющему мол. м. 47-53 кД; сывороточному гликопротеину, ассоциированному с ранней беременностью, имеющему молекулярную массу 70 кД и найденному в сыворотке стельных коров. The data of immunochemical analysis, as well as the physicochemical properties of PPK-1, suggest that this protein is not identical to cow alpha-fetoprotein having a mole. m. about 70 KD and found in large quantities in fetal serum; fetuin fetal serum; trophoblastic protein of a cow having a mol. m. 22-24 kD; high molecular weight glycoprotein with a molecular weight of about 700 kD; protein b having a mol. m. 47-53 kD; serum glycoprotein associated with early pregnancy, having a molecular weight of 70 kDa and found in the serum of pregnant cows.

Поскольку в настоящее время нет надежного диагностического теста для раннего определения стельности у коров, разработка оригинального способа выделения ППК-1 и получение к нему антисыворотки представляется актуальной научной задачей, так как данный белок выявлен в ткани ранней плаценты и разработка высокочувствительного иммуноферментного метода определения ППК-1 в сыворотке крови стельных коров на основе очищенного препарата данного белка позволит получить диагностический тест для ранней диагностики гестации и ее мониторинга. Кроме того, способ получения очищенного препарата ППК-1 позволит получить очищенный плацентарный протеин коровы-1 для выяснения биологических свойств данного белка с целью последующего использования его как ветеринарного препарата. (56) ЕР N 0206181, кл. С 07 К 13/00, С 12 N 15/006, 1987. Since there is currently no reliable diagnostic test for early determination of pregnancy in cows, the development of an original method for isolating PPK-1 and obtaining antiserum for it is an urgent scientific task, since this protein was detected in early placenta tissue and the development of a highly sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for determining PPK-1 in the blood serum of pregnant cows on the basis of a purified preparation of this protein will allow to obtain a diagnostic test for early diagnosis of gestation and its monitoring. In addition, the method of obtaining a purified preparation of PPK-1 will allow to obtain a purified placental protein of cow-1 to elucidate the biological properties of this protein with a view to its subsequent use as a veterinary preparation. (56) EP N 0206181, CL C 07 K 13/00, C 12 N 15/006, 1987.

Claims

METHOD FOR PRODUCING PLACENTAL PROTEIN, including tissue homogenization, alcohol treatment, centrifugation, supernatant dialysis, centrifugation and chromatography followed by elution, characterized in that the tissue of the early placental placenta is homogenized, treatment is carried out with 5-10% butyl alcohol, dialysis is carried out against 0 , 04 - 0.06 M Tris-HCI buffer pH 8.0 - 9.0, affinity chromatography on sepharose with immobilized cybacron blue dye is used from chromatography, elution is carried out with a 2.0 M chloride solution sodium mixed with 5% butyl alcohol, the eluate is further precipitated at 90% saturation with ammonium sulfate, centrifuged and the precipitate is fractionated on Sephadex G = 200 in 0.1 M ammonium bicarbonate buffer pH 8.5, fractions containing target product, collected and lyophilized.