RU2004250C1 - Способ выделени антигена 6 возбудител мелиоидоза - Google Patents

Description

ции, полученные методом аффинной хроматографии на иммуносорбенте с МКА против АГ6. В продольные канавки внесены поли- клональные сыворотки против:

а, г - АГ6

б - антигенов обеззараженных ацетоном и высушенных микробных клеток P.mallel 10230.

в - антигенов обеззараженных ацетоном -и высушенных микробных клеток Р. pseudomallel VPA. .

Установлено, что наиболее интенсивное присоединение ТКА против АГ6 к гелю происходит в течение первых 20 мин, через 40 мин оно достигает почти 95%, а через 120 мин практически заканчиваетс . Поэтому оптимальное врем  коньюгировани  МКА с активированным гелем равно 40-120 мин.

П р и м е р 2. Определение оптимальных концентраций МКА 2 F 11, конъюгирован- ных с активированным гелем. При подборе оптимальных концентраций МКА 2 F11, необходимых дл  приготовлени  активного иммуносорбента, активированный гель конъюгировали с различными количествами иммуноголобулина при общеприн тых значени х рН среды (7,5-9,5). Затем производи- ли расчет эффективности ковалентного св зывани  МКА с сефарозой (см. табл. 1).

Как следует из данных таблицы, наибо- лее эффективное св зывание МКА 2 F11 с активированным гелем осуществл етс  при рН среды 8,2-8,5 и концентрации антител от 3 до 6 мг на 1 мл сефарозы. Снижение кон- центрации МКА до 1,5 мг уменьшает эффек- тивность св зывани  более, чем на 10%. Увеличение рН среды до 9,5, т.е. предельно допустимого значени , незначительно по- вышае-т скорость св зывани  МКА с сорбентом , но не вли ет на эффективность этого процесса (81%).

Поэтому дл  конкретных МКА оптимальными услови ми конъюгировани  с активированной сефарозй  вл етс  следующие:

концентраци  иммуноглобулинов - 3-6 мг на 1 мл гел ;

рН среды конъюгировани  - 8,2-8,5

Пример 3. Изучение условий десорбции специфического антигена с колонки с иммуносорбентом. Разрушение иммунных комплексов с целью э/уоировани  с колонок специфических антигоенов производ т рйз- нообразными по химическому составу буферными .растворами с -широкими диапазоном рН от 2,2 до 11,5.

Оптимальные результаты получены при десорбции АГ06 0,2 М голицин-НС буфером , рН 2,8, с„0,5 М NaCI. Так, с колонки,

объемом 17,5 мл иммуносорбента, нагруженной 4.8 мг Сахаров водко-солевого экстракта Pf pseudomallel 57576, данным буфером элюировали 0,2 мг очищенного АГ6, что составл ло 4,2% выхода от суммарной концентрации Сахаров в исходной анти- гоеннй смеси. В случае снижени  рН глицин-HCI буфера до 2,2 результаты опытов были сопоставлены с приведенными выше данными, однако пригодность иммуносорбента дл  повторного использовани  резко падала вследствие денатурирующего воздействи  более кислой среды на МКА, иммобилизованные на гранулах сорбента . Такой же эффект был отмечен и при использовании щелочного глицин-NaOH буфера , рН 11,5. Поэтому наиболее пригодным дл  десорбции АГб признан глицин-HCI буфер, рН 2,8.

Пример 4. Иммунохимическа  характеристика очищенного АГ06.

Гомогенность и специфическа  активность очищенного АГ6 подтверждена с помощью реакции иммунодиффузии в геле с поликлональной кроличьей сывороткой против антигенов возбудител  мелиоидоза и преципитирующими моноклинальными антителами против АГ6. В обоих случа х зарегистрирована одна лини  приципитата.

Очищенный образец идентифицирован с помощью референтной системы антигенов возбудител  мелиодоза в иммуноэлект- рофорезе. Выделенный антиген по всем критери м схемы Вивн  Н.Н., Илюхина В,И. соответствовал АГ6.

Таким образом, предлагаемый способ очистки АГб возбудител  мелиоидоза с по- мчощью моноклонального иммуносорбента позвол ет в процессе контакта смеси различных антигенов с сорбентом и посл.едую- щей десорбции с негооспецифического антигена быстро и эффективно выдел ть им- мунохимически гомогенный АГ6, пригодный дл  последующего использовани  в имму- нохимических исследовани х.

(56) Лозовой Н.В. Химические и биологические свойства антигенов возбудител  мелиоидоза // Тез. докл. научи, конф. молодых науч. сотрудников, Ростов-на-Дону . - 1964, с. 53-54.

Журнал микробиологи , эпидемиологи  и микробиологи . -1981, № 4, с. 78-82.

Ярулин Р.Г., Фарбер „С.М, В кн. Особо опасные инфекционные заболевани : диагностика , профилактика и биологические свойства возбудителей. Сб, науч. работ, Волгоград. 1989, вып. 4, с. 142-145.

Степень иммобилизации МКА на носителе при изменении нагрузки белка рН среды

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНА 6 ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА из антигенной смеси, отличающийс  тем, что, с целью повышени  чистоты антигена, антигенную смесь пропускают через колонку с сорбентом CNBr-сефароза 4В, конъюгиро%90

   О 5 10 15 20 25 3Q 35 40 45 50 55 60

   Врем ,мин

   Фиг 1

   ванным с моноклональными антителами против антигена 6 мелиоидоза, в течение 40 - 120 мин при концентрации антител 3 - 6 мг/мл гел  и рН среды 8,2 - 8,5 с последующей десорбцией антигена глицин-НС буфером рН - 2,8.

   а S

   CSD4

   8 зг

   Фиг. 2