Claims (43)
1. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид NOS, выбранный из группы, состоящей из конститутивно активного полипептида NOS; полипептида NOS, имеющего повышенную скорость продуцирования NO; и полипептида NOS, имеющего повышенную редуктазную активность.1. An isolated nucleic acid molecule encoding a NOS polypeptide selected from the group consisting of a constitutively active NOS polypeptide; an NOS polypeptide having an increased rate of production of NO; and an NOS polypeptide having increased reductase activity.
2. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где указанный полипептид NOS содержит замененный аминокислотный остаток, соответствующий остатку 1179 бычьего eNOS, остатку 1177 человеческого eNOS, остатку 1412 крысиного nNOS или остатку 1415 человеческого nNOS.2. The isolated nucleic acid molecule according to claim 1, wherein said NOS polypeptide contains a substituted amino acid residue corresponding to a bovine eNOS residue 1179, a human eNOS residue 1177, a rat nNOS residue 1412, or a human nNOS residue 1415.
3. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты по п.2, где указанный замененный аминокислотный остаток, соответствующий остатку 1179 бычьего eNOS, остатку 1177 человеческого eNOS, остатку 1412 крысиного nNOS или остатку 1415 человеческого nNOS, имитирует фосфосерин.3. The isolated nucleic acid molecule of claim 2, wherein said substituted amino acid residue corresponding to bovine eNOS residue 1179, human eNOS residue 1177, rat nNOS residue 1412 or human nNOS residue 1415 mimics phosphoserine.
4. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты по п.2, где серин, соответствующий остатку 1179 бычьего eNOS, остатку 1177 человеческого eNOS, остатку 1412 крысиного nNOS или остатку 1415 человеческого nNOS, заменен на остаток аспарагиновой кислоты или остаток глутаминовой кислоты.4. The isolated nucleic acid molecule of claim 2, wherein the serine corresponding to bovine eNOS residue 1179, human eNOS residue 1177, rat nNOS residue 1412, or human nNOS residue 1415 is replaced by an aspartic acid residue or a glutamic acid residue.
5. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты по п.2, где указанная замененная аминокислота содержит группу R, которая имитирует фосфатную группу.5. An isolated nucleic acid molecule according to claim 2, wherein said substituted amino acid contains an R group that mimics a phosphate group.
6. Полипептид, который кодируется изолированной молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-5.6. The polypeptide that is encoded by an isolated nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 5.
7. Изолированный полипептид NOS, выбранный из группы, состоящей из конститутивно активного полипептида NOS, полипептида NOS с повышенной скоростью продуцирования NO и полипептида NOS, с повышенной редуктазной активностью.7. An isolated NOS polypeptide selected from the group consisting of a constitutively active NOS polypeptide, an NOS polypeptide with an increased production rate of NO, and an NOS polypeptide with increased reductase activity.
8. Полипептид NOS по п.7, который содержит замененный аминокислотный остаток, соответствующий остатку 1179 бычьего eNOS, остатку 1177 человеческого eNOS, остатку 1412 крысиного nNOS или остатку 1415 человеческого nNOS.8. The NOS polypeptide according to claim 7, which contains a substituted amino acid residue corresponding to bovine eNOS residue 1179, human eNOS residue 1177, rat nNOS residue 1412, or human nNOS residue 1415.
9. Конститутивно активный eNOS по п.8, где указанные замененные аминокислоты были заменены на остаток аспарагиновой кислоты или остаток глутаминовой кислоты.9. The constitutively active eNOS of claim 8, wherein said substituted amino acids were replaced with an aspartic acid residue or a glutamic acid residue.
10. Способ стимуляции развития коронарного коллатерального сосуда у пациента, включающий стадию доставки трансгена, кодирующего полипептид по п.7 или полипептид Akt, способом, эффективным для стимуляции развития коронарного коллатерального сосуда.10. A method of stimulating the development of a coronary collateral vessel in a patient, comprising the step of delivering a transgene encoding the polypeptide according to claim 7 or the Akt polypeptide in a manner effective to stimulate the development of a coronary collateral vessel.
11. Способ по п.10, где указанный трансген экспрессируется с промотора специфичного для вентикулярного миоцита, промотора, специфичного для клеток гладкой мускулатуры, или промотора специфичного для эндотелиальных клеток.11. The method of claim 10, wherein said transgene is expressed from a promoter specific for ventricular myocyte, a promoter specific for smooth muscle cells, or a promoter specific for endothelial cells.
12. Способ по п.11, где указанный промотор специфичный для вентикулярного миоцита имеет последовательность промотора легкой цепи 2 вентрикулярного миозина или тяжелой цепи миозина.12. The method according to claim 11, where the specified promoter is specific for a ventricular myocyte has the sequence of the promoter of the light chain 2 of the ventricular myosin or myosin heavy chain.
13. Способ стимуляции развития сосудов у пациента, имеющего заболевание, связанное с дефицитом периферических сосудов, где указанный способ включает стадию доставки трансгена, кодирующего полипептид по п.7 или полипептид Akt, в периферическую сосудистую систему пациента способом, эффективным для стимуляции развития периферических сосудов.13. A method of stimulating vascular development in a patient having a disease associated with peripheral vascular deficiency, wherein said method comprises the step of delivering a transgene encoding the polypeptide of claim 7 or the Akt polypeptide to the patient's peripheral vascular system in a manner effective to stimulate the development of peripheral vessels.
14. Способ лечения ишемии миокарда, включающий стадию доставки трансгена, кодирующего полипептид по п.7 или полипептид Akt, в миокард способом, эффективным для лечения ишемии миокарда.14. A method of treating myocardial ischemia, comprising the step of delivering a transgene encoding the polypeptide of claim 7 or the Akt polypeptide to the myocardium in a manner effective for treating myocardial ischemia.
15. Способ по п.14, где экспрессия указанного трансгена ограничена кардиальными миоцитами.15. The method according to 14, where the expression of the specified transgene is limited to cardiac myocytes.
16. Способ по п.15, где экспрессия указанного трансгена ограничена миоцитами желудочков сердца.16. The method according to clause 15, where the expression of the specified transgene is limited by ventricular myocytes of the heart.
17. Способ по любому из пп.10-16, где указанный трансген кодируется дефектным по репликации вектором.17. The method according to any one of claims 10-16, wherein said transgene is encoded by a replication defective vector.
18. Способ по п.17, где указанным дефектным по репликации вектором является аденовирус.18. The method of claim 17, wherein said replication defective vector is an adenovirus.
19. Способ по любому из пп.10-16, где указанный трансген транфецирован в клетку in vitro.19. The method according to any one of claims 10-16, wherein said transgene is transfected into an in vitro cell.
20. Способ по п.19, где указанные трансфецированные клетки доставляются пациенту.20. The method according to claim 19, where these transfected cells are delivered to the patient.
21. Трансгенное животное, не являющееся человеком, которое экспрессирует полипептид по п.7.21. A transgenic non-human animal that expresses the polypeptide of claim 7.
22. Способ идентификации агента, который модулирует Akt-регулируемую активность NOS, включающий стадии: (a) экспонирования NOS-экспрессируеющей клетки агентом; и (b) измерения Akt-регулируемой активности NOS, и тем самым идентификацию агента, который модулирует Akt-регулируемую активность NOS.22. A method for identifying an agent that modulates Akt-regulated NOS activity, comprising the steps of: (a) exposing an NOS-expressing cell to an agent; and (b) measuring Akt-regulated NOS activity, and thereby identifying an agent that modulates Akt-regulated NOS activity.
23. Способ по п.22, где стадия (b) включает определение состояния фосфорилирования NOS по аминокислотному остатку, соответствующего остатку 1179 бычьего eNOS, остатку 1177 человеческого eNOS, остатку 1412 крысиного nNOS или остатку 1415 человеческого nNOS.23. The method of claim 22, wherein step (b) comprises determining a NOS phosphorylation state by an amino acid residue corresponding to a bovine eNOS residue 1179, a human eNOS residue 1177, a rat nNOS residue 1412, or a human nNOS residue 1415.
24. Способ по п.23, где NOS активирован указанным агентом.24. The method according to item 23, where NOS is activated by the specified agent.
25. Способ по п.24, где указанный агент имитирует Akt-опосредованное фосфорилирование eNOS.25. The method according to paragraph 24, where the specified agent mimics the Akt-mediated phosphorylation of eNOS.
26. Способ по п.25, где указанный агент ингибирует дефосфорилирование аминокислотного остатка, соответствующего остатку 1179 бычьего eNOS, остатку 1177 человеческого eNOS, остатку 1412 крысиного nNOS или остатку 1415 человеческого nNOS.26. The method of claim 25, wherein said agent inhibits dephosphorylation of the amino acid residue corresponding to bovine eNOS residue 1179, human eNOS residue 1177, rat nNOS residue 1412, or human nNOS residue 1415.
27. Способ по п.22, где стадия (b) включает измерение продуцирования NO.27. The method according to item 22, where stage (b) includes measuring the production of NO.
28. Способ по п.27, где NO детектируют путем измерения концентрации нитрита или превращения 3H-L-аргинина в 3H-L-цитруллин.28. The method according to item 27, where NO is detected by measuring the concentration of nitrite or the conversion of 3 HL-arginine to 3 HL-citrulline.
29. Способ идентификации in vitro агента, который модулирует Akt-регулируемую активность eNOS, включающий стадии: (a) экспонирования белка или пептида Akt и NOS агентом; и (b) измерения Akt-регулируемой активности eNOS.29. A method of identifying an in vitro agent that modulates Akt-regulated eNOS activity, comprising the steps of: (a) exposing an Akt protein or peptide and an NOS agent; and (b) measuring Akt-regulated eNOS activity.
30. Способ по п.29, где активность NOS измеряют путем определения Akt-зависимого состояния фосфорилирования NOS.30. The method according to clause 29, where the activity of NOS is measured by determining the Akt-dependent state of phosphorylation of NOS.
31. Способ по п.30, где указанный пептид NOS включает последовательность SEQ ID NO:2.31. The method of claim 30, wherein said NOS peptide comprises the sequence of SEQ ID NO: 2.
32. Способ по п.30, где в стадии (b), активностью NOS является редуктазная активность.32. The method according to clause 30, where in stage (b), the activity of NOS is reductase activity.
33. Способ по п.30, где в стадии (b), активностью NOS является продуцирование NO ферментом NOS.33. The method according to clause 30, where in stage (b), the activity of NOS is the production of NO by the NOS enzyme.
34. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид NOS, выбранный из группы, состоящей из бычьего eNOS, который содержит замененный аминокислотный остаток, соответствующий остатку 1179; человеческого eNOS, который содержит замененный аминокислотный остаток, соответствующий остатку 1177; крысиного nNOS, который содержит замененный аминокислотный остаток, соответствующий остатку 1412; и человеческого nNOS, который содержит замененный аминокислотный остаток, соответствующий остатку 1415, где указанный замененный аминокислотный остаток содержит не отрицательно заряженную группу R.34. An isolated nucleic acid molecule encoding an NOS polypeptide selected from the group consisting of bovine eNOS that contains a substituted amino acid residue corresponding to residue 1179; a human eNOS that contains a substituted amino acid residue corresponding to residue 1177; rat nNOS, which contains a substituted amino acid residue corresponding to residue 1412; and human nNOS, which contains a substituted amino acid residue corresponding to residue 1415, where the specified substituted amino acid residue contains a non-negatively charged group R.
35. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты по п.34, где указанным замененным аминокислотным остатком является аланин.35. The isolated nucleic acid molecule according to claim 34, wherein said substituted amino acid residue is alanine.
36. Изолированный полипептид NOS, выбранный из группы, состоящей из бычьего eNOS, который содержит замененный аминокислотный остаток, соответствующий остатку 1179; человеческого eNOS, который содержит замененный аминокислотный остаток, соответствующий остатку 1177; крысиного nNOS, который содержит замененный аминокислотный остаток, соответствующий остатку 1412; и человеческого nNOS, который содержит замененный аминокислотный остаток, соответствующий остатку 1415, где указанный замененный аминокислотный остаток содержит не отрицательно заряженную группу R.36. An isolated NOS polypeptide selected from the group consisting of bovine eNOS that contains a substituted amino acid residue corresponding to residue 1179; a human eNOS that contains a substituted amino acid residue corresponding to residue 1177; rat nNOS, which contains a substituted amino acid residue corresponding to residue 1412; and human nNOS, which contains a substituted amino acid residue corresponding to residue 1415, where the specified substituted amino acid residue contains a non-negatively charged group R.
37. Полипептид NOS по п.34, где указанным замененным аминокислотным остатком является аланин.37. The NOS polypeptide of claim 34, wherein said substituted amino acid residue is alanine.
38. Способ по п.11, где указанным промотором, специфичным для эндотелиальных клеток, является промотор Tie-2, промотор эндотелина или промотор eNOS.38. The method of claim 11, wherein said endothelial cell specific promoter is a Tie-2 promoter, an endothelin promoter, or an eNOS promoter.
39. Способ по п.11, где указанным промотором, специфичным для клеток гладкой мускулатуры, является промотор SM22 или промотор альфа-актина SM.39. The method according to claim 11, where the specified promoter, specific for smooth muscle cells, is the SM22 promoter or alpha alpha-actin promoter SM.
40. Способ лечения сердечно-сосудистого заболевания у пациента, включающий стадию доставки указанному пациенту трансгена, кодирующего полипептид по п.7 или полипептид Akt.40. A method of treating a cardiovascular disease in a patient, comprising the step of delivering to said patient a transgene encoding the polypeptide of claim 7 or the Akt polypeptide.
41. Способ по п.40, где указанное сердечно-сосудистое заболевание выбрано из группы, состоящей из сердечной недостаточности, инфаркта миокарда, рестеноза, стеноза после ангиопластики, стент-стеноза и повреждения при сосудистом шунтировании.41. The method of claim 40, wherein said cardiovascular disease is selected from the group consisting of heart failure, myocardial infarction, restenosis, stenosis after angioplasty, stent stenosis and vascular bypass damage.
42. Способ лечения нарушения эрекции у пациента, включающий стадию доставки указанному пациенту трансгена, кодирующего полипептид по п.7 или полипептид Akt.42. A method of treating an erectile dysfunction in a patient, comprising the step of delivering to said patient a transgene encoding the polypeptide of claim 7 or the Akt polypeptide.
43. Способ по любому из пп.10, 13, 14, 40 или 42, где доставку указанного трансгена осуществляют путем внутрисосудистого, внутримышечного, внутрикожного, внутрибрюшинного или внутриартериального введения.43. The method according to any one of paragraphs.10, 13, 14, 40 or 42, where the delivery of the specified transgene is carried out by intravascular, intramuscular, intradermal, intraperitoneal or intraarterial administration.