Claims (26)
1. Полипептидный вариант, обладающий повышенной гепаринсвязывающей способностью, отличающийся тем, что(I) к аминокислотной последовательности полипептида добавлен по меньшей мере один олигопептид, включающий аминокислотную последовательность Х1Х2Х3Х4Х5Х6, и/или (II) в аминокислотную последовательность полипептида встроен по меньшей мере один олигопептид, включающий аминокислотную последовательность Х1Х2Х3Х4Х5Х6, и/или (III) по меньшей мере одна олигопептидная последовательность, встречающаяся в естественных условиях в аминокислотной последовательности полипептида, заменена олигопептидом, включающим аминокислотную последовательность X1X2X3X4X5X6, где Х1 обозначает К, R или Н; Х2 обозначает К, R или Н; Х3 обозначает К, R, Н или не обозначает аминокислоту; Х4 не обозначает К, R, H, но обозначает любую другую аминокислоту; Х5 не обозначает К, R, Н, но обозначает любую другую аминокислоту или не обозначает аминокислоту; X6 не обозначает К, R, Н, но обозначает любую другую аминокислоту или не обозначает аминокислоту (SEQ ID No:1), или: X1 обозначает К, R или Н; Х2 не обозначает К, R, Н, но обозначает любую другую аминокислоту; X3 обозначает К, R или Н; Х4 не обозначает К, R, Н, но обозначает любую другую аминокислоту; Х5 не обозначает К, R, Н, но обозначает любую другую аминокислоту или не обозначает аминокислоту; Х6 не обозначает К, R, Н, но обозначает любую другую аминокислоту или не обозначает аминокислоту (SEQ ID No:2), иполипептид выбирают из представителей семейства DVR, включая суперсемейство TGF-β.1. A polypeptide variant having increased heparin binding ability, characterized in that (I) at least one oligopeptide comprising the amino acid sequence X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 and / or (II) is added to the amino acid sequence of the polypeptide in the amino acid sequence of the polypeptide is embedded at least one oligopeptide comprising the amino acid sequence X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6, and / or (III) at least one oligopeptide sequence naturally occurring in aminokisl tnoj polypeptide sequence has been replaced by an oligopeptide comprising the amino acid sequence X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6, wherein X 1 is K, R or H; X 2 is K, R or H; X 3 is K, R, H or is not an amino acid; X 4 does not mean K, R, H, but denotes any other amino acid; X 5 is not K, R, H, but is any other amino acid or is not an amino acid; X 6 does not denote K, R, H, but denotes any other amino acid or does not denote an amino acid (SEQ ID No: 1), or: X 1 denotes K, R or H; X 2 does not mean K, R, H, but denotes any other amino acid; X 3 is K, R or H; X 4 does not mean K, R, H, but denotes any other amino acid; X 5 is not K, R, H, but is any other amino acid or is not an amino acid; X 6 does not mean K, R, H, but it denotes any other amino acid or does not denote an amino acid (SEQ ID No: 2), and the polypeptide is selected from representatives of the DVR family, including the TGF-β superfamily.
2. Полипептидный вариант по п.1, отличающийся тем, что 1-4 копии этого олигопептида встраивают в 1-4 положения полипептида.2. The polypeptide variant according to claim 1, characterized in that 1-4 copies of this oligopeptide are inserted into 1-4 positions of the polypeptide.
3. Полипептидный вариант по п.1 или 2, отличающийся тем, что олигопептид включает аминокислотную последовательность RKRA (SEQ ID No: 3) или RKRAKHKQ (SEQ ID No:4).3. The polypeptide variant according to claim 1 or 2, characterized in that the oligopeptide comprises the amino acid sequence RKRA (SEQ ID No: 3) or RKRAKHKQ (SEQ ID No: 4).
4. Полипептидный вариант по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что олигопептид добавляют к N-концу и/или встраивают в N-концевую область, и/или им заменяют часть N-концевой области.4. The polypeptide variant according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the oligopeptide is added to the N-terminus and / or inserted into the N-terminal region, and / or part of the N-terminal region is replaced with it.
5. Полипептидный вариант по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность полипептидного варианта дополнительно содержит последовательность, пригодную для рекомбинантной экспрессии на N-конце, эта последовательность, пригодная для рекомбинантной экспрессии, представляет собой М или MZ, где М обозначает метионин и Z обозначает одну или несколько аминокислот.5. The polypeptide variant according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the amino acid sequence of the polypeptide variant further comprises a sequence suitable for recombinant expression at the N-terminus, this sequence suitable for recombinant expression is M or MZ, where M denotes methionine and Z denotes one or more amino acids.
6. Полипептидный вариант по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что6. The polypeptide variant according to any one of claims 1 to 5, characterized in that
полипептидный вариант дополнительно содержит His-метку.the polypeptide variant further comprises a His tag.
7. Полипептидный вариант по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что полипептидный вариант изменяют путем добавления, замены, инсерции, инверсии и/или делеции, причем, полипептид, измененный с помощью добавления, замены, инсерции, инверсии и/или делеции, обладает по меньшей мере 10% биологической активности неизмененного полипептида, и/или по меньшей мере 50% гомологией относительно неизмененного полипептида.7. The polypeptide variant according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the polypeptide variant is changed by adding, replacing, insertion, inversion and / or deletion, moreover, the polypeptide modified by adding, replacing, insertion, inversion and / or deletion, has at least 10% biological activity of the unchanged polypeptide, and / or at least 50% homology relative to the unchanged polypeptide.
8. Полипептидный вариант по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что полипептид представляет собой BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7/OP-1 или ВМР-8/ОР-2.8. The polypeptide variant according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the polypeptide is BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 / OP-1 or BMP-8 / OP- 2.
9. Полипептидный вариант по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что полипептид встраивают перед цистеиновым узлом.9. The polypeptide variant according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the polypeptide is inserted in front of the cysteine node.
10. Полипептидный вариант по п.8 или 9, отличающийся тем, что полипептидный вариант имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID No:5 (Т3) или SEQ ID No:6 (T4).10. The polypeptide variant of claim 8 or 9, characterized in that the polypeptide variant has the amino acid sequence shown in SEQ ID No: 5 (T3) or SEQ ID No: 6 (T4).
11. Полипептидный вариант по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что полипептидный вариант представляет собой полимер, олигомер или димер полипептидного варианта по любому из пп.1-10.11. The polypeptide variant according to any one of claims 1 to 10, characterized in that the polypeptide variant is a polymer, oligomer or dimer of the polypeptide variant according to any one of claims 1 to 10.
12. Молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидный вариант по любому из пп.1-11.12. A nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding a polypeptide variant according to any one of claims 1 to 11.
13. Молекула нуклеиновой кислоты по п.12, отличающаяся тем, что эту нуклеотидную последовательность получают из геномной ДНК или кДНК, или она представляет собой синтетическую ДНК.13. The nucleic acid molecule according to p. 12, characterized in that this nucleotide sequence is obtained from genomic DNA or cDNA, or it is a synthetic DNA.
14. Молекула нуклеиновой кислоты по п.12 или 13, дополнительно включающая промотор, пригодный для контроля экспрессии, причем нуклеотидная последовательность, которая кодирует полипептидный вариант, находится под контролем промотора.14. The nucleic acid molecule according to item 12 or 13, further comprising a promoter suitable for controlling expression, the nucleotide sequence that encodes the polypeptide variant is under the control of the promoter.
15. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.12-14, где молекула нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере часть вектора.15. The nucleic acid molecule according to any one of paragraphs.12-14, where the nucleic acid molecule contains at least a portion of the vector.
16. Клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.12-15, где клетка-хозяин представляет собой прокариотическую или эукариотическую клетку, пригодную для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты.16. A host cell comprising a nucleic acid molecule according to any one of claims 12-15, wherein the host cell is a prokaryotic or eukaryotic cell suitable for expressing a nucleic acid molecule.
17. Способ получения полипептидного варианта, обладающего повышенной гепаринсвязывающей способностью, по любому из пп.1-11, предусматривающий: добавление к аминокислотной последовательности полипептида по меньшей мере одного олигопептида, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID No:1 или SEQ No:2; и/или встраивание в аминокислотную последовательность полипептида по меньшей мере одного олигопептида, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID No: 1 или SEQ No: 2; и/или замену по меньшей мере одной олигопептидной последовательности, которая в естественных условиях входит в состав аминокислотной последовательности, на олигопептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID No:1 или SEQ ID No:2.17. A method for producing a polypeptide variant having enhanced heparin binding ability according to any one of claims 1-11, comprising: adding to the amino acid sequence of the polypeptide at least one oligopeptide that contains an amino acid sequence selected from SEQ ID No: 1 or SEQ No: 2; and / or embedding in the amino acid sequence of the polypeptide of at least one oligopeptide that contains an amino acid sequence selected from SEQ ID No: 1 or SEQ No: 2; and / or replacing at least one oligopeptide sequence, which in vivo is part of the amino acid sequence, with an oligopeptide containing an amino acid sequence selected from SEQ ID No: 1 or SEQ ID No: 2.
18. Способ по п.17, отличающийся тем, что способ предусматривает использование метода химического и/или ферментативного синтеза.18. The method according to 17, characterized in that the method involves the use of chemical and / or enzymatic synthesis.
19. Способ по п.17 или 18, отличающийся тем, что способ предусматривает использование методов генной технологии.19. The method according to 17 or 18, characterized in that the method involves the use of genetic technology methods.
20. Способ по любому из пп.17-19, отличающийся тем, что способ предусматривает: а) мутагенез in vitro кодирующей полипептид нуклеиновой кислоты, например: (I) добавление к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей олигопептид, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID No:1 или SEQ ID No:2; и/или (II) встраивание в нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей олигопептид, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID No:l или SEQ ID No:2; и/или (III) замену по меньшей мере одной нуклеотидной последовательности во встречающейся в естественных условиях нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, на нуклеотидную последовательность, кодирующую олигопептид, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID No:1 или SEQ ID No:2; б) клонирование мутантной нуклеиновой кислоты в приемлемом векторе экспрессии; в) трансформацию/трансфекцию приемлемой клетки-хозяина полученным вектором экспрессии; г) культивирование трансформированной/трансфектированной клетки-хозяина в условиях, приемлемых для экспрессии; д) выделение и при необходимости ренатурацию экспрессируемого полипептида.20. A method according to any one of claims 17-19, characterized in that the method comprises: a) in vitro mutagenesis of a nucleic acid encoding a polypeptide, for example: (I) adding to the nucleic acid encoding a polypeptide at least one nucleic acid encoding an oligopeptide that contains an amino acid sequence selected from SEQ ID No: 1 or SEQ ID No: 2; and / or (II) embedding in a nucleic acid encoding a polypeptide of at least one nucleic acid encoding an oligopeptide that contains an amino acid sequence selected from SEQ ID No: l or SEQ ID No: 2; and / or (III) replacing at least one nucleotide sequence in a naturally occurring nucleotide sequence encoding a polypeptide with a nucleotide sequence encoding an oligopeptide that contains an amino acid sequence selected from SEQ ID No: 1 or SEQ ID No: 2; b) cloning of the mutant nucleic acid in an acceptable expression vector; c) transformation / transfection of an acceptable host cell with the obtained expression vector; d) culturing the transformed / transfected host cell under conditions suitable for expression; e) isolation and, if necessary, renaturation of the expressed polypeptide.
21. Способ по любому из пп.17-20, отличающийся тем, что способ осуществляют с использованием прокариотической клетки-хозяина, такой как предпочтительно Е. coli.21. The method according to any one of paragraphs.17-20, characterized in that the method is carried out using a prokaryotic host cell, such as preferably E. coli.
22. Способ по любому из пп.17-20, отличающийся тем, что способ осуществляют с использованием эукариотической клетки-хозяина, предпочтительно клетки дрожжей, растения или насекомого, СНО- или COS-клетки.22. The method according to any one of paragraphs.17-20, characterized in that the method is carried out using a eukaryotic host cell, preferably a yeast, plant or insect cell, CHO or COS cells.
23. Фармацевтическая композиция, включающая полипептидный вариант по любому из пп.1-11 и необязательно физиологически совместимые добавки.23. A pharmaceutical composition comprising the polypeptide variant according to any one of claims 1 to 11 and optionally physiologically compatible additives.
24. Применение полипептидного варианта по любому из пп.1-11 для стимуляции остеогенеза или заживления ран или для лечения воспаления или рака.24. The use of the polypeptide variant according to any one of claims 1 to 11 for the stimulation of osteogenesis or wound healing or for the treatment of inflammation or cancer.
25. Композиция для остеоиндукции, включающая полипептидный вариант по любому из пп.1-11 и носитель, выбранный из ряда, включающего гепарин, гидроксиапатит, гиалуроновую кислоту, синтетические полимеры и коллаген.25. A composition for osteoinduction, comprising the polypeptide variant according to any one of claims 1 to 11, and a carrier selected from the group consisting of heparin, hydroxyapatite, hyaluronic acid, synthetic polymers and collagen.
26. Остеоиндуктивный матрикс, отличающийся тем, что матрикс содержит или покрыт гепарином или гепаринподобными субстанциями и полипептидные варианты по любому из пп.1-11 адсорбированы на гепарин или гепаринподобные субстанции.26. Osteoinductive matrix, characterized in that the matrix contains or is coated with heparin or heparin-like substances and the polypeptide variants according to any one of claims 1 to 11 are adsorbed on heparin or heparin-like substances.