RU195616U1 - Устройство для измерения спектра импеданса биологических структур - Google Patents

Abstract

Использование: для измерения спектра импеданса биологических тканей и органов млекопитающих. Сущность полезной модели заключается в том, что устройство для измерения импеданса биологических структур, культивируемых на проницаемой мембране в емкости, размещенной в лунке многолучночного планшета, включает основание; по меньшей мере, один электродный блок, размещенный с нижней стороны основания и выполненный с возможностью реализации четырехэлектродной схемы измерения импеданса, при этом электродный блок содержит два электрода, каждый из которых включает два проводящих стрежня, размещенных в изолирующем цилиндрическом элементе параллельно его оси и выступающих со стороны его торцевой поверхности, при этом один электрод блока предназначен для размещения внутри емкости с проницаемой мембраной, а второй - в лунке снаружи упомянутой емкости; крышку, выполненную с возможностью размещения на верхней стороне основания; коннекторный блок, размещенный на крышке, выполненный с возможностью электрического соединения с проводящими стрежнями электродов; при этом основание с нижней стороны снабжено выступами, часть из которых предназначена для центрирования электрода блока, предназначенного для размещения в емкости, другая часть - для формирования канала, соединяющего полость емкости с внешней средой, а цилиндрический элемент снабжен выступом, расположенным на его торцевой поверхности для механической защиты выступающих частей проводящих стержней. Технический результат: обеспечение возможности быстроты и удобства сборки и эксплуатации устройства для измерения спектра импеданса биологических структур, культивируемых на мембранных вставках, размещенных в многолуночном планшете или в микрофлюидном чипе. 10 з.п. ф-лы, 9 ил.

Description

Область техники, к которой относится полезная модель

Полезная модель относится к области измерительной техники и может быть использована для измерения спектра импеданса биологических тканей, органов и клеток млекопитающих, размещенных в измерительных ячейках многолуночного планшета, в частности, для измерения импеданса образцов in vitro барьерных тканей в биологических экспериментах.

Уровень техники

Культивирование клеток в микрофлюидных системах и многолуночных планшетах на сегодняшний день является одним из наиболее перспективных подходов, обеспечивающих in vitro условия, сходные с условиями in vivo, для поддержания жизнеспособности, функциональной активности и стабильности клеточных культур в течение длительного времени (до 28 дней), с возможностью регистрации изменения параметров, характеризующих функциональный статус клеток на молекулярном уровне. Изучение клеточных структур в естественном состоянии позволяет получить новые знания о процессах, происходящих в клетках, определить способы воздействия на клетки, приводящие к тому или иному результату. Это является важным при создании эффективных лекарственных средств и разработке новых методов лечения заболеваний.

Модели биологических барьеров чрезвычайно важны для исследования физиологических функций, механизмов транспорта, патологий. Слои образующих барьер эпителиальных и эндотелиальных клеток, прежде всего, характеризуются способностью формировать плотные межклеточные контакты, разделяющие апикальную и базолатеральную стороны слоя. Клетки формируют между соответствующими компартментами слой с селективной проницаемостью, контролирующий диффузию через парацеллюлярные пути и транспорт - через интрацеллюлярные. При этом, барьер не является статическим и может модулироваться различными стимулами, приводящими к его закрытию или открытию. Функционирование этого барьера необходимо для выполнения тканью своей физиологической функции.

Импедансная спектрометрия является воспроизводимым и информативным методом измерения трансэпителиального или трансэндотелиального сопротивления. Метод заключается в измерении амплитуды и фазы переменного тока, при воздействии синусоидального переменного напряжения с частой обычно изменяемой в диапазоне от 1 Гц до 100 кГц. Из полученного спектра полного сопротивления путем «подгонки» модели, основанной на эквивалентной схеме, можно извлечь информацию не только об активном сопротивлении, но и реактивных компонентах сопротивления, позволяющих оценить различные параметры клеточной модели.

Из уровня техники известны различные устройства, обеспечивающие измерение импеданса биологических структур.

Из уровня техники известен прибор "cellZscope" (nanoAnalytics, https://www.nanoanalytics.com/de/produkte/cellzscope/cellzscopeplus.html), позволяющий производить мониторинг импеданса в режиме реального времени в 24 мембранных вставках с последующей оценкой трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) и электрической емкости. Прибор представляет собой измерительный модуль из ячеек-электродов, изготовленных из нержавеющей стали, в которые помещают мембранные вставки с клеточными моделями. Устройство позволяет работать со вставками различного диаметра. Измерительный модуль имеет защитную крышку и позволяет проводить измерения в инкубаторе в режиме реального времени. Все элементы модуля автоклавируемы. К недостаткам данной конструкции можно отнести невозможность ее использования с более высокопроизводительными форматами культивирования, в частности с 96-ти луночными планшетами. Также в данном приборе используется двухэлектродная схема для измерения импеданса, которая является менее предпочтительной чем четырехэлектродная схема из-за внесения дополнительной погрешности в результаты измерений.

Известно устройство для изучения электрических свойств клеток и тканей, одновременно размещенных в нескольких мембранных системах, методом импедансной спектроскопии (WO 2005098423). В частности, в международной заявке описана конструкция многолуночной пластины, с расположенными в каждой лунке двумя камерами, разделенными проницаемым для клеток слоем - мембраной, при этом каждая камера выполнена с возможностью размещения одного или нескольких электродов. Недостатком данной системы является сложная конструкция нижнего основания многолуночной пластины, так как оно включает в себя множество электродов, которые проходят сквозь материал нижнего основания и располагаются в первой камере лунки. В месте прохождения электродов сквозь нижнее основание может быть нарушена герметичность лунки как на этапе изготовления многолуночной пластины, так и при возникновении микротрещин или микрозазоров между собственно электродами и материалом нижнего основания вследствие старения материалов, механических или температурных деформаций. Аналогичный недостаток присущ и конструкции верхней пластины (крышки) с электродами, которые располагаются во второй камере лунки. Кроме того, существенным недостатком данной конструкции является сложность коммутации внешних электрических проводов (соединений) с выводами электродов многолуночной пластины, особенно в случае 96 луночного варианта планшета. Кроме того, данная конструкция характеризуется трудностями, связанными с заменой отдельных электродов в случае выхода их из строя.

Наиболее близким к предлагаемому решению является устройство для определения трансцеллюлярного импеданса клеток, культивируемых на проницаемой мембране, содержащее одну или несколько измерительных ячеек (ЕР 2322925). Каждая измерительная ячейка состоит из первого контейнера, в который установлен второй контейнер с проницаемой мембраной для культивирования клеток, и крышки для первого контейнера. Первый контейнер может быть выполнен из металла или из электропроводного пластика с функцией электрода. На крышке для первого контейнера размещен, по меньшей мере, один электрод. Таким образом, ячейка снабжена двумя электродами, один из которых является частью корпуса первого контейнера, а второй выполнен с возможностью размещения во втором контейнере при закрытии крышкой первого контейнера. Недостатком данной конструкции является возможность выполнения ошибочных измерений с электродом, в качестве которого выступает корпус первого контейнера, из-за наличия механического соединения между корпусом первого контейнера и пластиной, на которой размещаются первые контейнеры, вследствие загрязнения места их контакта, механических или температурных деформаций контейнеров, особенно в случае реализации многолуночного варианта планшета с числом контейнеров от 24 до 96. Также, недостатком является невозможность частичной замены электродов на крышке первого контейнера в случае необходимости.

Таким образом, известные устройства не обеспечивают надежную и стабильную в течение длительного времени работу измерительных электродов из-за своих конструктивных особенностей и чувствительности к механическим и/или температурным деформациям отдельных узлов, не позволяют осуществлять замену отдельных измерительных электродов, имеют сложности с коммутацией внешних электрических соединений при большом числе лунок. Проведение измерений спектра импеданса возможно только при помощи поставляемых производителями ячеек с электродами, либо электродами, размещаемыми у объекта измерений вручную. Такая схема затрудняет процесс измерений, а точность результатов зависит от квалификации и действий лаборанта. Кроме того, в связи с большой распространенностью на сегодняшний день производительных 96-луночных культуральных планшетов с мембранными вставками, существует потребность в создании простых в сборке и эксплуатации, а также учитывающих специфику работы с клетками устройств измерения импеданса, совместимых с данным форматом культуральных планшетов.

Технической проблемой, на решение которой направлена заявляемая полезная модель, является создание простого в сборке и эксплуатации устройства, обеспечивающего измерение в режиме реального времени спектра импеданса биологических структур (клеточной модели), размещенных в многолуночных (включая 96-луночный) культуральных планшетах с мембранными вставками в широком диапазоне частот.

Раскрытие сущности полезной модели

Техническим результатом является обеспечение быстроты и удобства сборки и эксплуатации устройства для измерения спектра импеданса биологических структур, культивируемых на мембранных вставках, размещенных в многолуночном планшете, с возможностью масштабирования устройства при необходимости одновременного измерения импеданса более трех биологических образцов. Кроме того, заявляемое устройство обеспечивает надежную и стабильную в течение длительного времени (по меньшей мере в течение 5-ти суток) работу измерительных электродов, характеризуется простотой коммутации с внешними устройствами, включая вариант выполнения для размещения в большом числе лунок (96-луночном планшете), возможностью его стерилизации с целью его повторного использования, замену отдельных измерительных электродов при необходимости.

Технический результат достигается за счет разработки устройства для измерения спектра импеданса биологических структур, расположенных в контейнерах, в качестве которых могут выступать мембранные вставки с клетками, которые в свою очередь размещены в лунках многолуночном планшете, со встроенной системой электродов, позволяющей проводить измерения по четырехэлектродной схеме), включающего основание, по меньшей мере, один электродный блок, крышку и коннекторный блок. Электродный блок размещен с нижней стороны основания и выполнен с возможностью реализации четырехэлектродной схемы измерения импеданса, при этом электродный блок содержит два электрода, каждый из которых включает два проводящих стрежня, размещенных в изолирующем цилиндрическом элементе параллельно его оси и выступающих со стороны его торцевой поверхности, при этом один электрод блока предназначен для размещения внутри емкости с проницаемой мембраной, а второй - в лунке снаружи упомянутой емкости. Крышка выполнена с возможностью размещения на верхней стороне основания. Коннекторный блок размещен на крышке и выполнен с возможностью электрического соединения с проводящими стрежнями электродов. При этом основание с нижней стороны снабжено выступами, часть из которых предназначена для центрирования электрода блока, предназначенного для размещения в емкости, другая часть - для формирования канала, соединяющего полость емкости с внешней средой, а цилиндрический элемент снабжен выступом, расположенным на его торцевой поверхности для механической защиты выступающих частей проводящих стержней.

В одном из вариантов осуществления полезной модели выступы, предназначенные для центрирования электрода, имеют цилиндрическую форму со скошенной боковой поверхностью, а выступы для формирования канала имеют форму протяженных (прямоугольных) площадок (со скругленными углами), при этом выступы для центрирования электрода расположены на протяженных площадках. Ширина канала, соединяющего полость емкости с внешней средой, определяется расстоянием между соседними площадками, а вход в канал образован скосом боковой поверхности цилиндрического выступа. В конкретном варианте полезной модели ширина канала составляет 2,1 мм, высота канала, определяемая высотой соответствующего выступа - 0,3 мм.

Выступ, расположенный на торцевой поверхности цилиндрического элемента, может быть выполнен в виде части цилиндра, при этом выступ выполнен с уменьшающейся толщиной от его центра к периферии - с большим радиусом кривизны внутренней поверхности выступа по сравнению с радиусом кривизны внешней поверхности выступа. В конкретном варианте осуществления изобретения выступ имеет высоту 1 мм, протяженность от 1/3 до 1/2 длины окружности торцевой поверхности цилиндрического элемента, внешний радиус 2 мм и внутренний радиус 2,25 мм; цилиндрические элементы имеют длину 10 мм и диаметр 4 мм, проводящие стрежни электродов имеют длину 11 мм, диаметр 0,5 мм и выполнены из инертного по отношению к клеткам материала (золото, титан, позолоченная проволока и т.д.).

В предпочтительном варианте осуществления полезной модели устройство содержит три электродных блока, размещенные на основании с возможностью одновременного измерения импеданса в трех ячейках, расположенных на одной оси (в один ряд), основание выполнено с полостью для размещения проводов, соединяющих электроды и коннектор; крышка снабжена выступами (ручками) для удобства захвата и извлечения электродного блока из лунок планшета; а основание и цилиндрические элементы выполнены в виде единой детали.

Краткое описание чертежей

Полезная модель поясняется чертежами, где на фиг. 1 представлена изометрическая проекция основания, на фиг. 2 вид спереди основания, на фиг. 3 вид сверху основания, на фиг. 4 вид снизу основания, на фиг. 5 общий вид устройства для измерения импеданса биологических структур, культивируемых на проницаемой мембране, на фиг. 6 вид спереди в разрезе одного электродного блока и емкости для культивирования на проницаемой мембране, установленных в лунку планшета, на фиг. 7 схема размещения трех электродных блоков в емкостях для культивирования на проницаемой мембране, на фиг. 8 схема установки устройства для проведения измерений в 96-луночном планшете

Позициями на фигурах обозначены: 1 - проницаемая мембрана, 2 - емкость (например, вставка Трансвелл), 3 - основание, 4 - электродный блок, 5 - электрод, 6 - проводящие стержни, 7 - цилиндрический элемент, 8 - крышка, 9 - коннекторный блок, 10 - выступ, расположенный на торцевой поверхности цилиндрического элемента или защитный выступ), 11 - выступ для формирования канала, 12 - выступ для центрирования электрода, 13 - ручки для захвата, 14 - скошенная боковая поверхность выступов, предназначенные для центрирования электрода, 15 - канал, соединяющий полость емкости с внешней средой, 16 - рамка для фиксации заявляемого устройства в многолуночном планшете, 17 - промежуточная рамка, 18 - боковые отверстия в промежуточной рамке для вывода проводов от коннекторного блока, 19 - крышка планшета.

Осуществление полезной модели

Предлагаемое устройство предназначено для измерения спектра импеданса биологических структур (например, клеточного монослоя), расположенных на проницаемой мембране 1 в емкости 2, размещенной в лунке многолуночного планшета.

Разрабатываемое устройство позволяет проводить измерения по четырехэлектродной схеме в широком диапазоне исследуемых частот (например, от 20 до 20000 Гц), что дает возможность не только определять значение TEER биологических структур, но и значение дополнительных электрических параметров, таких как емкость и фоновое сопротивление. Их определение позволяет более полно охарактеризовать состояние клеточного барьера, вплоть до определения многослойности структуры клеточной модели. Измеренные данные могут выводиться на дисплеи персональных устройств или компьютеров в виде графиков и годографов, что значительно упрощает статистическую обработку, а также позволяет проводить исследования динамики развития клеточных барьеров.

Ниже представлено более детальное описание заявляемого устройства, не ограничивающее его сущность, представленную в независимом пункте формулы, а лишь демонстрирующее возможность достижение заявленного технического результата.

Устройство включает основание 3, содержащее, по крайней мере, один электродный блок 4, крышку 8 и коннекторный блок 9. Основание 3 может быть выполнено из любого механически прочного нетоксичного непроводящего материала. На нижней стороне основания размещены выступы 11, формирующие канал 15, предназначенный для обеспечения газообмена между емкостью 2 для культивирования на проницаемой мембране биологических структур и окружающей средой. Также основание 3 содержит выступы 12 цилиндрической формы со скошенной боковой поверхностью 14, предназначенные для центрирования одного из электродов 5 электродного блока 4 в емкости с проницаемой мембраной. Скос на боковой поверхности цилиндрического выступа 12 и боковая поверхность емкости 2, на дне которой располагается проницаемая мембрана, формируют вход в канал 15. Выход из канала располагается на боковой поверхности основания. Основание 3 содержит по крайней мере два электрода 5, формирующих один электродный блок 4. Каждый электрод 5 состоит из цилиндрического элемента 7, содержащего по два проводящих стержня 6, а также защитный выступ 10 на торцевой поверхности. Проводящие стержни 6 выступают за пределы торцевой поверхностью цилиндрического элемента на расстояние 1 мм. Защитный выступ 10 на торцевой поверхности цилиндрического элемента предназначен для предотвращения механических повреждений выступающих частей проводящих стержней 6. В верхней части основания 3 располагается полость, в которую выходят концы проводящих стержней 6, находящихся в цилиндрических элементах 7. Данная полость закрывается крышкой 8. Внутри полости размещаются соединительные провода, обеспечивающие электрическое соединение концов проводящих стержней 6 с металлическими ножками коннекторного блока 9, расположенного на верхней поверхности крышки 8. Также на крышке 8 предусмотрены ручки 13 для захвата устройства в процессе работы с ним, которые могут иметь различные варианты исполнения. Для измерения спектра импеданса заявляемое устройство устанавливают в 96-ти луночный планшет с емкостями, предназначенными для культивирования биологических образцов на проницаемой мембране, и подключают к устройству измеритель импеданса. При этом для проведения измерений импеданса устройство устанавливают в 96-луночный планшет таким образом, что один из электродов каждого электродного блока 4 располагается в емкости 2 с проницаемой мембраной 1, а второй в лунке планшета, в которую помещена емкость с проницаемой мембраной, с внешней стороны емкости 2. Затем для дополнительной фиксации устройства на планшет устанавливают рамку 16 (фиг. 8) и к коннекторному блоку 9 подключают провода от измерителя импеданса. После чего на планшет устанавливают промежуточную рамку 17 с боковыми отверстиями 18 для вывода проводов (фиг. 8). Сверху для предотвращения попадания в лунки частиц пыли и микроорганизмов из внешней среды планшет накрывается крышкой 19. Далее производятся измерения импеданса.

Устройство работает следующим образом.

Известно, что монослой эпителиальных клеток на мембранной подложке может быть представлен в виде эквивалентной электрической схемы, представляющей собой параллельно соединенный конденсатор и резистор, а сама клетка моделируется элементом постоянной фазы [Grimnes S., Martinsen O.G. Cole electrical impedance model-a critique and an alternative. // IEEE Trans. Biomed. Eng. 2005. V. 52, №1. P. 132-135]. Годограф эквивалентной схемы представляет собой окружность, центр которой смещен вниз по мнимой оси [Cole K.S. Electric phase angle of cell membranes // J. Gen. Physiol. 1932. V. 15, №6. P. 641-649.].

Метод измерений, лежащий в основе предлагаемого устройства, заключается в снятии электрических параметров с измерительных электродов, расположенных в контейнерах (емкостях 2) с биологическими структурами, в тот момент, когда на одну пару электродов подается разность потенциалов, продуцирующая протекание между ними электрического тока с заданными параметрами. Полученные данные со второй пары измерительных электродов позволяют определить значения импеданса на каждой частоте из реализуемого диапазона.

Пример конкретного выполнения

В одном из вариантов выполнения устройства, основание 3 и крышка 8 устройства могут быть изготовлены из поликарбоната. При этом устройство может включать в себя три электродных блока 4 (фиг. 5), каждый из которых состоит из двух цилиндрических элементов 7 с проводящими стержнями внутри 6. Основание 3 и цилиндрические элементы 7 изготавливают из листового поликарбоната методом фрезерования и представляют собой единую деталь. Крышку 8 также изготавливают из листового поликарбоната при помощи фрезерования. В каждом цилиндрическом элементе 7, расположенном на основании 3 устройства, просверливают два отверстия, в которые помещают позолоченную медную проволоку диаметром 0.5 мм. Затем при помощи пайки концы проводящих стержней соединяют с проводами, соединенными с металлическими ножками коннекторного блока 9, расположенного на крышке 8 устройства. Провода укладываются в полость, образованную основанием 3 и крышкой 8, после чего крышку приклеивают к основанию или закрепляют любым другим известным из уровня техники способом. Полученное устройство затем стерилизуют при помощи автоклавирования и используют для измерения импеданса in vitro моделей барьерных тканей.

Для измерения импеданса клеточной модели барьерной ткани в емкости с проницаемыми мембранами высаживали по 10000 клеток линии Сасо-2. Объем питательной среды в емкости был равен 100 мкл, объем питательной среды в лунке, в которую помещалась емкость, был равен 235 мкл. В качестве питательной среды была использована среда MEM с добавлением 20% по объему фетальной бычьей сыворотки. Смена среды производилась каждые 2 дня. Через 8 дней после начала эксперимента в 96-ти луночный планшет устанавливали устройство. Затем устанавливали поликарбонатную рамку 16, фиксирующую устройство. После чего подключали к устройству измеритель импеданса и устанавливали промежуточную рамку 17 с отверстиями 18. Планшет накрывали крышкой 19 и проводили измерения импеданса при комнатной температуре в диапазоне частот 20-20000 Гц (200 точек). Полученные данные зависимости модуля импеданса от частоты электрического тока представлены на фиг. 9.

Таким образом, предлагаемое устройство обеспечивает возможность измерения импеданса на одной частоте, на нескольких частотах, а также снятие спектра импеданса.

Claims (11)

1. Устройство для измерения импеданса биологических структур, культивируемых на проницаемой мембране в емкости, размещенной в лунке многолучночного планшета, включающее основание; по меньшей мере, один электродный блок, размещенный с нижней стороны основания и выполненный с возможностью реализации четырехэлектродной схемы измерения импеданса, при этом электродный блок содержит два электрода, каждый из которых включает два проводящих стрежня, размещенных в изолирующем цилиндрическом элементе параллельно его оси и выступающих со стороны его торцевой поверхности, при этом один электрод блока предназначен для размещения внутри емкости с проницаемой мембраной, а второй - в лунке снаружи упомянутой емкости; крышку, выполненную с возможностью размещения на верхней стороне основания; коннекторный блок, размещенный на крышке, выполненный с возможностью электрического соединения с проводящими стрежнями электродов; при этом основание с нижней стороны снабжено выступами, часть из которых предназначена для центрирования электрода блока, предназначенного для размещения в емкости, другая часть - для формирования канала, соединяющего полость емкости с внешней средой, а цилиндрический элемент снабжен выступом, расположенным на его торцевой поверхности для механической защиты выступающих частей проводящих стержней.

2. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что выступы, предназначенные для центрирования электрода, имеют цилиндрическую форму со скошенной боковой поверхностью, а выступы для формирования канала имеют форму протяженных (прямоугольных) площадок (со скругленными углами), при этом выступы для центрирования электрода расположены на протяженных площадках.

3. Устройство по п. 2, характеризующееся тем, что ширина канала, соединяющего полость емкости с внешней средой, определяется расстоянием между соседними площадками, а вход в канал образован скосом боковой поверхности цилиндрического выступа.

4. Устройство по п. 3, характеризующееся тем, что ширина канала составляет 2,1 мм, высота канала, определяемая высотой соответствующего выступа - 0,3 мм.

5. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что выступ, расположенный на торцевой поверхности цилиндрического элемента, выполнен в виде части цилиндра, при этом выступ выполнен с уменьшающейся толщиной от его центра к периферии - с большим радиусом кривизны внутренней поверхности выступа по сравнению с радиусом кривизны внешней поверхности выступа.

6. Устройство по п. 5, характеризующееся тем, что выступ имеет высоту 1 мм, протяженность от 1/3 до 1/2 длины окружности торцевой поверхности цилиндрического элемента, внешний радиус 2 мм и внутренний радиус 2,25 мм.

7. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что цилиндрические элементы имеют длину 10 мм и диаметр 4 мм, проводящие стрежни электродов имеют длину 11 мм, диаметр 0,5 мм и выполнены из инертного по отношению к клеткам материала (золото, титан, позолоченная проволока и т.д.).

8. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что основание выполнено с полостью для размещения проводов, соединяющих электроды и коннектор.

9. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что он содержит три электродных блока, размещенные на основании с возможностью одновременного измерения импеданса в трех ячейках, расположенных на одной оси (в один ряд).

10. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что крышка снабжена выступами (ручками) для удобства захвата и извлечения электродного блока из лунок планшета.

11. Устройство по п. 1, характеризующееся тем, что основание и цилиндрические элементы выполнены в виде единой детали.

Images