RU191716U1

RU191716U1 - MICROFLUID CHIP FOR CULTIVATION AND RESEARCH OF CELL MODELS

Info

Publication number: RU191716U1
Application number: RU2019115654U
Authority: RU
Inventors: Александр Григорьевич Тоневицкий; Евгений Николаевич Князев; Ольга Владимировна Киндеева; Владимир Андреевич Петров; Ильдар Нафисович Газизов
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью научно-технический центр "БиоКлиникум" (ООО НТЦ "БиоКлиникум")
Priority date: 2019-05-22
Filing date: 2019-05-22
Publication date: 2019-08-19

Abstract

Полезная модель относится к биотехнологии, а именно к тканевой инженерии, и может быть использована для культивирования и/или исследования клеток или клеточных моделей со статическим и/или динамическим движением ростовой среды. Предлагаемый микрофлюидный чип для культивирования и исследования клеточных моделей включает верхнюю и нижнюю пластины из твердого оптически прозрачного материала и размещенный между пластинами слой формовочного оптически прозрачного материала с расположенной в нем микрофлюидной системой. Верхняя пластина, расположенная на слое формовочного материала, выполнена меньшей площади, а слой формовочного материала в области, свободной от верхней пластины, снабжен четырьмя элементами для подключения внешней среды, выполненными в виде углублений в слое формовочного материала, связанных с микрофлюидной системой. При этом микрофлюидная система образована клеточной ячейкой, выполненной в виде сквозного отверстия в слое формовочного материала, поперечно разделенного пористой мембраной, и двумя группами подводящих и отводящих микрофлюидных каналов, выполненных на поверхностях слоя формовочного материала, загерметизированными верхней и нижней пластинами. Подводящий и отводящий каналы первой группы выполнены в виде канавок Г-образной формы на нижней поверхности слоя формовочного материала, каждый из которых соединен одним концом с клеточной ячейкой, а другим - с соответствующим углублением для доступа внешней среды к клеточной ячейке. Подводящий и отводящий каналы второй группы образованы двумя прямолинейными сегментами, один из которых расположен на нижней поверхности слоя формовочного материала и соединен с соответствующим углублением для доступа внешней среды, а второй сегмент расположен на верхней поверхности слоя формовочного материала и соединен с клеточной ячейкой. Слой формовочного материала снабжен выемкой для подключения измерительного модуля с одной из торцевых сторон чипа, при этом каждая из пластин со стороны слоя формовочного материала снабжена двумя электродами, расположенными в области проекции клеточной ячейки, и двумя контактными площадками для подключения к измерительному модулю, расположенными в области выемки и соединенными с электродами. Полезная модель обеспечивает возможность контроля целостности и свойств по меньшей мере двухслойных клеточных моделей, воспроизводящих модель плацентарного барьера в условиях in vitro, приближенных к in vivo, в режиме реального времени. 13 з.п. ф-лы, 4 ил.The utility model relates to biotechnology, namely to tissue engineering, and can be used to cultivate and / or study cells or cell models with static and / or dynamic movement of the growth medium. The proposed microfluidic chip for culturing and studying cell models includes an upper and lower plate of solid optically transparent material and a layer of molding optically transparent material placed between the plates with a microfluidic system located in it. The upper plate, located on the layer of molding material, is made smaller, and the layer of molding material in the region free of the upper plate is equipped with four elements for connecting the external environment, made in the form of recesses in the layer of molding material associated with the microfluidic system. In this case, the microfluidic system is formed by a cell cell made in the form of a through hole in the layer of molding material transversely separated by a porous membrane, and two groups of inlet and outlet microfluidic channels made on the surfaces of the layer of molding material, sealed by the upper and lower plates. The inlet and outlet channels of the first group are made in the form of grooves of a L-shaped form on the lower surface of the layer of molding material, each of which is connected at one end to the cell cell and the other with a corresponding recess for the external medium to access the cell cell. The inlet and outlet channels of the second group are formed by two rectilinear segments, one of which is located on the lower surface of the molding material layer and connected to a corresponding recess for accessing the external environment, and the second segment is located on the upper surface of the molding material layer and connected to the cell cell. The layer of molding material is provided with a recess for connecting the measuring module from one of the end sides of the chip, while each of the plates on the side of the layer of molding material is equipped with two electrodes located in the projection area of the cell cell and two contact pads for connecting to the measuring module located in the region notches and connected to the electrodes. The utility model provides the ability to control the integrity and properties of at least two-layer cell models that reproduce the model of the placental barrier in vitro, close to in vivo, in real time. 13 s.p. f-ly, 4 ill.

Description

Область техники, к которой относится полезная модельThe technical field to which the utility model relates.

Полезная модель относится к биотехнологии, а именно, к тканевой инженерии, и может быть использована для культивирования и/или исследования клеток или клеточных моделей со статическим и/или динамическим движением ростовой среды.The utility model relates to biotechnology, namely, tissue engineering, and can be used for the cultivation and / or study of cells or cell models with static and / or dynamic movement of the growth medium.

В частности, заявляемая полезная модель может быть использована для формирования двухслойных клеточных моделей из различных типов клеток, например, модели плаценты, с последующим изучением процессов фетоплацентарного барьера in vitro. Устройство позволяет имитировать на микроуровне структуру и функцию плаценты и моделировать перенос питательных веществ от матери к плоду и от плода к матери.In particular, the claimed utility model can be used to form two-layer cell models from various types of cells, for example, a placenta model, followed by an in vitro study of the fetoplacental barrier processes. The device allows you to simulate at the micro level the structure and function of the placenta and simulate the transfer of nutrients from mother to fetus and from fetus to mother.

Заявляемое решение также может быть использовано для исследования влияния различных химических веществ на клетки в условиях in vitro, оценки транспорта ксенобиотиков через плацентарный барьер и их токсичности при разработке новых лекарственных средств.The claimed solution can also be used to study the effect of various chemicals on cells in vitro, to assess the transport of xenobiotics through the placental barrier and their toxicity in the development of new drugs.

Уровень техникиState of the art

Плацента является высокоспециализированным органом, который играет важную роль в человеческом организме в ходе беременности. Известно, что по некоторым оценкам лишь 15% препаратов одобрены для применения во время беременности, т.к. у исследователей недостаточно информации о проницаемости плаценты для их препаратов и влиянии лекарств на развивающийся плод. Десятки выведенных с рынка препаратов, которые вызывали серьезные нарушения при беременности, привели к развитию новых in vitro методов тестирования безопасности. В этих исследованиях были выявлены серьезные недостатки существующих методов тестирования на животных: низкая релевантность относительно человека, высокая стоимость и сложность экспериментов.The placenta is a highly specialized organ that plays an important role in the human body during pregnancy. It is known that, according to some estimates, only 15% of drugs are approved for use during pregnancy, because Researchers do not have enough information about the permeability of the placenta for their drugs and the effect of drugs on the developing fetus. Dozens of marketed drugs that caused serious pregnancy problems have led to the development of new in vitro safety testing methods. In these studies, serious shortcomings of existing animal testing methods were identified: low relevance to humans, high cost and complexity of experiments.

На сегодняшний день известны подходы к созданию новых методик тестирования проницаемости плацентарного барьера. Стремительное развитие технологий «орган-на-чипе» привело к появлению работ по созданию клеточных моделей плацентарного барьера, культивируемых in vitro. В частности, в работах [Blundell С. и др. А microphysiological model of the human placental barrier. // Lab Chip. 2016. T. 16. №16. C. 3065-73; Lee J.S. и др. Placenta-on-a-chip: a novel platform to study the biology of the human placenta. // J. Matern. Fetal. Neonatal Med. 2016. T. 29. №7. C. 1046-54] была осуществлена попытка получения микрофизиологических моделей плацентарного барьера на чипе.Today, approaches to the creation of new methods for testing the permeability of the placental barrier are known. The rapid development of organ-on-chip technologies has led to the emergence of work on the creation of cellular models of the placental barrier cultured in vitro. In particular, in [Blundell S. et al. A microphysiological model of the human placental barrier. // Lab Chip. 2016. T. 16. No. 16. C. 3065-73; Lee J.S. et al. Placenta-on-a-chip: a novel platform to study the biology of the human placenta. // J. Matern. Fetal. Neonatal Med. 2016. T. 29. No. 7. C. 1046-54] an attempt was made to obtain microphysiological models of the placental barrier on a chip.

На данный момент в мировой литературе часто встречаются работы, посвященные исследованию токсического действия препаратов на плацентарный барьер. Эти работы основаны на базовых методах культивирования in vitro. Использование современных методов и моделей культивирования позволит получить больше достоверных результатов тестирования ксенобиотиков на токсичность. Наиболее перспективным подходом, обеспечивающим такие условия, считают культивирование клеток в условиях специальных устройств-микробиореакторов (или микрофлюидных чипов, микрофлюидных платформ), которые обеспечивают поддержание жизнеспособности, функциональной активности и стабильности клеточных культур в течение длительного времени, а также регистрацию изменения параметров, характеризующих их функциональный статус на молекулярном уровне [см., например, Peyton S.R. и др. Marrow-derived stem cell motility in 3D synthetic scaffold is governed by geometry along with adhesivity and stiffness. // Biotechnol. Bioeng. 2011. T. 108. №5. C. 1181-93; Griffith L.G., Swartz M.A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2006. T. 7. №3. C. 211-24]. В динамических моделях микробиореакторов с помощью микронасосов обеспечивается циркуляция питательной среды в проточном и/или замкнутом режимах.At the moment, in the world literature there are often works devoted to the study of the toxic effect of drugs on the placental barrier. These works are based on basic in vitro cultivation methods. Using modern methods and models of cultivation will provide more reliable results of xenobiotic toxicity testing. The most promising approach to ensuring such conditions is considered to be cell cultivation under the conditions of special microbioreactor devices (or microfluidic chips, microfluidic platforms) that ensure the maintenance of viability, functional activity and stability of cell cultures for a long time, as well as recording changes in the parameters characterizing them functional status at the molecular level [see, for example, Peyton SR et al. Marrow-derived stem cell motility in 3D synthetic scaffold is governed by geometry along with adhesivity and stiffness. // Biotechnol. Bioeng. 2011. T. 108. No. 5. C. 1181-93; Griffith L.G., Swartz M.A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2006. T. 7. No. 3. C. 211-24]. In dynamic models of microbioreactors with the help of micropumps, the nutrient medium is circulated in flowing and / or closed modes.

Из уровня техники известны микрофлюидные чипы (RU 2648444, RU 2584598), представляющие собой трехслойную структуру, включающую пластину из поликарбоната, в которой выполнены резьбовые отверстия, соответствующие расположению микрофлюидных элементов чипа (клеточных ячеек, микронасосов, клапанов и др.), а также служащие для подключения к нему различных емкостей (емкости с питательной средой, емкости сбора среды, емкости сбора фильтрата) и внешних модулей (например, средства создания постоянного давления); слой формовочного материала (например, полидиметилсилоксана), в котором выполнены микрофлюидные элементы чипа, включая ячейки для размещения/культивирования клеточных моделей, соединенные микрофлюидными каналами, и предметное стекло, герметизирующее микрофлюидную систему в слое формовочного материала. В частности, микрофлюидный чип по патенту RU 2648444 содержит объединенные микрофлюидными каналами, по крайней мере, шесть идентичных ячеек, предназначенных для одновременного сокультивирования клеточных моделей органов и тканей человека в проточном или замкнутом режимах. Ячейки сверху герметизированы пробками, закрепленными в пластине из поликарбоната с помощью резьбового соединения.Microfluidic chips are known from the prior art (RU 2648444, RU 2584598), which are a three-layer structure including a polycarbonate plate in which threaded holes are made corresponding to the location of the microfluidic chip elements (cell cells, micropumps, valves, etc.), as well as serving for connecting to it various containers (containers with a nutrient medium, capacity for collecting medium, capacity for collecting filtrate) and external modules (for example, means for creating constant pressure); a layer of molding material (for example, polydimethylsiloxane) in which microfluidic elements of the chip are made, including cells for placing / culturing cell models connected by microfluidic channels, and a glass slide sealing the microfluidic system in the layer of molding material. In particular, the microfluidic chip according to the patent RU 2648444 contains at least six identical cells united by microfluidic channels, designed for simultaneous co-cultivation of cell models of human organs and tissues in flowing or closed modes. The cells on top are sealed with plugs fixed in a polycarbonate plate using a threaded connection.

Известно также устройство для формирования двухслойной клеточной модели на пористой мембране культуральной вставки Трансвелл (RU 2668157). Устройство включает пластину со сквозным отверстием для герметичного размещения в нем Трансвелла, где толщина пластины обеспечивает возможность размещения мембраны Трансвелла внутри отверстия с разделением полости отверстия на две части. Причем одна часть предназначена непосредственно для размещения Трансвелла, а вторая часть предназначена для размещения среды с клетками. Кроме того, вторая часть полости имеет входное отверстие с диаметром до 3 мм для подачи клеток и/или среды, что исключает за счет сил поверхностного натяжения выход среды наружу при переворачивании пластины.A device is also known for forming a two-layer cell model on the porous membrane of the Transwell culture insert (RU 2668157). The device includes a plate with a through hole for sealing Transwell in it, where the thickness of the plate makes it possible to place the Transwell membrane inside the hole with the separation of the cavity into two parts. Moreover, one part is intended directly for the placement of Transwell, and the second part is designed to accommodate the environment with cells. In addition, the second part of the cavity has an inlet with a diameter of up to 3 mm for supplying cells and / or medium, which excludes due to the forces of surface tension the exit of the medium to the outside when the plate is turned over.

Однако известные решения характеризуются нестабильностью жизнедеятельности клеток, находящихся в Трансвеллах, что приводит к искажению измерений. При установке мембранных вставок, как правило, под мембраной образуется пузырь воздуха, который ограничивает контакт питательной среды с клетками, нарушает процессы диффузии и транспорта питательных веществ и приводит к нарушению целостности монослоя и гибели клеток. Кроме того, при подключении к клеточной ячейке насоса и реализации потока среды через нее, пузырь может сместиться в микроканал и нарушить его гидродинамические характеристики: гидравлическое сопротивление, расход, что также может привести к деформации монослоя клеток.However, the known solutions are characterized by instability of the vital activity of cells located in Transwells, which leads to a distortion of measurements. When installing membrane inserts, as a rule, an air bubble forms under the membrane, which limits the contact of the nutrient medium with cells, disrupts the processes of diffusion and transport of nutrients, and leads to a violation of the integrity of the monolayer and cell death. In addition, when a pump is connected to the cell cell and the medium flows through it, the bubble can shift into the microchannel and disrupt its hydrodynamic characteristics: flow resistance, flow rate, which can also lead to deformation of the cell monolayer.

Наиболее близкой к предлагаемому решению является конструкция микрофлюидного чипа для культивирования и/или исследования клеток или клеточных моделей, известная из патента RU 184220. Микрофлюидный чип содержит основу, включающую клеточную ячейку, выполненную с возможностью размещения в ней культуральной вставки типа Трансвелл, и снабженную пробкой, а также размещенный на основе слой из формовочного материала со сформированной микрофлюидной системой заданной топологии. При этом чип содержит также уплотнительный слой из формовочного материала, размещенный на основе со стороны, противоположной размещению слоя с микрофлюидной системой, и со стороны внутренней поверхности клеточной ячейки. Внутренняя поверхность клеточной ячейки с уплотнительным слоем имеет ступенчатый профиль и рельеф, обеспечивающий центрирование Трансвелл и вывод пузырьков воздуха, образующихся со стороны нижней поверхности мембраны Трансвелла при его установке в ячейку.Closest to the proposed solution is the design of the microfluidic chip for the cultivation and / or study of cells or cell models, known from patent RU 184220. The microfluidic chip contains a base including a cell cell configured to accommodate a Transwell culture insert and equipped with a plug, as well as a layer of molding material placed on the basis with the formed microfluidic system of a given topology. Moreover, the chip also contains a sealing layer of molding material, placed on the base from the side opposite to the placement of the layer with the microfluidic system, and from the side of the inner surface of the cell cell. The inner surface of the cell cell with a sealing layer has a stepped profile and a relief that provides centering of Transwell and the removal of air bubbles formed from the side of the lower surface of the Transwell membrane when it is installed in the cell.

Однако несмотря на наличие дополнительного уплотнительного слоя и выполнение клеточной ячейки со ступенчатым профилем, известное решение также не исключает возникновение пузырей воздуха в питательной среде под вставками Трансвелл в процессе их установки в отделение для клеток. Культивирование клеток с данными пузырьками может приводить к гибели части клеток на нижней стороне мембраны и, как следствие, снижению значений трансэпителиального электрического сопротивления (TEER). Кроме того, в известном решении отсутствует конструктивная возможность измерения TEER, являющегося важным параметром при исследовании клеточных моделей. Для измерения TEER необходимо извлечение вставки типа Трансвелл из устройства с размещением в отдельной подставке, что увеличивает риск контаминации и нарушения целостности слоев клеток за счет механических воздействий, а также не обеспечивает возможность контроля целостности и свойств слоев клеток в режиме реального времени.However, despite the presence of an additional sealing layer and the implementation of a cell cell with a stepped profile, the known solution also does not exclude the occurrence of air bubbles in the nutrient medium under the Transwell inserts during their installation in the cell compartment. The cultivation of cells with these vesicles can lead to the death of part of the cells on the lower side of the membrane and, as a result, to a decrease in transepithelial electrical resistance (TEER). In addition, the known solution lacks the constructive ability to measure TEER, which is an important parameter in the study of cell models. To measure TEER, it is necessary to remove the Transwell-type insert from the device in a separate stand, which increases the risk of contamination and disruption of the integrity of cell layers due to mechanical stresses, and also does not provide the ability to control the integrity and properties of cell layers in real time.

Технической проблемой, на решение которой направлена предлагаемая полезная модель, является разработка конструкции микрофлюидного чипа с клеточной ячейкой для сокультивирования различных типов клеток, в т.ч. используемых в модели плацентарного барьера, в динамических и/или статических условиях ростовой среды, обеспечивающего получение качественных результатов при исследовании, а также возможность контроля целостности и свойств слоев клеток в режиме реального времени.The technical problem to which the proposed utility model is directed is the development of the design of a microfluidic chip with a cell cell for co-cultivation of various types of cells, including used in the model of the placental barrier, in dynamic and / or static conditions of the growth medium, providing high-quality results in the study, as well as the ability to control the integrity and properties of cell layers in real time.

Техническим результатом является обеспечение возможности контроля целостности и свойств по меньшей мере двухслойных клеточных моделей, воспроизводящих модель плацентарного барьера в условиях in vitro, приближенных к in vivo, в режиме реального времени.The technical result is the ability to control the integrity and properties of at least two-layer cell models that reproduce the model of the placental barrier in vitro, close to in vivo, in real time.

Полезная модель обеспечивает в т.ч. получение более точных результатов измерения трансэпителиального электрического сопротивления двухслойных клеточных моделей плацентарного барьера, за счет снижения риска повреждения или гибели клеток как в процессе их культивирования, так и в процессе самого исследования, исключающих образование пузырьков воздуха в питательной среде, негативно влияющих на результаты исследований.The utility model provides obtaining more accurate results of measuring the transepithelial electrical resistance of bilayer cell models of the placental barrier, by reducing the risk of damage or death of cells both during their cultivation and in the process of the study itself, eliminating the formation of air bubbles in the nutrient medium that negatively affect the results of the studies.

Технический результат достигается за счет создания микрофлюидного чипа для культивирования и исследования клеточных моделей, включающего верхнюю и нижнюю пластины из твердого оптически прозрачного материала, и размещенный между пластинами слой формовочного оптически прозрачного материала с расположенной в нем микрофлюидной системой, при этом верхняя пластина, расположенная на слое формовочного материала, выполнена меньшей площади, а слой формовочного материала в области, свободной от верхней пластины, снабжен четырьмя элементами для подключения внешней среды, выполненными в виде углублений в слое формовочного материала, связанных с микрофлюидной системой; при этом микрофлюидная система образована клеточной ячейкой, выполненной в виде сквозного отверстия в слое формовочного материала, поперечно разделенного пористой мембраной, и двумя группами подводящих и отводящих микрофлюидных каналов, выполненных на поверхностях слоя формовочного материала, загерметизированными верхней и нижней пластинами; при этом подводящий и отводящий каналы первой группы выполнены в виде канавок Г-образной формы на нижней поверхности слоя формовочного материала, каждый из которых соединен одним концом - с клеточной ячейкой, а другим - с соответствующим углублением для доступа внешней среды к клеточной ячейке; подводящий и отводящий каналы второй группы образованы двумя прямолинейными сегментами, один из которых расположен на нижней поверхности слоя формовочного материала и соединен с соответствующим углублением для доступа внешней среды, а второй сегмент - расположен на верхней поверхности слоя формовочного материала и соединен с клеточной ячейкой; слой формовочного материала снабжен выемкой для подключения измерительного модуля с одной из торцевых сторон чипа, при этом каждая из пластин со стороны слоя формовочного материала снабжена двумя электродами, расположенными в области проекции клеточной ячейки, и двумя контактными площадками для подключения к измерительному модулю, расположенными в области выемки и соединенными с электродами.The technical result is achieved by creating a microfluidic chip for the cultivation and study of cell models, including the upper and lower plates of a solid optically transparent material, and a layer of molding optically transparent material placed between the plates with a microfluidic system located in it, with the upper plate located on the layer the molding material is made of a smaller area, and the layer of molding material in the region free of the upper plate is equipped with four elements d To connect the environment, made in the form of recesses in the layer of molding material associated with the microfluidic system; wherein the microfluidic system is formed by a cell cell made in the form of a through hole in the layer of molding material transversely separated by a porous membrane, and two groups of inlet and outlet microfluidic channels made on the surfaces of the layer of molding material, sealed by the upper and lower plates; the inlet and outlet channels of the first group are made in the form of grooves of a L-shaped form on the lower surface of the layer of molding material, each of which is connected at one end to the cell cell, and the other to the corresponding recess for environmental access to the cell cell; the inlet and outlet channels of the second group are formed by two rectilinear segments, one of which is located on the lower surface of the molding material layer and connected to the corresponding recess for access of the external environment, and the second segment is located on the upper surface of the molding material layer and connected to the cell cell; the layer of molding material is provided with a recess for connecting the measuring module from one of the end sides of the chip, while each of the plates on the side of the layer of molding material is equipped with two electrodes located in the projection area of the cell cell and two contact pads for connecting to the measuring module located in the region notches and connected to the electrodes.

При этом первый и второй сегменты подводящего и отводящего каналов второй группы расположены под прямым углом друг к другу и соединены между собой через дополнительное сквозное отверстие в слое формовочного материала.In this case, the first and second segments of the inlet and outlet channels of the second group are located at right angles to each other and are interconnected through an additional through hole in the layer of molding material.

Два электрода каждой из пластин расположены параллельно друг другу.Two electrodes of each of the plates are parallel to each other.

Слой формовочного материала в области расположения элементов для подключения внешней среды выполнен утолщенным, при этом элементы расположены симметрично относительно клеточной ячейки, по два на противоположных сторонах чипа.The layer of molding material in the area of the arrangement of elements for connecting the external environment is thickened, while the elements are located symmetrically relative to the cell cell, two on opposite sides of the chip.

Элементы для подключения внешней среды выполнены в виде углублений цилиндрической формы и снабжены сужениями в нижней части для обеспечения плотного контакта с устройством ввода внешней среды.Elements for connecting the external environment are made in the form of recesses of a cylindrical shape and equipped with constrictions in the lower part to ensure tight contact with the input device of the external environment.

Подводящие и отводящие каналы выполнены прямоугольного сечения высотой от 0,5 мм до 2 мм и шириной от 0,2 до 1 мм, при этом диаметр клеточной ячейки составляет от 3 до 6 мм.The inlet and outlet channels are made of rectangular cross section with a height of 0.5 mm to 2 mm and a width of 0.2 to 1 mm, while the diameter of the cell cell is from 3 to 6 mm.

Верхняя и нижняя пластины выполнены толщиной от 0,16 до 2 мм, слой формовочного материала, расположенный между пластинами, выполнен толщиной от 1 до 4 мм, слой формовочного материала в области расположения элементов для подключения внешней среды выполнен толщиной от 5 до 10 мм.The upper and lower plates are made with a thickness of 0.16 to 2 mm, the layer of molding material located between the plates is made of a thickness of 1 to 4 mm, the layer of molding material in the area of the arrangement of elements for connecting the external environment is made of a thickness of 5 to 10 mm.

Подводящие и отводящие каналы в области соединения с клеточной ячейкой имеют округлое расширение с радиусом кривизны от 0,5 до 4 мм.The inlet and outlet channels in the area of connection with the cell cell have a rounded extension with a radius of curvature from 0.5 to 4 mm.

В качестве формовочного материала использован полидиметилсилоксан, верхняя и нижняя пластины выполнены из стекла.Polydimethylsiloxane was used as molding material; the upper and lower plates are made of glass.

Микрофлюидный чип может быть снабжен крышкой, выполненной с возможностью уплотнения в углублениях для доступа внешней среды к микрофлюидной системе.The microfluidic chip may be provided with a cover configured to seal in the recesses for access of the external environment to the microfluidic system.

Мембрана может быть выполнена из полиэстера, поликарбоната или политетрафторэтилена, диаметром от 4,26±0,50 мм до 24±0,5 мм, с диаметром пор от 0,4 до 8,0 мкм и плотностью от 1×10⁵ до 1×10⁸ пор на 1 см².The membrane can be made of polyester, polycarbonate or polytetrafluoroethylene, with a diameter of 4.26 ± 0.50 mm to 24 ± 0.5 mm, with a pore diameter of 0.4 to 8.0 μm and a density of 1 × 10 ⁵ to 1 × 10 ⁸ pores per 1 cm ² .

В качестве измерительного модуля может быть использовано устройство измерения сопротивления монослоя клеток.As a measuring module, a device for measuring the resistance of a monolayer of cells can be used.

Микрофлюидный чип может быть выполнен с габаритными размерами, не превышающими 35-80 мм × 20-30 мм.The microfluidic chip can be made with overall dimensions not exceeding 35-80 mm × 20-30 mm.

Таким образом, предлагаемая конструкция чипа за счет интегрированной внутри него клеточной ячейки с пористой мембраной и системой подводящих и отводящих каналов, а также системы электродов, позволяет производить необходимые исследования в режиме реального времени без предварительных операций установки Трансвелла с клетками в ячейку и его извлечения, что снижает риск повреждения или гибели клеток, и, как следствие, приводит к более точным результатам измерений. Конфигурация каналов обеспечивает исключение образования в них пузырей воздуха в процессе транспорта питательной среды, что позволяет сохранить целостность монослоя клеток. За счет интегрированной непосредственно в чип системы электродов, предлагаемое устройство позволяет контролировать изменение трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) многослойной модели без нарушения целостности барьера, а также определять другие электрические свойства модели, такие как фоновое сопротивление, электрическая емкость и другие показатели, извлекаемые при импедансной спектрометрии.Thus, the proposed chip design due to the integrated cell cell inside it with a porous membrane and a system of input and output channels, as well as a system of electrodes, allows to carry out the necessary studies in real time without preliminary operations of installing Transwell with cells into the cell and its extraction, which reduces the risk of cell damage or death, and, as a result, leads to more accurate measurement results. The configuration of the channels ensures the elimination of the formation of air bubbles in them during the transport of the nutrient medium, which allows to maintain the integrity of the monolayer of cells. Due to the electrode system integrated directly into the chip, the proposed device allows controlling the change in transepithelial electrical resistance (TEER) of the multilayer model without violating the integrity of the barrier, as well as determining other electrical properties of the model, such as background resistance, electric capacitance, and other indicators extracted by impedance spectrometry .

Полезная модель поясняется чертежами, где на фиг. 1 представлен общий вид микрофлюидного чипа, на фиг. 2. представлено пространственное расположение микрофлюидной системы и электродов заявляемого чипа, на фиг. 3 представлен разрез чипа в сборе, на фиг. 4 - общий вид чипа с платой коммутации.The utility model is illustrated by drawings, where in FIG. 1 is a perspective view of a microfluidic chip; FIG. 2. shows the spatial arrangement of the microfluidic system and the electrodes of the inventive chip, FIG. 3 shows a section through a chip assembly; FIG. 4 is a general view of a chip with a switching board.

Позициями на чертежах обозначены: 1 - верхняя пластина; 2 - нижняя пластина; 3 -слой формовочного оптически прозрачного материала; 4-7 - элементы для подключения внешней среды; 8 - зона сужения в нижней части элементов для подключения внешней среды (например, для уплотнения носика пипетки, помогающее быстрому вводу среды); 9 - клеточная ячейка; 10 - пористая мембрана, 11, 12 - подводящие микрофлюидные каналы; 13, 14 - отводящие микрофлюидные каналы; 15 - сквозное отверстие в слое формовочного материала, соединяющее первый и второй сегменты каждого из каналов 12, 14; 16 - выемка для подключения измерительного модуля; 17 - плата коммутации; 18, 19 - электроды верхней пластины; 20, 21 - электроды нижней пластины; 22-25 - контактные площадки электродов для подключения к измерительному модулю; 26, 27 - контакты на плате коммутации для верхних электродов; 28, 29 - контакты на плате коммутации для нижних электродов; 30, 31 - сегменты подводящего канала 12; 32, 33 - сегменты отводящего канала 14.The positions in the drawings indicate: 1 - upper plate; 2 - bottom plate; 3-layer molding optically transparent material; 4-7 - elements for connecting the external environment; 8 - a narrowing zone at the bottom of the elements for connecting the external environment (for example, to seal the nozzle of the pipette, which helps to quickly enter the medium); 9 - cell cell; 10 - porous membrane, 11, 12 - microfluidic supply channels; 13, 14 - discharge microfluidic channels; 15 is a through hole in the layer of molding material connecting the first and second segments of each of the channels 12, 14; 16 - recess for connecting the measuring module; 17 - switching board; 18, 19 - electrodes of the upper plate; 20, 21 - electrodes of the lower plate; 22-25 - contact pads of the electrodes for connection to the measuring module; 26, 27 - contacts on the switching board for the upper electrodes; 28, 29 - contacts on the switching board for the lower electrodes; 30, 31 - segments of the inlet channel 12; 32, 33 - segments of the outlet channel 14.

Микрофлюидный чип для культивирования и/или исследования клеток или клеточных моделей включает верхнюю 1 и нижнюю 2 пластины из твердого оптически прозрачного материала, преимущественно, стекла, и размещенный между пластинами слой 3 формовочного оптически прозрачного материала с расположенной в нем микрофлюидной системой. При этом верхняя пластина 1 выполнена меньшей площади по сравнению с пластиной 2 и расположена на слое 3 формовочного материала в центральной части. Слой формовочного материала в области, свободной от верхней пластины, снабжен четырьмя элементами 4-7 для подключения внешней среды (обеспечивающими доступ внешней среды к микрофлюидной системе), выполненными в виде углублений в слое формовочного материала, связанных с микрофлюидной системой. В качестве внешней среды могут выступать культуральные среды для клеток любого состава, в том числе среды с использованием сыворотки животных и бессывороточные среды, а также другие изотонические растворы, которые позволяют в течение необходимого времени поддерживать целостность клеток. Элементы 4-7 расположены симметрично относительно центра чипа, по два на его противоположных сторонах. При этом в области расположения данных элементов слой формовочного материала выполнен утолщенным. Углубления выполнены цилиндрической формы и снабжены сужениями 8 в нижней части, обеспечивающими плотный контакт с устройством ввода внешней среды (например, наконечником пипетки).The microfluidic chip for culturing and / or researching cells or cell models includes the upper 1 and lower 2 plates of a solid optically transparent material, mainly glass, and a layer 3 of the forming optically transparent material located between the plates with a microfluidic system located inside it. In this case, the upper plate 1 is made of a smaller area in comparison with the plate 2 and is located on the layer 3 of the molding material in the central part. The layer of molding material in the area free from the upper plate is equipped with four elements 4-7 for connecting the external environment (providing access to the external environment to the microfluidic system), made in the form of recesses in the layer of molding material associated with the microfluidic system. Culture media for cells of any composition, including media using animal serum and serum-free media, as well as other isotonic solutions that can maintain cell integrity for the necessary time, can serve as the external environment. Elements 4-7 are located symmetrically relative to the center of the chip, two on its opposite sides. Moreover, in the area of the location of these elements, the layer of molding material is made thickened. The recesses are cylindrical in shape and are provided with constrictions 8 in the lower part, providing close contact with the input device of the external environment (for example, pipette tip).

Микрофлюидная система, расположенная в слое 3 формовочного материала, образована клеточной ячейкой 9 и двумя группами подводящих 11, 12 и отводящих 13, 14 микрофлюидных каналов, связанных с клеточной ячейкой. При этом клеточная ячейка 9 расположена в центре чипа и выполнена в виде сквозного отверстия в слое формовочного материала, поперечно разделенного пористой мембраной 10, и загерметизирована сверху и снизу пластинами 1 и 2, соответственно. Подводящие 11, 12 и отводящие 13, 14 микрофлюидные каналы выполнены на нижней и верхней поверхностях слоя 3 формовочного материала и также загерметизированы верхней и нижней пластинами. При этом подводящий 11 и отводящий 13 каналы первой группы выполнены в виде канавок Г-образной формы на нижней поверхности слоя формовочного материала, и загерметизированы снизу пластиной 2, образующей нижние стенки каналов. Каждый из каналов 11, 13 соединен одним концом - с клеточной ячейкой 9, а другим - с соответствующим углублением 4, 5 для доступа внешней среды к клеточной ячейке. Подводящий 12 и отводящий 14 каналы второй группы образованы двумя прямолинейными сегментами 30, 31 и 32, 33, соответственно. Сегменты 30, 32 расположены на нижней поверхности слоя формовочного материала, загерметизированы снизу пластиной 2 и соединены с соответствующими элементами подключения внешней среды, а сегменты 31, 33 расположены под прямым углом к сегментам 30, 32 на верхней поверхности слоя формовочного материала, загерметизированы сверху пластиной 1 и соединены с клеточной ячейкой 9, при этом сегменты 30, 32 и 31, 33 каждого из каналов соединены между собой через сквозные отверстия 15 в слое формовочного материала. Таким образом, сегменты, образующие каналы 12, 14 расположены перпендикулярно друг другу и находятся в параллельных плоскостях, а пористая мембрана 10 разделяет каналы, расположенные на нижней и верхней поверхности слоя формовочного материала. Данная конфигурация позволяет осуществить бесперебойный транспорт жидкости, а также дает возможность дальнейшей мультипликации уровней и каналов микрофлюидной системы. Клеточная ячейка 9, являющаяся общей для подводящих и отводящих каналов, оказывается разделенной пористой мембраной 10, интегрированной в слой формовочного материала в средней плоскости, на две идентичные и независимые части - верхнюю и нижнюю, что позволяет проводить оценку транспорта ксенобиотиков через плацентарный барьер при разработке новых лекарственных средств. При этом подводящий и отводящий каналы 11,13 проходят под мембраной 10 и предназначены для циркуляции питательной среды, поступающей из элемента подключения внешней среды 5 через клеточную ячейку. За счет отсутствия выступов и перепада давления каналы заполняются равномерно без образования пузырей.The microfluidic system located in the layer 3 of the molding material is formed by a cell cell 9 and two groups of inlet 11, 12 and outlet 13, 14 microfluidic channels associated with the cell. In this case, the cell cell 9 is located in the center of the chip and is made in the form of a through hole in the layer of molding material transversely separated by a porous membrane 10, and is sealed from above and below by plates 1 and 2, respectively. Inlet 11, 12 and outlet 13, 14 microfluidic channels are made on the lower and upper surfaces of the layer 3 of the molding material and are also sealed by the upper and lower plates. In this case, the inlet 11 and outlet 13 channels of the first group are made in the form of grooves of an L-shaped form on the lower surface of the layer of molding material, and are sealed from below by a plate 2 forming the lower walls of the channels. Each of the channels 11, 13 is connected at one end - with the cell cell 9, and the other with the corresponding recess 4, 5 for access of the external environment to the cell cell. The inlet 12 and outlet 14 channels of the second group are formed by two rectilinear segments 30, 31 and 32, 33, respectively. Segments 30, 32 are located on the lower surface of the molding material layer, are sealed from below by a plate 2 and connected to the corresponding environmental connection elements, and segments 31, 33 are located at right angles to segments 30, 32 on the upper surface of the molding material layer, are sealed from above by the plate 1 and connected to the cell cell 9, while the segments 30, 32 and 31, 33 of each of the channels are interconnected through the through holes 15 in the layer of molding material. Thus, the segments forming the channels 12, 14 are perpendicular to each other and are in parallel planes, and the porous membrane 10 separates the channels located on the lower and upper surface of the layer of molding material. This configuration allows for uninterrupted fluid transport, and also allows the further multiplication of levels and channels of the microfluidic system. The cell cell 9, which is common for the inlet and outlet channels, turns out to be divided by a porous membrane 10, integrated into the layer of the molding material in the middle plane, into two identical and independent parts - the upper and lower ones, which allows us to evaluate the transport of xenobiotics through the placental barrier when developing new medicines. In this case, the inlet and outlet channels 11.13 pass under the membrane 10 and are designed to circulate the nutrient medium coming from the external medium connection element 5 through the cell cell. Due to the absence of protrusions and pressure drop, the channels are filled evenly without the formation of bubbles.

Подводящие и отводящие каналы могут быть выполнены прямоугольного сечения высотой от 0,5 мм до 2 мм и шириной от 0,2 до 1 мм, диаметр клеточной ячейки может составлять от 3 до 6 мм. В области соединения с клеточной ячейкой подводящие и отводящие каналы имеют округлое расширение с радиусом кривизны от 0,5 до 4 мм. Верхняя 1 и нижняя 2 пластины могут быть выполнены толщиной от 0,16 до 2 мм. Слой 3 формовочного материала, расположенный между пластинами 1 и 2, может быть выполнен толщиной от 1 до 4 мм, а в области расположения элементов для подключения внешней среды - толщиной от 5 до 10 мм. Предлагаемый микрофлюидный чип выполнен с габаритными размерами, не превышающими 35-80 мм × 20-30 мм.The inlet and outlet channels can be made of rectangular cross section with a height of 0.5 mm to 2 mm and a width of 0.2 to 1 mm, the diameter of the cell cell can be from 3 to 6 mm. In the area of connection with the cell cell, the inlet and outlet channels have a rounded extension with a radius of curvature from 0.5 to 4 mm. The upper 1 and lower 2 plates can be made with a thickness of 0.16 to 2 mm. The layer 3 of molding material located between the plates 1 and 2 can be made with a thickness of 1 to 4 mm, and in the area of the arrangement of elements for connecting the external environment with a thickness of 5 to 10 mm. The proposed microfluidic chip is made with overall dimensions not exceeding 35-80 mm × 20-30 mm.

Слой 3 формовочного материала снабжен выемкой 16 для подключения измерительного модуля, например, устройства измерения сопротивления монослоя клеток, с одной из торцевых сторон чипа. Каждая из пластин 1, 2 со стороны слоя формовочного материала снабжена двумя электродами 18, 19 и 20, 21, соответственно, расположенными параллельно друг другу в области проекции клеточной ячейки, а также двумя контактными площадками 22, 23 и 24, 25 для подключения к измерительному модулю. Контактные площадки 22-25 расположены в области выемки и соединены с электродами 18-21, соответственно. При этом конфигурация электродов 18-21 выполнена таким образом, чтобы осуществить контакт с клеточной ячейкой и избежать контакта с каналами микрофлюидной системы. Коммутация электродов измерительного модуля может осуществляться посредством платы коммутации 17 с верхними 26, 27 и нижними 28, 29 контактными площадками, которая подключается к чипу через выемку 16. При этом плата коммутации снабжена разъемом для подключения внешнего измерительного модуля (устройства измерения TEER или импедансного спектра). Выемка 16 может быть выполнена в форме прямоугольника со скругленными углами в проекции на плоскость пластины. Размер и форму выемки выбирают в соответствии с размером и формой подключаемого устройства.Layer 3 of the molding material is provided with a recess 16 for connecting a measuring module, for example, a device for measuring the resistance of a monolayer of cells, from one of the end sides of the chip. Each of the plates 1, 2 from the side of the molding material layer is equipped with two electrodes 18, 19 and 20, 21, respectively, located parallel to each other in the projection area of the cell cell, as well as two contact pads 22, 23 and 24, 25 for connecting to the measuring to the module. The pads 22-25 are located in the recess area and are connected to the electrodes 18-21, respectively. In this case, the configuration of the electrodes 18-21 is made in such a way as to make contact with the cell cell and to avoid contact with the channels of the microfluidic system. The electrodes of the measuring module can be switched by means of a switching board 17 with the upper 26, 27 and lower 28, 29 contact pads, which is connected to the chip through the recess 16. In this case, the switching board is equipped with a connector for connecting an external measuring module (TEER measuring device or impedance spectrum) . The recess 16 may be made in the form of a rectangle with rounded corners in the projection onto the plane of the plate. The size and shape of the recess is selected in accordance with the size and shape of the connected device.

В качестве формовочного материала могут быть использованы эластичные термопласты или реактопласты, например, силоксаны, полиуретаны, полимеры OSTE+. В предпочтительном варианте осуществления полезной модели в качестве формовочного материала используют газопроницаемый эластичный органический материал -полидиметилсилоксан (ПДМС).As molding material, elastic thermoplastics or thermosets, for example, siloxanes, polyurethanes, OSTE + polymers, can be used. In a preferred embodiment of the utility model, a gas-permeable elastic organic material, polydimethylsiloxane (PDMS), is used as the molding material.

Элементы 4-7 могут служить, например, для герметичного подключения системы подачи воздуха к чипу и/или уплотнения размещаемых в углублениях крышек или пробок. Микрофлюидный чип может быть снабжен крышкой, выполненной с возможностью уплотнения в элементах 4-7 для доступа внешней среды к микрофлюидной системе. Данная крышка может представлять собой монолитную деталь, выполненную, например, из полистирола, и снабженную выступами, расположенными с возможностью одновременной герметизации всех углублений чипа, которая заменяет несколько отдельных резьбовых крышек и уплотнителей к ним, создающих избыточное давление при закручивании. При этом форма и взаимное расположение выступов соответствуют внутренней форме и взаимному расположению углублений 4-7. Крышка может быть выполнена с возможностью введения через нее различных растворов и отбора проб циркулирующей питательной среды или фильтрата, и снабжена встроенными трубками, сообщающимися с углубления 4-7.Elements 4-7 can serve, for example, for tightly connecting the air supply system to the chip and / or for sealing lids or plugs placed in recesses. The microfluidic chip may be provided with a cover configured to seal in the elements 4-7 for access of the external environment to the microfluidic system. This cover can be a monolithic part made, for example, of polystyrene, and equipped with protrusions located with the possibility of simultaneous sealing of all recesses of the chip, which replaces several individual threaded covers and seals to them, creating excessive pressure when twisting. Moreover, the shape and relative position of the protrusions correspond to the internal shape and relative position of the recesses 4-7. The lid can be made with the possibility of introducing various solutions through it and sampling the circulating nutrient medium or filtrate, and is equipped with built-in tubes communicating from the recess 4-7.

Мембрана 10 может быть выполнена из полиэстера, поликарбоната или политетрафторэтилена, диаметром от 4,26±0,50 мм до 24±0,5 мм (площадью от 0,143 до 4,67 см²), с диаметром пор от 0,4 до 8,0 мкм и плотностью пор от 1×10⁵ до 1×10⁸ пор на 1 см².The membrane 10 can be made of polyester, polycarbonate or polytetrafluoroethylene, with a diameter of 4.26 ± 0.50 mm to 24 ± 0.5 mm (area from 0.143 to 4.67 cm ² ), with a pore diameter of from 0.4 to 8 , 0 μm and a pore density of from 1 × 10 ⁵ to 1 × 10 ⁸ pores per 1 cm ² .

Предлагаемый чип может быть изготовлен с использованием оснастки по патентам РФ №№2675998, 2658495. При этом в оснастке формируют слой формовочного материала с микрофлюидной системой заданной топологии (заготовку чипа). Внутренняя поверхность оснастки содержит рельеф, который в результате отливки на нем слоя формовочного материала формирует предлагаемую структуру микрофлюидной системы, в т.ч. траекторию транспорта питательной среды в чипе (конфигурацию микроканалов). При этом в процессе изготовления чипа в оснастку устанавливают мембрану, после чего производят отливку чипа, в результате чего мембрана оказывается интегрированной в чип.The proposed chip can be made using snap-in equipment according to RF patents Nos. 2675998, 2658495. In this case, a layer of molding material with a microfluidic system of a given topology (chip blank) is formed in the snap-in. The inner surface of the snap contains a relief, which, as a result of casting a layer of molding material on it, forms the proposed structure of the microfluidic system, including the path of the nutrient medium transport in the chip (microchannel configuration). At the same time, in the process of manufacturing the chip, a membrane is installed in the equipment, after which the chip is cast, as a result of which the membrane is integrated into the chip.

На верхней и нижней поверхностях полученной заготовки чипа любым известным из уровня техники методом фиксируют пластины из оптически прозрачного материала (например, стекла), обеспечивающие герметизацию клеточной ячейки и микроканалов и формирующие верхний и нижний слои чипа.On the upper and lower surfaces of the obtained chip blank, plates of an optically transparent material (for example, glass) are fixed by any method known in the art, which provide sealing of the cell cell and microchannels and form the upper and lower layers of the chip.

Фиксация пластин на поверхностях заготовки может быть осуществлена в соответствии со способом, описанным в патенте RU 2658495.The fixing of the plates on the surfaces of the workpiece can be carried out in accordance with the method described in patent RU 2658495.

Электроды 18-21 могут быть нанесены на стеклянные пластины 1, 2 ионно-вакуумным напылением. Напыление осуществляют через трафарет в два этапа: первым наносят титан, имеющий повышенную адгезию к стеклу, а сверху наносят золото, являющееся инертным материалом. Электроды могут быть изготовлены из золотой или из серебряной проволоки.Electrodes 18-21 can be deposited on glass plates 1, 2 by ion-vacuum sputtering. Spraying is carried out through a stencil in two stages: the first is titanium, which has increased adhesion to the glass, and gold, which is an inert material, is applied on top. The electrodes can be made of gold or silver wire.

Работа устройства.The operation of the device.

С помощью пипетки, размещаемой в углублении 5, через зону сужения 8, где происходит уплотнение носика пипетки, предотвращающее вытекание, осуществляют ввод клеток в клеточную ячейку 9 по каналу 11. Затем чип переворачивают и выдерживают в данном положении около двух часов, чтобы дать возможность клеткам прикрепиться к поверхности мембраны 10 с формированием нижнего монослоя клеток (45 мкл). Далее с помощью пипетки, размещаемой в углублении 4, аналогичным образом осуществляют ввод клеток в клеточную ячейку 9 по каналу 12 для формирования верхнего монослоя клеток (45 мкл) и выдерживают в течение времени, обеспечивающем прикрепление клеток к мембране (около двух часов). При этом для создания плацентарного барьера нижний канал 11 заполняют суспензией клеток HUVEC (или аналогичными, имитирующими свойства эндотелия) в расчете от 10 до 50 тыс.клеток на 1 см² мембраны, а верхний 12 - клетками BeWo b30 (или аналогичными, имитирующими свойства трофобласта) в расчете от 10 до 50 тыс. клеток на 1 см² мембраны. Затем через элементы 4, 5 подключают поток внешней культуральной среды. За счет подводящего давления со стороны элемента 4 осуществляется транспорт питательной среды в верхний сегмент подводящего канала 12, и через клеточную ячейку 9 - в отводящий канал 14; и из элемента 5 - в подводящий канал 11 и через клеточную ячейку 9 - в отводящий канал 13. С помощью перистальтического насоса или насоса с постоянным давлением осуществляют движение питательной среды по указанным каналам и клетки культивируются в динамическом потоке. В случае отключения насоса среда останавливается и клетки культивируются в условиях статичной питательной среды. При этом динамический поток среды может иметь скорость от 2 до 100 мкл/мин.Using a pipette located in the recess 5, through the narrowing zone 8, where the pipette nozzle is sealed to prevent leakage, the cells are introduced into the cell cell 9 through channel 11. Then the chip is turned over and held in this position for about two hours to allow cells attach to the surface of the membrane 10 with the formation of the lower monolayer of cells (45 μl). Next, using a pipette located in the recess 4, the cells are introduced into the cell 9 in a similar manner through channel 12 to form the upper monolayer of cells (45 μl) and incubated for a period of time ensuring the cells attach to the membrane (about two hours). At the same time, to create a placental barrier, the lower channel 11 is filled with a suspension of HUVEC cells (or similar, mimicking the properties of the endothelium) per 10 to 50 thousand cells per 1 cm ^{2 of the} membrane, and the upper 12 with BeWo b30 cells (or similar, mimicking the properties of trophoblast ) calculated from 10 to 50 thousand cells per 1 cm ^{2 of} membrane. Then through the elements 4, 5 connect the flow of the external culture medium. Due to the inlet pressure from the element 4 side, the nutrient medium is transported to the upper segment of the inlet channel 12, and through the cell cell 9 to the outlet channel 14; and from element 5 to the inlet channel 11 and through the cell cell 9 to the outlet channel 13. Using a peristaltic pump or a constant pressure pump, the nutrient medium is moved through these channels and the cells are cultured in a dynamic stream. In the event of a pump shutdown, the medium stops and the cells are cultured in a static nutrient medium. In this case, the dynamic flow of the medium can have a speed of 2 to 100 μl / min.

В результате все клетки, размещенные со стороны нижней поверхности пористой мембраны 10, контактируют с культуральной средой, поступающей по каналу 11, а клетки, размещенные со стороны верхней поверхности пористой мембраны 10 - поступающей по каналу 12, что обеспечивает условия для дальнейшего роста и поддержания жизнеспособности клеток.As a result, all cells placed on the side of the lower surface of the porous membrane 10 are in contact with the culture medium entering through the channel 11, and cells placed on the side of the upper surface of the porous membrane 10 are coming in through the channel 12, which provides conditions for further growth and maintenance of viability cells.

Клетки на верхней поверхности пористой мембраны находятся в условиях статичной культуральной среды, а клетки на нижней поверхности - в условиях динамического потока культуральной среды, создающего напряжение сдвига. Такие условия имитируют физиологические условия биологических барьеров в живом организме. Так, в плацентарном барьере клетки трофобласта окружены кровью матери, которая не имеет постоянного потока, а клетки эндотелия постоянно омываются движущейся по сосудам кровью плода. Подобным образом устроены и другие биологические барьеры в живом организме (гематоэнцефалический барьер, кишечный барьер и др.). Таким образом, получаемая с помощью разработанной ячейки модель биологического барьера in vitro имитирует реальные физиологические условия, позволяя изучать свойства данных барьеров в стандартизированном окружении.The cells on the upper surface of the porous membrane are in a static culture medium, and the cells on the lower surface are in a dynamic flow of the culture medium, creating a shear stress. Such conditions mimic the physiological conditions of biological barriers in a living organism. So, in the placental barrier, the trophoblast cells are surrounded by the mother’s blood, which does not have a constant flow, and the endothelial cells are constantly washed by the fetal blood moving through the vessels. Other biological barriers in a living organism (blood-brain barrier, intestinal barrier, etc.) are similarly arranged. Thus, the in vitro model of the biological barrier obtained using the developed cell imitates real physiological conditions, making it possible to study the properties of these barriers in a standardized environment.

С помощью платы коммутации к чипу подключают измерительный модуль, обеспечивающий измерение сопротивления и/или импедансного спектра монослоя клеток.Using a switching board, a measuring module is connected to the chip, which provides the measurement of the resistance and / or impedance spectrum of the cell monolayer.

Таким образом, предлагаемый чип может быть использован для культивирования двухслойных клеточных моделей биологических барьеров, выращенных на пористой мембране, интегрированной внутри чипа, а также для исследования клеточной модели, сформированной на пористой мембране с противоположных ее сторон, имитирующей модель плаценты. При этом с помощью данного устройства возможны также изучение фетоплацентарного барьера в статическом или динамическом режиме ростовой среды, оценка целостности барьера, образованного слоем клеток, имитирующих эндотелий, и слоем клеток, имитирующих трофобласт, изучение газового обмена в плаценте и др. в условиях in vitro, приближенных к in vivo. Кроме того, заявляемое устройство может использоваться не только для формирования и исследования модели плаценты, но и моделей кишечного барьера, гематоэнцефалического барьера и других гемато-тканевых и многослойных барьеров.Thus, the proposed chip can be used to cultivate two-layer cell models of biological barriers grown on a porous membrane integrated inside the chip, as well as to study a cell model formed on a porous membrane from opposite sides that imitates the placenta model. Moreover, using this device, it is also possible to study the placental barrier in a static or dynamic mode of a growth medium, assess the integrity of the barrier formed by a layer of cells simulating endothelium, and a layer of cells simulating trophoblast, studying gas exchange in the placenta, etc. in vitro, close to in vivo. In addition, the claimed device can be used not only for the formation and study of the model of the placenta, but also models of the intestinal barrier, blood-brain barrier and other blood-tissue and multilayer barriers.

Было проведено сокультивирование клеточных моделей плацентарного барьера в клеточной ячейке предлагаемого чипа и в клеточной ячейке чипа со ступенчатым профилем дна ячейки (прототип), с размещенной в ней вставкой Transwell. Сокультивирование осуществляли в течение 24 ч при скорости потока среды 25 мкл/мин. При этом определенная скорость питательной среды была достигнута благодаря подключению к чипу микронасоса. После периода культивирования осуществляли измерение трансэпителиального электрического сопротивления (см. таблицу) клеток в предлагаемом чипе путем его подключения к измерительному модулю (прибору EVOM-Epithelial Voltohmmeter, https://www.wpiinc.coni/var-2754-epithelial-volt-ohm-teer-meter), а также в чипе-прототипе, для чего вставку Transwell с клетками извлекали из клеточной ячейки чипа, а затем помещали в подставку с клеточной питательной средой для анализа трансэпителиального электрического сопротивления с помощью прибора EVOM. При этом процедура измерения EVOM включает в себя измерение сопротивления в пустой ячейке с полупроницаемой мембраной без клеток и измерение сопротивления через слой клеток на полупроницаемой мембране. Значение TEER определяется путем вычитания из второго значения первого значения. Эксперимент был проведен в 6 повторах, в каждом из которых использовался новый отдельный чип с клеточной ячейкой и моделью плацентарного барьера. Клеточные модели для каждого повтора выращивались параллельно и независимо в одинаковых условиях.The cell models of the placental barrier were co-cultivated in the cell cell of the proposed chip and in the cell cell of the chip with a step profile of the cell bottom (prototype), with the Transwell insert placed in it. Co-cultivation was carried out for 24 hours at a medium flow rate of 25 μl / min. At the same time, a certain speed of the nutrient medium was achieved by connecting a micropump to the chip. After the cultivation period, the transepithelial electrical resistance was measured (see table) of the cells in the proposed chip by connecting it to the measuring module (EVOM-Epithelial Voltohmmeter device, https: //www.wpiinc.coni/var-2754-epithelial-volt-ohm- teer-meter), as well as in the prototype chip, for which the Transwell insert with cells was removed from the cell of the chip, and then placed in a stand with cell culture medium for analysis of transepithelial electrical resistance using an EVOM device. The EVOM measurement procedure includes resistance measurement in an empty cell with a semipermeable membrane without cells and resistance measurement through a layer of cells on a semipermeable membrane. The TEER value is determined by subtracting the first value from the second value. The experiment was carried out in 6 repetitions, each of which used a new separate chip with a cell cell and a model of the placental barrier. Cell models for each repeat were grown in parallel and independently under the same conditions.

Проведенные исследования показали, что в процессе установки вставок в клеточные ячейки чипа-прототипа часто наблюдалось образование пузырей воздуха в питательной среде под вставками Transwell. Культивирование клеток с данными пузырями приводило к неоптимальным условиям для клеток на нижней стороне мембраны и, как следствие, снижению значений TEER. При использовании предлагаемого чипа образование пузырей воздуха не наблюдалось, измеренные значения TEER превышали значения TEER монослоя клеток, полученного в чипе-прототипе, в среднем на 15-20%, что свидетельствует о меньшем количестве поврежденных или погибших клеток как в процессе их культивирования, так и в процессе исследования.Studies have shown that during the installation of the inserts in the cell cells of the prototype chip, the formation of air bubbles in the culture medium under the Transwell inserts was often observed. The cultivation of cells with these bubbles led to non-optimal conditions for cells on the lower side of the membrane and, as a result, a decrease in TEER values. When using the proposed chip, the formation of air bubbles was not observed, the measured TEER values exceeded the TEER values of the cell monolayer obtained in the prototype chip by an average of 15-20%, which indicates a smaller number of damaged or dead cells both during their cultivation and in the process of research.

Claims

1. Microfluidic chip for the cultivation and research of cellular models, including the upper and lower plates of solid optically transparent material and a layer of forming optically transparent material placed between the plates with a microfluidic system located in it, while the upper plate located on the layer of molding material is made smaller area, and the layer of molding material in the area free from the upper plate is equipped with four elements for connecting the external environment, made in the form of a corner beatings in the layer of molding material associated with the microfluidic system; wherein the microfluidic system is formed by a cell cell made in the form of a through hole in the layer of molding material transversely separated by a porous membrane, and two groups of inlet and outlet microfluidic channels made on the surfaces of the layer of molding material, sealed by the upper and lower plates; the inlet and outlet channels of the first group are made in the form of grooves of a L-shaped form on the lower surface of the layer of molding material, each of which is connected at one end to the cell cell, and the other with a corresponding recess for the external medium to access the cell cell; the inlet and outlet channels of the second group are formed by two rectilinear segments, one of which is located on the lower surface of the molding material layer and connected to the corresponding recess for access of the external environment, and the second segment is located on the upper surface of the molding material layer and connected to the cell cell; the layer of molding material is provided with a recess for connecting the measuring module from one of the end sides of the chip, while each of the plates on the side of the layer of molding material is equipped with two electrodes located in the projection area of the cell cell and two contact pads for connecting to the measuring module located in the region notches and connected to the electrodes.

2. The microfluidic chip according to claim 1, characterized in that the first and second segments of the inlet and outlet channels of the second group are located at right angles to each other and are interconnected through an additional through hole in the layer of molding material.

3. The microfluidic chip according to claim 1, characterized in that the two electrodes of each of the plates are parallel to each other.

4. The microfluidic chip according to claim 1, characterized in that the layer of molding material in the region of the arrangement of elements for connecting the external environment is thickened, while the elements are located symmetrically with respect to the cell cell, two on opposite sides of the chip.

5. The microfluidic chip according to claim 1, characterized in that the elements for connecting the external environment are made in the form of recesses of a cylindrical shape and equipped with constrictions in the lower part to ensure tight contact with the input device of the external environment.

6. The microfluidic chip according to claim 1, characterized in that the inlet and outlet channels are made of rectangular cross-section with a height of 0.5 to 2 mm and a width of 0.2 to 1 mm, while the diameter of the cell cell is from 3 to 6 mm.

7. The microfluidic chip according to claim 1, characterized in that the upper and lower plates are made from 0.16 to 2 mm thick, the layer of molding material located between the plates is made from 1 to 4 mm thick, the layer of molding material in the area of the elements to connect the external environment is made from 5 to 10 mm thick.

8. The microfluidic chip according to claim 1, characterized in that the inlet and outlet channels in the area of connection with the cell cell have a rounded extension with a radius of curvature from 0.5 to 4 mm.

9. The microfluidic chip according to claim 1, characterized in that polydimethylsiloxane is used as the molding material.

10. The microfluidic chip according to claim 1, characterized in that the upper and lower plates are made of glass.

11. The microfluidic chip according to claim 1, characterized in that it is provided with a cover made with the possibility of sealing in the recesses for access of the external environment to the microfluidic system.

12. The microfluidic chip according to claim 1, characterized in that the membrane is made of polyester, polycarbonate or polytetrafluoroethylene, with a diameter of 4.26 ± 0.50 mm to 24 ± 0.5 mm, with a pore diameter of 0.4 to 8, 0 μm and a density of 1 × 10 ⁵ to 1 × 10 ⁸ pores per 1 cm ² .

13. The microfluidic chip according to claim 1, characterized in that a device for measuring the resistance of the cell monolayer is used as a measuring module.

14. The microfluidic chip according to claim 1, characterized in that it is made with overall dimensions not exceeding 35-80 mm × 20-30 mm.