RU1838407C

RU1838407C - Способ получени химопапаина

Info

Publication number: RU1838407C
Application number: SU884355835A
Authority: RU
Inventors: Полгар Ласло; Гаал Йожеф; Вираг Шандор; Йожа Ласло; Визкелети Тибор; Ашбот Бенце; Фейер Эржебет
Original assignee: Хиноин Дьедьсер еш Ведьесети Термекек Дьяра РТ
Priority date: 1988-06-01
Filing date: 1988-06-01
Publication date: 1993-08-30

Abstract

Использование: биотехнологи , может найти применение в клинической практике. Сущность изобретени : сырой химопапаин в присутствии восстановител раствор ют в буферном растворе - фосфатном или ацетатном с рН между 5-7. Прозрачную надоса- дочную жидкостьподвергают хроматографической очистке методом гель- фильтрации на сефадексе G-25 или сефадек- се G-50, содержащие фермент активные фракции собирают и сушат вымораживанием . Получают химопапаин G удельной активностью 51-70 Е.

Description

Изобретение относитс к биотехнологии , в частности к способу получени химо- папаина высокой чистоты с высокой специфической активностью из сырого хи- мопапаина посредством гель-хроматогра- фии.

Цель изобретени - ускорение способа и увеличение удельной активности целевого продукта.

Сущность изобретени заключаетс в том, что сырой химопапаин в присутствии восстановител раствор ют в воде или в буферном растворе, прозрачную надосадоч- ную жидкость раствора подвергают гель-хроматографии, и содержащие активный фермент фракции собирают и подвергают сушке вымораживанием. Сырой химопапаин обычно раствор ют в фосфатном или ацетатном буферном растворе с величиной рН 5-7, который содержит в качестве восстановител цистеин, меркаптоэ- танол или сульфит натри . В качестве хроматографической колонки обычно нахо- дат применение колонка из Сефадекса G-50

или Сефадекса G-25, которую предварительно уравновешивают при помощи буферного раствора или солевого раствора, преимущественно при помощи содержащего цистеин фосфатного буферного раствора. В интересах эффективной хроматографии колонку выбираюттаким образом, чтобы длина относилась к диаметру как 5-50:1, предпочтительно как 20:1.

Замораживание провод т при -20 до - 70°С, предпочтительно при -40°С, лед удал ют в вакууме при давлении между 1,333 Рв и 13,33 Ра, предпочтительно 6,666 Ра, известным образом.

Дающее с хлористым барием осадок, непри тно пахнущее вещество находитс в хроматографическом пике, который следует за активным ферментом.

Способ по изобретению имеет следующее преимущество.

Удаление ответственной за вредные побочные действи , дающей с хлористым барием осадок белковой компоненты путем гель-хроматографии дешевле, м гче и в деел С

00 СлЗ 00

.N О v|

OJ

с ть раз быстрее, чем известные способы. Поэтому способ по изобретению также значительно пригоднее дл осуществлени в крупном промышленном масштабе, чем ионообменна хроматографи . котора продолжаетс около.40 ч. За это продолжительное врем фермент неизбежно повреждаетс . Гбль-хроматографи , напротив , может осуществл тьс в течение А часов и дает возможность защищать фермент химическим путем - физиологически безвредными , ионными восстановител ми. Так как гель-хроматографи имеет более высокую степень разделени , полученный продукт гораздо чище, что - как и следует ожидать - приводит к существенному ослаблению побочных действий.

Способ по сн етс чертежом. Пример 1.2,5 г сырого химопапаина раствор ют в 135 мл содержащего 10 мМ цистеинфосфатного буферного раствора (3 мМ.рИ 6,5). Если раствор мутный, то его фильтруют/Через 10-30 мин хроматографи- руют 135 мл раствора на колонке с Сефадек- сом G-25 (4 х 100 см) с буферным раствором, который содержит 3 ммол фосфата и 1 ммол цистеина и имеет величину рН 6,5,

Первый пик (обозначенный на фиг, 2 при помощи А) содержит химопапаин, около 1,3 г. Пик В содержит образующее с хлористым барием осадок, непри тно пахнущее, неактивное вещество.

Наход щийс в пике А фермент фильтруют в стерильных услови х и подвергают лиофилизации,

Активность химопапаина в любом случае определ ли при насыщении субстратом (сложном бензилоксикарбонилглицин-р- нитрофениловом эфире (ZGN) в следующей реакционной смеси:

100 /1л приготовленного с ацетонитри- лом ZGN-раствора с концентрацией 1 мг/мл,

2,8 мл 0,1 М ацетатного буферного раствора с величиной рН 5,5 который содержит 1 мМ ED Та,

100 fin химопапаина. Дл характеристики препаратов указывают ниже измер емое при 25°С в течение 1 мин при длине волны 340 им изменение оптической плотности (экстинкции). которую вызывает 1 мг химопапаина на 1 мл реакционной смеси (Е).

Полученный фермент имеет активность 62 Е.

Пример 2. Работают по описанному в примере 1 методу, но колонка имеет больший диаметр (5 х 100 см). Удельна активность 70 Е.

П р и м е р 3. Работают по описанному в примере 1 методу, но примен ют короткую колонку (10 х 16 см). Здесь не происходит никакого отделени образующего с хлористым барием осадок вещества от химопапаина . Удельна активность 42 Е.

Пример 4. Работают по описанному в примере 1 методу, но примененный дл хроматографии буферный раствор не содержит цистеина, удельна активность 51 Е.

П р и м е р 5. Работают по описанному в примере 1 методу, но приготовл ют более концентрированный раствор из химопапаина (содержание белка 5% - вес/объем.%).

5 Удельна активность 55 Е.

Пример 6. Работают по описанному в примере 1 методу, но выделение производ т не при комнатной температуре, а при 2-10°С. Удельна активность 65 Е.

0 Пример. Работают по описанному в примере 1 методу, но вместо Сефадекса G-25 примен ют Сефадекс G-50. Удельна активность 53 Е.

П р и мер 8. Работают по описанному

5 в примере 1 методу, но концентраци фосфатного буферного раствора составл ет не 3 мМ, а 10 мМ. Удельна активность 63 Е.

Пример 9. Работают по описанному в примере 1 методу, но вместо фосфатного

0 буферного раствора с рН 6,5 примен ют ацетатный буферный раствор с величиной рН 5,5; Удельна активность 67 Е;

Пример 10. Работают по описанному в примере 1 методу, но буферный раствор

5 содержит не 1 мМ цистеина, а 5 мМ цистеина .. Удельна активность 64 Е.

Пример 11. Работают по описанному в примере 1 методу, но к содержащей активное вещество фракции (пик А) в пересчете

0 на имеющийс белок, добавл ют 10 вес.% цистеина. Удельна активность 63 Е.

Пример 12. Работают по описанному в примере 1 методу, но в качестве восстановител вместо цистеина примен ют сульфит

5 натри . Удельна активность 60 Е,

Пример 13. Работают по описанному в примере 1 методу, но из всех трех хрома- тографических пиков отбирают пробу по 1 мл объемом и к каждой пробе добавл ют 0,2

0 мл-нг сол ной кислоты и 0.2 мл 12%-ного раствора хлористого бари . Осадок образуетс только во фракции В.

П р и м е р 14. Активность примененного в качестве эталона препарата химодиактив5 на R (Smith Laboratories Ins.. США) измер ют указанным в примере 1 методом. Она составл ет 28 Е.

Таким образом, использовани предложенного способа позвол ет быстро отделить с помощью гель фильтрации

ингибирующий компонент (в 10 раз быстрее , чем с помощью ионообменной хрома- то рафии) и получить препарат с более высокой активностью, чем известные (51-70 Е вместо 28).

Claims

Формула изобретени Способ получени химопапаина, предусматривающий растворение неочищенного папаина в буфере, хроматографическую очистку в присутствии восстановител SH-группы и лиофильную сушку, отличающийс тем, что, с целью ускорени способа и увеличени удельной активности целевого продукта, раствор ют химопапаин в фосфатном или ацетатном буфере с рН 5-7, а хроматографическую очистку провод т методом гель-фильтрации на сефадексе G-25 или сефадексе G-50. .